Cyp2d6基因突变检测液相芯片及检测方法

专利名称：：Cyp2d6基因突变检测液相芯片及检测方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及CYP2D6基因突变检测液相芯片及检测方法。
背景技术：
：他莫昔芬(TAM，tamoxifen,又名三苯氧胺)是一种选择性雌激素受体调节剂，其结构与雌激素相似。雌激素进入乳腺癌细胞内后，能与雌激素受体(ER，estrogenreceptor)结合，促进肿瘤细胞的DNA和m_RNA的合成，刺激肿瘤细胞生长。而TAM进入细胞内能与雌激素竞争结合雌激素受体，阻止雌激素作用的发挥，从而抑制乳腺癌细胞的增殖。TAM治疗属于乳腺癌内分泌治疗(endocrinetreatment)的其中一种，而另一种常用的内分泌治疗药物是芳香酶抑制剂类药物(aromataseinhibitors)0但芳香酶抑制剂只适用于绝经后的ER阳性乳腺癌患者，因此此类患者可根据个体情况从TAM或芳香酶抑制剂中选择一种；而对于绝经前的ER阳性乳腺癌患者，TAM仍是辅助治疗的首选。TAM是一种前体药物，在受人体代谢前的药物活性并不强，进入人体经CYP450酶系代谢后会产生两种代谢产物——4-hydroxy-TAM和endoxifen，它们的药物活性(与ER的结合能力)均大幅高于TAM，活性最强的endoxifen甚至是TAM活性的100倍。CYP2D6是TAM代谢生成活性产物的主要限速酶，大量的研究已经证明，接受TAM治疗的患者其血液中活性代谢产物的浓度与患者CYP2D6的基因型以及是否服用抑制CYP2D6活性的药物密切相关。CYP2D6酶活性减弱的患者他们血液中的代谢产物的浓度与正常患者相比显著降低。目前国外已进行了大量针对CYP2D6基因型和TAM治疗效果之间关系的研究，其中大部分研究结果表明，CYP2D6*4纯合子(能导致CYP2D6酶活性的丧失，主要流行于欧美国家)的携带者接受长期的TAM治疗，其无疾病生存期(DFS，diease-freesurvival)和无复发生存期(RFS，relapse-freesurvival)均显著低于CYP2D6野生型纯合子携带者。在亚洲国家，CYP2D6等位基因型分布与欧美国家差异很大，中国主要流行的CYP2D6缺陷型为CYP2D6*10(能导致CYP2D6酶活性的降低，但并非完全丧失)，而CYP2D6*5也占有一定的比例，而CYP2D6*4却低于1%。目前针对中国CYP2D6等位基因型分布与TAM疗效关系的研究主要是XuY对CYP2D6*10的研究报告。XuY得出的结论是CYP2D6*10纯合子同样能降低TAM代谢产物在血液中的浓度，并导致患者DFS的下降。基于以上研究的结论，美国FDA于2006年建议患者在接受TAM治疗前首先对CYP2D6的基因型进行检测，特别是绝经后的ER阳性乳腺癌患者，芳香酶抑制剂并不受CYP2D6的酶活性影响，所以这类患者如果被检测为CYP2D6功能减弱等位基因携带者，接受芳香酶抑制剂治疗会更有效。CYP2D6基因的两种正常基因型为CYP2D6*1和CYP2D6*2，其中CYP2D6*2为C2850T突变。五种国内常见突变基因型为CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因重复突变。CYP2D6*3为A2549del缺失突变，CYP2D6*4为C100T和G1846A共同突变，CYP2D6*5为整个基因缺失突变，CYP2D6*10为C100T突变，此外还有整个基因的重复突变。目前国内外的检测CYP2D6基因突变的产品，如AmershamBioscience(GEhealthcare)的CodeLinkP450，Roche的AmpliChipCYP450Test等，主要建立在传统固相芯片的基础上，价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。而其它以PCR为基础的检测基因突变的技术，如直接测序法，PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测，这些技术存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点。而聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分析技术和基于TaqMan技术的等位基因差异分析法一次只能进行一种突变的检测，耗时费力。液相芯片技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。我们采用液相芯片技术可以同时检测多种基因突变，实现高通量快速简便化操作，大大提高了检测效率，在同类检测技术中处于领先地位。
发明内容本发明的目的之一是提供CYP2D6基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测CYP2D6基因的两种正常基因型CYP2D6*1和CYP2D6*2以及五种国内常见突变基因型CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因重复(GeneDuplication)突变。一种CYP2D6基因突变检测液相芯片，包括有(A).针对CYP2D6C2850T、CYP2D6Deletion的突变位点的ASPE引物每种ASPE引物由3’端的针对目的基因突变位点的特异性引物序列和5’端的tag序列组成，所述特异性引物序列分别为:SEQIDNO.17及SEQIDNO.18、和SEQID20；所述tag序列选自SEQIDNO.1-10中的任3种序列；(B).分别包被有特异的anti-tag序列的3种微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列，上述每种微球具有不同颜色编码；所述anti-tag序列选自SEQIDNO.21SEQIDN0.30中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增具有CYP2D6C2850T、以及CYP2D6Deletion突变位点的CYP2D6基因目标序列的扩增引物。优选地，扩增引物包括有SEQIDNO.37及SEQIDNO.38，和SEQIDNO.41及SEQIDNO.42；更优选地，还包括有可使扩增效果更好的用于巢式PCR的SEQIDNO.31及SEQIDNO.32。优选地，所述(A)中ASPE引物为针对CYP2D6C2850T的野生型和突变型由SEQIDNO.7和SEQIDNO.17组成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDNO.18组成的序列、及针对CYP2D6Deletion的由SEQIDNO.10和SEQIDNO.20组成的序列。优选地，还包括(D)针对CYP2D6C100T、CYP2D6G1846A、CYP2D6A2549del、和/或CYP2D6Dulplicatio突变位点的ASPE引物，每种ASPE引物由3，端的针对目的基因突变位点的特异性引物序列和5’端的tag序列组成，所述特异性引物序列为针对CYP2D6C100T的SEQIDNO.11及SEQIDNO.12；针对CYP2D6G1846A的SEQIDNO.13及SEQIDN0.14；针对CYP2D6A2549del的SEQIDNO.15及SEQIDNO.16、和针对CYP2D6Dulplicatio的由SEQIDNO.9和SEQIDNO.19组成的序列中的一组或多组；所述tag序列选自SEQIDNO.1-10中的序列，该所选tag序列与(A)中所选tag序列不相同；还包括与(D)中ASPE引物对应的包被有特异的anti-tag序列的种微球，所述anti-tag序列与(D)中的所选的对应tag序列互补配对；还包括用于扩增具有CYP2D6C100T、CYP2D6G1846A、CYP2D6A2549del、CYP2D6Dulplication中一个或多个突变位点的CYP2D6基因目标序列的扩增引物，优选地，所述扩增引物为SEQ而.31-32以及针对〔￥206C100T的SEQIDNO.33及SEQIDNO.34、针对CYP2D6G1846A的SEQIDNO.35及SEQIDNO.36、针对CYP2D6A2549del的SEQIDNO.37及SEQIDNO.38、和针对CYP2D6Dulplication的SEQIDNO.39及SEQIDN0.40中的一组或多组。更优选地，所述(D)中，ASPE引物为针对CYP2D6C100T的野生型和突变型由SEQIDNO.1和SEQIDNO.11组成的序列及由SEQIDNO.2和SEQIDNO.12组成的序列、针对CYP2D6G1846A的野生型和突变型由SEQIDNO.3和SEQIDNO.13组成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.14组成的序列、针对CYP2D6A2549del的野生型和突变型由SEQIDN0.5和SEQIDNO.15组成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.16组成的序列、和针对CYP2D6Dulplication由SEQIDNO.9和SEQIDNO.19组成的序列中的一组或多组。本发明的另一目的是提供使用上述液相芯片对CYP2D6基因突变进行检测的方法。一种使用上述液相芯片对CYP2D6基因突变检测的方法，主要包括以下步骤(1)PCR扩增待测样品DNA；(2)PCR扩增产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理；(3)用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；(4)将对应ASPE引物tag序列的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；(5)杂交反应后的产物与链霉亲和素_藻红蛋白进行反应；(6)通过荧光检测仪检测。本发明的主要优点在于1.所述CYP2D6基因突变检测液相芯片可针对CYP2D6C2850T、CYP2D6Dulplication,CYP2D6Deletion的突变位点同时检测，具有非常好的信号-噪声比，与测序法的吻合率高达100%，比同类相关的产品具有更高的特异性和准确率。tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE序列的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检测。2.本发明设计的ASPE特异性引物序列具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型。本发明所设计的各种特异性ASPE引物，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种引物、探针之间基本不存在非特异性结合。3.本发明还可进一步同步对CYP2D6C100T、CYP2D6G1846A、和/或CYP2D6A2549del突变位点进行检测，提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征，从而使检测的灵敏度进一步得到提高，检测结果更加准确可靠。同时，多种ASPE特异性引物的组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。具体实施例方式实施例1CYP2D6基因突变检测液相芯片，主要包括有一、ASPE引物CYP2D6基因的两种正常基因型为CYP2D6*1和CYP2D6*2，其中CYP2D6*2为C2850T突变。五种国内常见突变基因型为CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因重复突变。CYP2D6*3为A2549del缺失突变，CYP2D6*4为C100T和G1846A共同突变，CYP2D6*5为整个基因缺失突变，CYP2D6*10为C100T突变，此外还有整个基因的重复突变。针对CYP2D6基因的两种正常基因型CYP2D6*1和CYP2D6*2以及五种国内常见突变基因型CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因重复突变分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表1ASPE引物序列(Tag+特异性引物序列)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为针对突变型或野生型的特异性序列(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用lOmmol/LTrisBuffer配制成lOOpmol/mL的贮存液。二、anti-tag序列包被的微球根据所设计的ASPE特异性引物序列，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物序列可能形成的二级结构，选择的十种tag序列及其微球上相应的anti-tag序列如表2所示表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>选择的十种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用ddH20配成lOOnmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n彡3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T(使用其它的间隔臂的实验结果依然稳定可靠，具体数据省略)。微球包被的过程如下分别取5X106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul0.lmol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配M10ng/ml白勺EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(_自PierceChemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02%的Tween-20洗涤一次，再用0.1%的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0),lmmol/LEDTA中，2_8°C避光保存。三、扩增出具有突变位点的目标序列的引物CYP2D6基因的两种正常基因型为CYP2D6*1和CYP2D6*2，五种国内常见突变基因型为CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因重复突变。利用Primer5.0设计六对引物(见表3)，使用巢式PCR检测C100T、G1846A、A2549del和C2850T的位点突变，首先通过SEQN0.31-32引物序列扩增出同时含有C100T、G1846A、A2549del和C2850T的片段，进而通过SEQNO.33-SEQNO.38扩增出3条含有突变位点的目标序列，SEQNO.39-SEQNO.42进行多重PCR扩增出2条含有突变位点的目标序列。表3扩增出具有突变位点的目标序列的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例2运用CYP2D6基因突变检测液相芯片对临床样本的检测所述各种溶液的配方如下50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2XTm杂交缓冲液<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>过滤后贮存于4°C。ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。一、样本的DNA提取参照AxyPr印全血基因组小量提取试剂盒说明，得到待检测的DNA。二、待测样品的PCR扩增利用Primer5.0设计六对引物，分两管进行PCR反应，一管为巢式PCR，使用SEQNO.31-32扩增同时含C100T、G1846A、A2549del和C2850T位点的片段，然后分别采用SEQNO.33-34扩增含C100T位点片段，采用SEQNO.35-36扩增含G1846A位点片段，采用SEQNO.37-38扩增含A2549de1和C2850T位点片段，产物大小分别为343bp、257bp、69lbp；另一管为多重PCR—步扩增，如有CYP2D6重复突变，则SEQN0.39-40可扩增到3.2kb片段，否则无扩增产物；如有CYP2D6*5突变，则SEQN0.41-42可扩增到3.5kb片段，否则无扩增产物。引物序列(SEQN0.31-42)见上表3。首先配制巢式PCR引物工作液分别各取SEQN0.31-38的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均勻即为巢式PCR引物工作液。巢式PCR反应体系如下10X缓冲液(含Mg2+)5uldNTP(各2.5mmol/L)4ulTaq酶(5U/ul)0.5ul多重PCR引物工作液(各12.5pmol/mL)8ul模板DNA(10ng/ul)lulddH2031.5ul_共50ulPCR扩增程序为:95°C3min；94°C30s，66°C30s，72°C3.5min,10个循环，94°C30s,56°C30s，72°C45s，25个循环；72°ClOmin；4°C保存备用。配制多重PCR引物工作液分别各取SEQNO.39-42的引物贮存液lOOul于1.5ml微量离心管中，混合均勻即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下10X缓冲液(含Mg2+)5uldNTP(各2.5mmol/L)4ulTaq酶(5U/ul)0.5ul多重PCR引物工作液(各25pmol/mL)4ul模板DNA(10ng/ul)lulddH2035.5ul_共50ulPCR扩增程序为95°C3min；94°C20s,60°C30s,72°C3.5min，30个循环；72°ClOmin；4°C保存备用。三、PCR产物的酶切处理参照ExoSAP-IT试剂盒说明，详细步骤如下1.各取巢式PCR反应产物和多重PCR反应产物3.75ul，混勻，加入3ulExoSAP-IT酶；2.37°C孵育15min。80°C孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。首先配制混合的ASPE引物工作液分别各取C100T-W、C100T-M、G1846A-W、G1846A-M、A2549del-W、A2549del-M、C2850T-W、C2850T-M、Dulplication和Deletion相应的ASPE引物C存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/LTrisBuffer补至200ul，混合均勻即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下10X缓冲液2ulMgCl2(50mmol/L)0.5ulBiotin-dCTP(400umol/L)0.25uldATP、dGTP、dTTP混合液(各lOOumol/L)IulTsp酶(5U/ul)0.25ul混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L)Iul酶切处理的PCR扩增产物5ulddH2010.ul_共20ulPCR程序为96°C2min；94°C30s,58°Clmin，72°C2min，30个循环；4°C保存备用。五、杂交反应1.根据设计的ASPE引物，选择相应的最优的十种微球(微球浓度均为2.5XIO5个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合；2.分别取Iul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；3.微球于≥IOOOOg离心l_2min；4.弃去上清，微球重悬于IOOul的2XTm杂交缓冲液中，涡旋混勻；5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH20；6.取5_25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH20补足至50ul；7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95°C60s,37°C15min孵育杂交；8.杂交后的微球于彡3000g离心2_5min；9.去上清，将微球重悬于75ul的IXTm杂交缓冲液中；10.微球于彡3000g离心2-5min；11将微球重悬于75ul的IXTm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链酶亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；12.37°C孵育15min，于Luminex仪器上检测。六、结果检测与数据分析反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，检测结果如表4和表5所示。对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10XPCR阴性对照MFI；2.NETMFI=样品MFI-PCR阴性对照MFI(NETMFI小于0的以0表示)；3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值突变比值=突变型NETMFI+(突变型NETMFI+野生型NETMFI)4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。使用本方法检测20份样本的CYP2D6基因多态性，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下突变比值范围在0%-20%视为野生型纯合子；30%-70%视为杂合子；80%-100%视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的CYP2D6基因型检测结果与测序结果吻合率达到100%。可见本发明所提供的CYP2D6基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出CYP2D6基因的SNP类型，且结果稳定可靠。表4样本检测结果(MFI)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例3CYP2D6C2850／、CYP2D6Deletion基因突变检测液相芯片对临床样本的检测[Ol28]使用CYP2D6C2850T、CYP2D6Deletion基因突变检测液相芯片对血清样品卜20进行检测，ASPE引物的合成、Anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。表6样本检测结果(MFI)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表7样本CYP2D6C2850T、CYP2D6Deletion基因突变分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>从实施例2和实施例3的结果可见，实施例3中只含有CYP2D6C2850T、CYP2D6Deletion基因突变液相芯片检测结果与实施例2的一致。实施例4不同的ASPE引物的液相芯片对CYP2D6基因突变的检测一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)以CYP2C9基因CYP2D6*2(C2850T)位点突变的检测液相芯片为例，针对C2850T的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQIDNO.I-SEQIDNO.10中的6条，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选择SEQIDN0.21-SEQIDΝ0·30。具体设计如下表(表8)所示。ASPE引物的合成、Anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。表8液相芯片制备的设计<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>二、样品检测采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对血清样品21-40进行检测，检测结果如下表9样本检测结果(MFI)与基因多态性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>其它针对不同的SNP位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。序列表<110>广州益善生物技术有限公司<120>CYP2D6基因突变检测液相芯片及检测方法<160>42<170>PatentInversion3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>1aaacaaacttcacatctcaataat24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2tcaatcataatctcataatccaat24<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>3ttactcaaaatctacactttttca24<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>4aatcatacctttcaatcttttaca24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>5aatcctttttactcaattcaatca24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>6<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7ctatcttcatatttcactat<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>8aatctacaaatccaataatcteat24<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>9ctacaaacaaacaaacattatcaa24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>10cttttcatcttttcatctttcaat24<210>11<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>11cagggggcctggtgg15<210>12<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>12cagggggcctggtga15<210>13<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>13ggcgaaaggggcgtcc16<210>14<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>14ggcgaaaggggcgtct16<210>15<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>15gggtcccaggtcatcct17<210>16<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>16gggtcccaggtcatccg17<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>17cttcaatgatgagaacctgc20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>18cttcaatgatgagaacctgt20<210>19<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>19atggcgtttcatacttat18<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>20gccagcacgttgacacct18<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>21attattgagatgtgaagtttgttt24<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>22attggattatgagattatgattga24<210>23<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>23tgaaaaagtgtagattttgagtaa24<210>24<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>24tgtaaaagattgaaaggtatgatt24<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>25tgattgaattgagtaaaaaggatt24<210>26<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>26gtatgtattgtatgtagttaattg24<210>27<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>27gtttatagtgaaatatgaagatag24<210>28<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>28atgagattattggatttgtagatt24<210>29<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>29ttgataatgtttgtttgtttgtag24<210>30<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>30attgaaagatgaaaagatgaaaag24<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>31ccgaccaggcccctccaccg20<210>32<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>32cggccctgacactccttcttgc22<210>33<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>33gcaggttcactcacagcag19<210>34<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>34cctggtcgaagcagtatgg19<210>35<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>35gctggagcagtgggtgac18<210>36<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>36cctgaggaagcgagggtc18<210>37<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>37tccaggtgaacgcagagc18<210>38<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>38aggaggtcaggcttacagg19<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>39cctcagcctcgtcacctcac20<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>40cacgtgcagggcacctagat20<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>41ccgggcacctgtactcctca20<210>42<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>42catgagctaaggcacccagac2权利要求一种CYP2D6基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有(A).针对CYP2D6C2850T、CYP2D6Deletion的突变位点的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别为SEQIDNO.17及SEQIDNO.18、SEQIDNO.20；所述tag序列选自SEQIDNO.1-10中的任3种序列；(B).分别包被有特异的anti-tag序列的3种微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列，上述每种微球具有不同颜色编码；所述anti-tag序列选自SEQIDNO.21～SEQIDNO.30中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增具有CYP2D6C2850T以及CYP2D6Deletion突变位点的CYP2D6基因目标序列的扩增引物。2.根据权利要求1所述的CYP2D6基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物包括有SEQIDNO.37及SEQIDNO.38，SEQIDNO.41及SEQIDNO.42。3.根据权利要求2所述的CYP2D6基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物还包括有用于巢式PCR的SEQIDNO.31及SEQIDNO.32。4.根据权利要求1所述的CYP2D6基因突变检测液相芯片，其特征是，所述(A)中ASPE引物分别为针对CYP2D6C2850T的野生型和突变型由SEQIDNO.7和SEQIDNO.17组成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDNO.18组成的序列、及针对CYP2D6Deletion的由SEQIDN0.10和SEQIDNO.20组成的序列。5.根据权利要求1所述的CYP2D6基因突变检测液相芯片，其特征是，还包括有(D)针对CYP2D6C100T、CYP2D6G1846A、CYP2D6A2549del、和/或CYP2D6Dulplication突变位点的ASPE引物，每种ASPE引物由3’端的针对目的基因突变位点的特异性引物序列和5’端的tag序列组成，所述特异性引物序列为针对CYP2D6C100T的SEQIDN0.11及SEQIDNO.12、针对CYP2D6G1846A的SEQIDNO.13及SEQIDNO.14、针对CYP2D6A2549del的SEQIDNO.15及SEQIDNO.16、和针对CYP2D6Dulplication的SEQIDN0.19中的一组或多组；所述tag序列选自SEQIDN0.1-10中的序列，该所选tag序列与(A)中所选tag序列不相同；(E)与(D)中ASPE引物对应的包被有特异的anti-tag序列的种微球，所述anti-tag序列与(D)中的所选的对应tag序列互补配对；所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列，上述每种微球具有不同颜色编码；(F):用于扩增具有CYP2D6C100T、CYP2D6G1846A、CYP2D6A2549del、CYP2D6Dulplication中个或多个突变位点的CYP2D6基因目标序列的扩增引物。6.根据权利要求5所述的CYP2D6基因突变检测液相芯片，其特征是，所述(D)中，ASPE引物分别为针对CYP2D6C100T的野生型和突变型由SEQIDNO.1和SEQIDNO.11组成的序列及由SEQIDN0.2和SEQIDN0.12组成的序列、针对CYP2D6G1846A的野生型和突变型由SEQIDN0.3和SEQIDN0.13组成的序列及由SEQIDN0.4和SEQIDN0.14组成的序列、针对CYP2D6A2549del的野生型和突变型由SEQIDN0.5和SEQIDN0.15组成的序列及由SEQIDN0.6和SEQIDN0.16组成的序列、和针对CYP2D6Dulplication由SEQIDN0.9和SEQIDN0.19组成的序列中的一组或多组。7.根据权利要求5所述的CYP2D6基因突变检测液相芯片，其特征是，所述(F)中扩增引物，包括SEQNO.31和SEQNO.32、以及针对CYP2D6ClOOT的SEQIDNO.33及SEQIDNO.34、针对CYP2D6G1846A的SEQIDNO.35及SEQIDNO.36、针对CYP2D6A2549del的SEQIDNO.37及SEQIDNO.38、和针对CYP2D6Dulplication的SEQIDNO.39及SEQIDNO.40中的一组或多组。8.根据权利要求1-7任一项所述的CYP2D6基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。9.一种CYP2D6基因突变检测的方法，其特征是，使用权利要求1-8任一项所述液相芯片，主要包括以下步骤(1)PCR扩增待测样品DNA;(2)PCR扩增产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理；(3)用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；(4)将对应ASPE引物tag序列的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；(5)杂交反应后的产物与链霉亲和素_藻红蛋白进行反应；(6)通过荧光检测仪检测。全文摘要本发明提供了一种CYP2D6基因突变检测液相芯片，包括有针对CYP2D6C2850T、CYP2D6Deletion的突变位点的ASPE引物；分别包被有特异的anti-tag序列的3种微球；针对CYP2D6C2850T和CYP2D6Deletion突变位点的扩增引物。所述CYP2D6基因突变检测液相芯片可针对CYP2D6C2850T、CYP2D6Deletion的突变位点同时检测，具有非常好的信号-噪声比，与测序法的吻合率高达100％，比同类相关的产品具有更高的特异性和准确率。文档编号C12Q1/68GK101824467SQ200910214370公开日2010年9月8日申请日期2009年12月29日优先权日2009年12月29日发明者何嘉英,曾涛,朱泽尧,李国强,许嘉森申请人:广州益善生物技术有限公司