专利名称：一种细胞培养方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种细胞培养方法。
背景技术：
目前细胞培养常见的是采用流化床生物反应器或者固定床生物反应器进行培养。 固定床生物反应器是在反应器中装配固定的容器，中间装填载体，载体通常是直径2-6mm 实体或多孔球或片状纤维。培养液循环通过固定床，依靠搅拌中产生的负压，使培养基不断 流经填料，以进行营养成分和氧的传递。刚接种的细胞生长在载体的表面，随着细胞增殖， 细胞开始充满载体间的空隙。固定床生物反应器培养灌流速度较大，细胞在载体中高密度生长，可减少无血清 培养时的蛋白用量，适用于增殖悬浮细胞。固定床培养方式，可以进行连续性培养，细胞培 养密度高，且无机械损害，但是，由于采用上下两块板紧压载体，使得细胞的代谢产物及死 细胞很难排出，而且由于培养载体堆积在一起，培养液不均勻的流动，造成沟流现象，导致 营养分布不均勻，细胞的生长速度不一致。所述连续培养就是连续往培养罐里供给养分如 营养液，同时输出上清液，从而实现连续培养。流化床生物反应器是通过培养液的上升运动，使载体在罐内翻动，使细胞在悬浮 状态生长。培养过程中新鲜培养液不断加入，而培养产物或代谢产物不断被提取。利用流 化床生物反应器进行细胞培养，培养液的流动性好，细胞的生长条件均质，细胞一致性好， 但随着细胞的增多，搅拌的悬浮态变差，放大效应小，现有流化床的床层深度为an左右，反 应器放大一般采用增大横截面积，最大规模仅为1M3，难以满足大规模工业生产的需求，培 养过程细胞和载体易于冲出，提取的上清液残存的细胞和载体较多，需要进一步分离处理 步骤。
发明内容
本发明针对利用现有流化床生物反应器进行细胞培养容易使细胞和载体冲出，提 取的上清液残存的细胞和载体较多，且放大效应受限的缺陷，提供一种细胞培养方法。为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案—种细胞培养方法，包括流化床生物反应器的罐体内填充载体，添加培养液，接 种细胞步骤，还包含步骤1 在罐体内低于所述培养液的液面设置孔状材料的上固定板；步骤2 在搅拌装置的转速使培养液流速低于载体的冲出点的状态下培养细胞；步骤3 增加搅拌装置的转速，使载体在培养液中处于悬浮状态；步骤4 暂停搅拌，使载体沉降。优选地，步骤2、步骤3与步骤4循环运行。利用本发明所述方法进行细胞培养时，流体经导流管形成旋流向下流动，再形成 旋流在导流管外向上流动。步骤2当搅拌装置的转速使培养液流速低于载体的冲出点时，载体沉降下来，形成类似固定床培养的培养方式，但是可观察到载体微小的晃动，这种状态 有助于均勻培养液，比现有的固定床培养方式优越；步骤3增加搅拌装置的转速，使培养液向上流的速度高于载体的沉降速度时，载 体处于悬浮状态，形成类似与流化床培养的培养方式，使罐体内细胞的营养物质、代谢产物 均质化。优选转速是载体悬浮而细胞不受剪切力损伤，同时，由于上固定板的阻隔，将载体 与细胞限制于上固定板之间，使得上清液的提取更为方便。步骤4停止搅拌，以使载体充分沉降。优选的，步骤1所述上固定板的边缘与罐体内壁连接，中间有导流管穿过。优选的，步骤2所述培养时间长于步骤3所述培养时间。优选的，步骤2所述转速为50-100rpm/min。优选的，步骤3所述转速为150-800rpm/min。优选的，步骤3所述培养时间为1-3分钟。优选的，步骤4所述暂停时间为0. 5-1分钟。本发明所述方法可实现高密度细胞培养，细胞密度可达107ml以上，适合贴壁细 胞和悬浮细胞培养，适合于各种培养系统；本发明所述方法还可以进行长时间连续流培养。
具体实施例方式为进一步理解本发明，下面结合实施例对上述的技术方案做进一步的阐述和说 明。实施例1 利用本发明所述方法进行Vero细胞的大量培养在流化床生物反应器(上海日泰IOL型)加入片状聚酯载体，同时加入磷酸缓冲 液(pH7.2)，123°C高压消毒60分钟，自然冷却过夜。第2天排空罐内磷酸缓冲液，加入含 10%胎牛血清的DMEM培养基，接种Vero细胞，接种后罐内细胞密度达hl05/ml，开始细胞培养。设定反应器细胞培养条件为温度37°C，pH 7. 2，DO 50%进行细胞培养，流体由下 而上通过流化床，经导流管管形成旋流向下流动。启动搅拌装置，设定转速为80转/分，在 该转速下，流体速度低于冲出点，形成类似固定床的培养方式，但是可观察到载体微小的晃 动，这种晃动有助于均勻培养液，在此状态培养1小时。改变搅拌装置的搅拌速度为280转/分，流体向上运动速度改变，载体处于悬浮状 态，形成流化床培养，在此状态培养2分钟。再将搅拌装置转速调至80转/分，培养1小时； 再在搅拌装置转速调至80转/分，培养2分钟，周而复始。以上循环程序可通过计算机设 置。每天观察细胞生长形态，进行细胞采样计算细胞密度。接种后第2天开始连续灌流，每日灌注新鲜培养基7-21L，较佳的方案是逐日增加 新鲜培养基量，以达到充分补充营养物质的目的。所谓的连续灌流就是可以连续往培养罐 里供给养分如气体，营养液，同时输出上清液，即上固定板上方的液体，由于上固定板的阻 隔，片状纤维载体不会跑出来，使得上清液的提取很方便，实现连续培养。细胞培养密度计算结果如下第1天ljxl06/ml，第2天3jxl06/ml，第3天 8. 4xl06/ml，第 4 天 17. 2xl06/ml.，第 5 天 32. 9xl06/ml，第 6 天 50. 3xl06/ml。实施例2 利用本发明所述方法进行中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)的大量培养
在IOL流化床生物反应器中加入300克国产片状聚酯载体，同时加入8L磷酸缓冲 液(pH7.2)，123°C高压消毒60分钟，自然冷却过夜。第2天排空罐内磷酸缓冲液，加入含 10%胎牛血清的DMEM培养基，接种CHO细胞，接种后罐内细胞密度达hl05/ml，开始细胞培养。设定反应器细胞培养条件为温度37°C，pH 7. 2，DO 50%进行细胞培养，流体由下 而上通过流化床，经导流管管形成旋流向下流动。启动搅拌装置，设定转速为80转/分，在 该转速下，流体速度低于冲出点，形成类似固定床的培养方式，但是可观察到载体微小的晃 动，这种晃动有助于均勻培养液，在此状态培养1小时。改变搅拌装置的搅拌速度为280转/分，流体向上运动速度改变，载体处于悬浮状 态，形成流化床培养，在此状态培养2分钟。再将搅拌装置转速调至80转/分，培养1小时； 再在搅拌装置转速调至80转/分，培养2分钟，周而复始。以上循环程序可通过计算机设 置。每天观察细胞生长形态，进行细胞采样计算细胞密度。接种后第2天开始连续灌流，每日灌注新鲜培养基7-21L，以达到充分补充营养物 质的目的。所谓的连续灌流就是可以连续往培养罐里供给养分如气体，营养液，同时输出上 清液，即上固定板上方的液体，由于上固定板的阻隔，片状纤维载体不会跑出来，使得上清 液的提取很方便，实现连续培养。细胞培养密度计算结果如下第1天ljxl06/ml，第2天3jxl06/ml，第3天 8. 4xl06/ml，第 4 天 17. 2xl06/ml.，第 5 天 32. 9xl06/ml，第 6 天 50. 3xl06/ml。实施例3 利用本发明所述方法进行293细胞的大量培养在IOL流化床生物反应器中加入300克国产片状聚酯载体，同时加入8L磷酸缓冲 液(pH7. 2)，123°C高压消毒60分钟，自然冷却过夜。第2天排空罐内磷酸缓冲液，加入高糖 的DMEM培养基，接种293细胞，接种后罐内细胞密度达hl05/ml，开始细胞培养。设定反应器细胞培养条件为温度37°C，pH 7. 2，DO 50%进行细胞培养，流体由下 而上通过流化床，经导流管管形成旋流向下流动。启动搅拌装置，设定转速为80转/分，在 该转速下，流体速度低于冲出点，形成类似固定床的培养方式，但是可观察到载体微小的晃 动，这种晃动有助于均勻培养液，在此状态培养1小时。改变搅拌装置的搅拌速度为280转/分，流体向上运动速度改变，载体处于悬浮状 态，形成流化床培养，在此状态培养2分钟。再将搅拌装置转速调至80转/分，培养1小时； 再在搅拌装置转速调至80转/分，培养2分钟，周而复始。以上循环程序可通过计算机设 置。每天观察细胞生长形态，进行细胞采样计算细胞密度。接种后第2天开始连续灌流，每日灌注新鲜培养基7-21L，以达到充分补充营养物 质的目的。所谓的连续灌流就是可以连续往培养罐里供给养分如气体，营养液，同时输出上 清液，即上固定板上方的液体，由于上固定板的阻隔，片状纤维载体不会跑出来，使得上清 液的提取很方便，实现连续培养。细胞培养密度计算结果如下第1天ljxl06/ml，第2天3jxl06/ml，第3天 8. 4xl06/ml，第 4 天 17. 2xl06/ml.，第 5 天 32. 9xl06/ml，第 6 天 50. 3xl06/ml。利用本发明所述方法进行细胞培养，可改善细胞生长良好的外部营养环境，细胞 活力高，放大潜能好，可实现高密度培养细胞及连续灌流培养的目的。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
权利要求
1.一种细胞培养方法，包括流化床生物反应器的罐体内填充载体，添加培养液，接种 细胞步骤，其特征在于，还包含步骤1 在罐体内低于所述培养液的液面设置多孔材料的上固定板； 步骤2 在搅拌装置的转速使培养液流速低于载体的冲出点的状态下培养细胞； 步骤3 增加搅拌装置的转速，使载体在培养液中处于悬浮状态； 步骤4:暂停搅拌，使载体沉降。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2、步骤3与步骤4循环运行。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1所述上固定板的边缘与罐体内壁连 接，中间有导流管穿过。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述培养时间长于步骤3所述培养 时间。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述转速为50-100rpm/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3所述转速为150-800rpm/min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3所述培养时间为1-3分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4所述暂停时间为0.5-1分钟。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一种细胞培养方法。本发明所述细胞培养方法可使流化床生物反应器罐体内细胞的营养物质、代谢产物均质化，细胞密度可以达到107/ml以上，可以实现连续培养，且不受条件限制，放大潜能好，具有良好的工业应用前景。
文档编号C12N5/071GK102108342SQ20091024736
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者郑振彬, 陈光南 申请人:上海日泰医药设备工程有限公司