专利名称：制备l-塔格糖的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的制备方法，具体涉及一种制备L-塔格糖的 方法。
背景技术：
塔格糖属于一种稀有六碳糖，分为D-塔格糖以及L-塔格糖，它们虽然在自然界 存在，但量非常稀少，其中L-塔格糖的量更是非常稀少。D-塔格糖作为一种低热量的安 全糖早在2001年就被美国FDA批准使用，而且无量的限制，其作为预防糖尿病的临床药 物也已经进入临床III期试验阶段。 经对现有技术的文献检索发现，目前合成D-塔格糖的主要方法有以金属氢氧 化物或者铝酸钠作为催化剂来异构化D-半乳糖生成D-塔格糖(美国专利US5002612,公 开日1991.3.26;中国专利CN200610123316.5,
公开日2007.6.27;化学世界，2009 年第三期187 188页)；以L-阿拉伯糖异构酶作为催化剂来异构D-半乳糖生成D-塔 格糖(美国专利US6933138B2，
公开日2005.8.23;美国专利US2008/0124770 Al，公开 日2008.5.29;中国专利CN200810037303.5,
公开日2008.9.17; LeeDong-Woo等， ApplEnviron Microbiol, 2004， volJO， No.3， 1397 1404)，以微生物细胞发酵生成 D-塔格糖(中国专利CN200610085922.2,
公开日2006.5.26)。 近年来，生物化学工业以及糖化学科学发展迅速，越来越多的稀有糖被用来合 成其它药物的中间体或者前体，这就要求能够廉价的合成各种稀有糖，包括L-塔格糖。 L-塔格糖能用来作为合成一些药物的前体，比如合成l-deoxy-l-(indol-3-yl)-L-tagatose及 其类似物(Carbohydr Res， 2003， 338: 143-152)、 l-(l-Butylinol-3-yl)-l-deoxy-L-tagatose 及其类似物(NucleosidesNucleotidesNucleicAcids， 2004， 23: 281 289)。 然而L-塔格 糖的大量廉价制备目前还没有切实可行的办法，极大的限制了L-塔格糖的开发使用。因 此，迫切需要开发一种高效廉价的L-塔格糖的制备方法，以满足生物化学工业以及糖化 学工业对L-塔格糖的使用。 L-塔格糖与L-半乳糖为差向异构体，L-半乳糖可以经过异构化后转变为L-塔 格糖。美国专利US5002612(
公开日1991.3.26)发明了一种由L-半乳糖以氢氧化钙以及 氯化钙作为催化剂异构生成L-塔格糖的方法。该方法在25ml反应瓶中加入0.5gL-半乳 糖，5ml水，然后将0.2g氢氧化钙以及22mg醋酸钙加入该反应器中，反应一定时间(比 如2小时)，形成L-塔格糖与氢氧化钙的粘稠复合物，过滤除去不溶物，通入二氧化碳 使形成碳酸钙沉淀，L-塔格糖则从该粘稠复合物中游离到溶液中，再经过离子交换脱除 盐离子等净化过程，得到0.22克L-塔格糖，转化率为44%。该方法所采用的原料L-半 乳糖本身也为一种稀有糖，来源很有限，价格也很昂贵。其次采用金属氢氧化物来异构 化L-半乳糖得率也较低，还产生一定量的除L-塔格糖以外的其它未知产物，而且其后续 分离纯化过程也较为复杂。由于反应液中含有大量的盐离子，在纯化的过程需要将盐离 子脱除，会产生大量的废水。因此采用该方法生产的L-塔格糖也将非常昂贵，难以被接受，使得L-塔格糖的推广应用受到极大的限制。 美国专利US5811271(
公开日1998.9.22)发明了一种采用酶的转化方法来制备L塔格糖。该方法采用微生物来源的D-己酮糖异构酶使L-山梨糖异构化来制备L-塔格糖。该方法首先培养微生物细胞(Pseudomonas cichorii ST-24),再将D-己酮糖异构酶从细胞中提取，然后固定化酶来转化4%的！^-山梨糖水溶液，在45t:转化90h，转化率为20%。再通过钙型树脂层析将L-塔格糖与未转化的L山梨糖分开。该方法所使用的原料L-山梨糖本身也是一种稀有糖，来源也很有限，价格也很昂贵。加上其转化率也较低，只有20%。而且首先需要制备固定化酶，这本身就是一个很昂贵的过程。酶转化后还需要经过树脂层析将产物分离。这些昂贵的原料以及过程决定了由此制备的产物L-塔格糖也将非常昂贵。 D-半乳糖醇是木糖醇制备过程中的一种副产物，在净化木糖醇的过程中必须将D-半乳糖醇去除。因此在制备木糖醇的过程中会得到大量的D-半乳糖醇。D-半乳糖醇的第五位碳羟基被氧化为酮基即成为L-塔格糖。因此利用廉价的D-半乳糖醇来制备L-塔格糖是一种非常可行的方法。日本香川大学的Tsuyoshi Shimonishi等人(Journal of Fermentation and Bioengineering， 1995， vol.79， No.6， 620 622)利用克雷伯肺炎球菌(Klebsiella pneumoniae strain 40b)转化D-半乳糖醇生成了 L-塔格糖，但需要添加1% (质量百分比)的甘油才能达到60%以上的转化率。而且初始D-半乳糖醇的浓度较低，最高为2.0%，溶液浓度稀增加了后续分离的成本。而且所使用的菌株为致病微生物肺炎球菌，大大限制了其在实际生产中的使用。德国的AlexanderHuwig等人(CarbohydrateResearch， 1998， vol.305， 337 339)利用来自红细菌(Rhodobactersphaeroides D)的半乳糖醇脱氢酶来转化半乳糖醇为L-塔格糖。首先培养红细菌Rhodobacter sphaeroides D，破碎细胞得到含有半乳糖醇脱氢酶的酶液，再将酶液与半乳糖醇反应，转化生成L-塔格糖。虽然总的转化率可以达到78%，但是该过程需要制备酶液，酶反应需要辅酶NAD，该辅酶需要进行再生才能使反应不断地进行下去。该方法通过乳酸脱氢酶来实现辅酶NAD的再生，使得该再生过程很昂贵。需要制备酶液以及辅酶需要再生使得通过该方法制备L-塔格糖变得不现实。最近日本香川大学的Devendar Rao等人(Journal of Bioscience and Bioengineering, 2008， vol. 106， No.5， 473 480)以L-比洛酮糖(L-psicose)为底物，采用一种肠细菌(Enterobacter aerogenes 230S)来转化L-比洛酮糖为L-塔格糖。首先将L-比洛酮糖在细胞微氧的条件下还原为L-talitol， L-talitol再在细胞好氧的条件下氧化为L-塔格糖。该方法所采用的原料L-比洛酮糖本身也为一种很稀少的稀有糖，价格昂贵，而且还要依次经过还原与氧化的过程，同样存在辅酶因子的再生问题。使得采用该方法来制备L-塔格糖变得不现实。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备L-塔格糖的方法。本发
明的方法绿色安全、转化效率高，适合用来制备医药级的L-塔格糖。 本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明包括如下步骤 步骤一，制备培养产酸细菌的培养基，培养基的成分为IL培养基由以下组分
组成D-卫矛醇2 20克，多元醇1 10克，葡萄糖5 50克，酵母粉10克，无水硫酸镁0.5克，碳酸钙10克，余量为水； 步骤二，将产酸细菌接种在步骤一所得培养基上，25 35t:振荡培养，得一级种子液； 步骤三，将一级种子液接种到步骤一所得培养基中，25 35t:振荡培养，得二级种子液； 步骤四，将二级种子液按照体积比为5 20%的接种量接种到发酵培养基中，培养，离心，得到发酵液； 所述发酵培养基的成分为，1L发酵培养基由以下组分组成D-卫矛醇10 100克，多元醇1 10克，葡萄糖5 50克，酵母粉5 50克，硫酸镁0.5克，磷酸氢二钾2克，余量为水； 步骤五，制备用来培养酵母的培养基，培养基成分为1L培养基由以下组分组成葡萄糖15克，酵母粉10克，无水硫酸镁0.5克，余量为水； 步骤六，将酵母接种在步骤五所得培养基中，25 35t:振荡培养，得到酵母一级种子液； 步骤七，将酵母一级种子液接种到步骤五所得培养基中，25 35t:振荡培养，得到二级酵母种子液，离心，得酵母细胞； 步骤八，将酵母细胞接种到步骤四所得发酵液中，25 35t:振荡培养5 40小时，离心，得澄清的发酵液； 步骤九，将步骤八所得发酵液浓縮至原体积的1/10，加入质量百分比为2%的粉末性活性炭，8(TC下，100rpm条件下脱色120分钟，过直径为0.22 0.45微米的微孔滤膜，得溶液； 步骤十，将步骤九所得溶液依次经过D001阳离子交换树脂和D201阴离子交换树脂，直至电导率《20iis/cm，再浓縮到折光率为> 60%，加入2 8倍体积的无水乙醇，混匀，4 3(TC下结晶20 30小时，离心，得晶体，加入2倍质量的体积百分比为95%的乙醇洗涤2 3次，干燥，即得L-塔格糖。 步骤一和步骤四中，所述多元醇为甘油、赤藓糖醇、木糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、山梨醇和甘露醇中的一种或几种的混合。步骤二中，所述产酸细菌为醋酸杆菌属(Acetobacter)、氧化葡萄糖杆菌属
(Gluconobacter)或者葡糖酸杆菌属(Gluconacetobacter)中的任一细菌。步骤二中，所述产酸细菌为弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter suboxydans)、汉逊醋酸
木干菌(Acetobacter hansenii)或者巴氏醋酸木干菌(Acetobacter pasteurianus)。 步骤二中，所述产酸细菌为弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter suboxydans)。 步骤二中，所述产酸细菌为氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)、弱氧化葡糖
杆菌(Gluconobacter suboxydans)或者Gluconobacter frateurii。步骤二中，所述产酸细菌为汉逊葡糖醋酸杆菌(Gluconacetobacterhansenii)。
步骤六中，所述酵母为假丝酵母CGMCC N0 : 3268。 本发明还涉及一种制备L-塔格糖的方法，该方法是采用静息细胞来转化D-卫矛醇同时制备L塔格糖，包括如下步骤 步骤一，制备培养基，培养基的成分为1L培养基由以下组分组成，D-卫矛醇5克，山梨醇5克，葡萄糖20克，酵母粉15克，硫酸镁0.5克，磷酸氢二钾2克，碳酸钙5克，余量为水；将醋酸杆菌属(Acetobacter)、氧化葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)或者葡糖酸杆菌属(Gluconacetobacter)中的任一细菌接种于培养基中，培养；
步骤二，培养结束后，离心，得菌体细胞，悬浮菌体细胞，25 35°C、 100 300rpm下转化24 96小时，得溶液； 所述悬浮使用的溶液为，溶液的组分为1% 10X的D-卫矛醇，0.1 0.5%酵母粉，余量为水，所述百分数为质量分数；步骤三，将假丝酵母(Candida ssp.)CGMCC NO : 3268接入步骤二所得溶液中，25 35。C培养10 48小时，得发酵液； 步骤四，将步骤三所得发酵液依次经过脱色和脱盐处理，得到澄清水溶液，将水溶液浓縮到折光率>60%，加入2 8倍体积的无水乙醇，混匀，4 3(TC下结晶20 30小时，离心， 得晶体，加2倍质量的体积百分比为95%的乙醇洗涤2 3次，干燥晶体，即得L-塔格糖。 本发明所采用的产酸细菌均为公认安全的微生物，均已公开，属于现有技术，
在中国普通微生物保藏中心或者中国工业微生物保藏中心均能购买到。 本发明中所采用的酵母已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保
藏，该菌株的名称假丝酵母(Candida ssp.)，保藏号CGMCC NO : 3268，保藏单位
中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期是2009年9月11曰。 该酵母菌株为细胞卵圆形或长卵圆形，出芽生殖，单个细胞或者2 4个细胞连在一串。菌落圆形，边缘锯齿状，白色或灰白色，表面干燥稍凸起；能在含有葡萄糖，半乳糖、木糖，木糖醇，山梨醇，甘露醇，D-半乳糖醇，L-阿拉伯糖醇，D-阿拉伯糖醇作为唯一碳源的基本培养基上良好生长。能利用D-塔格糖以及L塔格糖。对其用EMS以及NTG进行多次化学诱变，丧失利用L-塔格糖的能力。 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明的方法能从D-卫矛醇高效制备L-塔格糖，具有绿色安全、转化效率高的优点，适合用来制备医药级L-塔格糖。
图1为采用弱氧化醋酸杆菌在含1% D-半乳糖醇的发酵培养基中发酵24小时的HPLC图谱； 图2为采用弱氧化醋酸杆菌在含4% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化48小时的HPLC图谱； 图3采用弱氧化醋酸杆菌在含8% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化48小时的HPLC图谱； 图4为采用氧化葡糖杆菌在含4% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化48小时的HPLC图谱； 图5为采用巴氏醋酸杆菌杆菌在含3% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化48小时的HPLC图谱；
图6为为采用弱氧化醋酸杆菌在含4% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化48小
时后再采用假丝酵母(Candida ssp.)CGMCC NO : 3268发酵10小时的HPLC图谱； 图7为采用氧化葡糖杆菌在含4% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化48小时后
再采用假丝酵母(Candida ssp.)CGMCC NO : 3268发酵10小时的HPLC图谱； 图8为采用巴氏醋酸杆菌在含3% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化48小时后
再采用假丝酵母(Candida ssp.)CGMCC NO : 3268发酵10小时的HPLC图谱； 图9为结晶的L-塔格糖的HPLC图谱。
具体实施例方式以下对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进 行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下 列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1 采用弱氧化醋酸杆菌在含1% D-半乳糖醇的发酵培养基中培养将弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter suboxydans)在种子培养基中于30°C 、 250rpm培
养48小时得到种子菌液。每升种子培养基含D-半乳糖醇(也称卫矛醇或甜醇)2克；
山梨醇5克；葡萄糖10克；酵母粉10克；磷酸氢二钾2克；碳酸f丐5克，用水补加到1
升，pH6.0。再将该种子液10ml接种到90ml的发酵培养基中，在32"C， 300rpm培养24
小时。每升发酵培养基的成分含D-半乳糖醇10克；山梨醇l克；葡萄糖10克；酵母
粉10克；磷酸氢二钾2克；碳酸f丐5克，用水补加到1升，pH6.0。培养结束后HPLC 分析转化率以及塔格糖的含量，结果如图l，经积分计算，D-塔格糖与L-塔格糖的含量 分别为1.16g/L与3.73g/L，残留的D-卫矛醇为5.22g/L，由D-卫矛醇转化为L-塔格糖与 D-塔格糖的总转化率为48.36%，产率为0.204g/L h。
实施例2 采用弱氧化醋酸杆菌在含4% D-半乳糖醇的发酵培养基中培养
将弱氧化醋酸杆菌在种子培养基中于30°C 、 250rpm培养48小时得到种子菌液。 每升种子培养基含D-半乳糖醇4克；甘油2克；葡萄糖10克；酵母粉10克；磷酸氢 二钾2克；碳酸钙10克，用水补加到1升，pH6.0。再将该种子液10ml接种到90ml的 发酵培养基中，在32t:， 300rpm培养24小时。每升发酵培养基的成分含D-半乳糖醇
40克；山梨醇2克；葡萄糖10克；酵母粉10克；磷酸氢二钾2克；碳酸f丐5克，用水
补加到l升，pH6.0。培养结束后HPLC分析转化率以及塔格糖的含量，经积分计算， L-塔格糖与D-塔格糖的含量分别为4.46g/L与2.73g/L，残留的D-卫矛醇为30.34g/L，由 D-卫矛醇转化为L-塔格糖的转化率为11.15%，产率为0.093g/L h。
实施例3 采用弱氧化醋酸杆菌在含10% D-半乳糖醇的发酵培养基中培养
将弱氧化醋酸杆菌在种子培养基中于25t:、 250rpm培养48小时得到种子菌液。 每升种子培养基含D-半乳糖醇4克；木糖醇2克；葡萄糖10克；酵母粉10克；磷酸 氢二钾2克；碳酸钙10克，用水补加到1升，pH6.0。再将该种子液10ml接种到90ml 的发酵培养基中，在32t:， 300rpm培养48小时。每升发酵培养基的成分含D-半乳糖醇100克；木糖醇5克；葡萄糖10克；酵母粉10克；磷酸氢二钾2克；碳酸*丐5克，
用水补加到l升，pH6.0。培养结束后HPLC分析转化率以及塔格糖的含量，经积分计 算，L-塔格糖与D-塔格糖的含量分别为26.46g/L与6.73g/L，残留的D-卫矛醇为60.51g/ L，由D-卫矛醇转化为L-塔格糖的转化率为26.46%，产率为0.551g/L h。
实施例4 采用弱氧化醋酸杆菌在含4% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化
将弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter suboxydans)在种子培养基中于30°C 、 250rpm培 养48小时得到种子菌液，种子培养基成分同实施例1。培养结束后离心弃上清得到菌 体，加入20ml 4% D-卫矛醇水溶液，菌体密度OD600在10。
30°C 、 300rpm培养48h， 检测塔格糖的转化率以及含量。结果如图2，经积分计算，L-塔格糖与D-塔格糖的含量 分别为7.68g/L、 5.68g/L，残留的D-卫矛醇为23.58g/L，由D-卫矛醇转化为L-塔格糖的 总转化率为37.8%，产率为0.30g/L h。
实施例5 采用弱氧化醋酸杆菌在含8% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化
将弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter suboxydans)在种子培养基中于30°C 、 250rpm培 养48小时得到种子菌液。种子培养基成分同实施例1。培养结束后离心弃上清得到菌 体，加入20ml8XD-卫矛醇水溶液，菌体密度OD600在10。在30。C、 300rpm培养48h， 检测塔格糖的转化率以及含量。结果如图3，经积分计算，L-塔格糖与D-塔格糖的含量 分别为23.58g/L与14.36g/L，残留的D-卫矛醇为46.14g/L，由D-卫矛醇转化为塔格糖的 总转化率为36.7%，产率为0.56g/L -h。
实施例6 采用氧化葡糖杆菌在含4% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化
将氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)在种子培养基中于30°C 、 250rpm培养 48小时得到种子菌液。种子培养基成分同实施例l。培养结束后离心弃上清得到菌体， 加入20ml4% D-卫矛醇水溶液，菌体密度OD600在10。
在30°C 、 300rpm培养48h，检 测塔格糖的转化率以及含量。结果如图4，经积分计算，L-塔格糖与D-塔格糖的含量分 别为5.72g/L与1.85g/L，残留的D-卫矛醇为33.94g/L，由D-卫矛醇转化为塔格糖的总转 化率为18.9%，产率为0.16g/L'h。
实施例7 采用巴氏醋酸杆菌杆菌在含4% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化
将巴氏醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus)在种子培养基中于30°C 、 250rpm培养 48小时得到种子菌液。种子培养基成分同实施例l。培养结束后离心弃上清得到菌体， 加入20ml3X D-卫矛醇水溶液，菌体密度OD600在10。在30。C、 300rpm培养48h，检 测塔格糖的转化率以及含量。结果如图5，经积分计算，D-塔格糖与L-塔格糖的含量分 别为1.41g/L与3.18g/L，残留的D-卫矛醇为25.5g/L，由D-卫矛醇转化为塔格糖的总转 化率为15.3%，产率为0.094g/L h。
实施例8 采用弱氧化醋酸杆菌在含4% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化48小时后再采 用假丝假丝酵母(Candida ssp.)CGMCC NO : 3268发酵
弱氧化醋酸杆菌在含4XD-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化的实施同实施例4。 然后在转化液中按照体积比为10X接入假丝酵母(Candidassp.)CGMCCNO : 3268以及加 入质量百分比为0.5%的酵母粉(除菌)，在32t:继续培养10小时。离心分离菌体，得到 澄清的含L-塔格糖的上清液。HPLC分析该澄清上清，结果如图6，由图6可见，假丝 酵母(Candida ssp.)CGMCC NO : 3268已经将全部D-塔格糖以及绝大部分残留的D-半乳 糖醇消耗完全，L-塔格糖的纯度达到90X以上。
实施例9 采用弱氧化醋酸杆菌在含10% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化48小时后再 采用假丝假丝酵母(Candida ssp.)CGMCC NO : 3268发酵 弱氧化醋酸杆菌在含10% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化的实施同实施例 4。 然后在转化液中按照体积比为20%接入假丝酵母(Candidassp.)CGMCC NO : 3268 以及加入质量百分比为0.5%的酵母粉(除菌)，在35t:继续培养20小时。离心分离菌 体，得到澄清的含L塔格糖的上清液。HPLC分析该澄清上清，假丝酵母(Candida ssp.) CGMCC NO : 3268已经将全部D-塔格糖以及绝大部分残留的D-半乳糖醇消耗完全， L-塔格糖的纯度达到90%以上。
实施例10 采用氧化葡糖杆菌在含10% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化60小时后再采 用假丝假丝酵母(Candida ssp.)CGMCC NO : 3268发酵 氧化葡糖杆菌在含10% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化的实施同实施例4。 然后在转化液中按照体积比为10%接入假丝酵母(Candida ssp.)CGMCC NO : 3268以及加 入质量百分比为0.5%的酵母粉(除菌)，在32t:继续培养24小时。离心分离菌体，得到 澄清的含L-塔格糖的上清液。HPLC分析该澄清上清，假丝酵母(Candida ssp.)CGMCC NO: 3268已经将全部D-塔格糖以及绝大部分残留的D-半乳糖醇消耗完全，L-塔格糖的 纯度达到90%以上。
实施例11 采用氧化葡糖杆菌在含4% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化48小时后再采用 假丝酵母(Candida ssp.)CGMCC NO : 3268发酵 氧化葡糖杆菌在含4XD-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化的实施同实施例6。然 后在此转化液中按照体积比为10X接入假丝酵母(Candidassp.)CGMCCNO : 3268以及加 入质量百分比为0.5%的酵母粉(除菌后)，在32t:继续培养10小时。离心分离菌体，得 到澄清的含L塔格糖的上清液。HPLC分析该澄清上清，结果如图7，由图7可见，假丝 酵母(Candida ssp.)CGMCC NO : 3268已经将全部D-塔格糖以及绝大部分残留的D-半乳 糖醇消耗完全，L-塔格糖的纯度达到95X以上。
实施例12 采用巴氏醋酸杆菌在含3% D-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化48小时后再采用 假丝酵母(Candida ssp.)CGMCC NO : 3268发酵 巴氏醋酸杆菌在含3XD-半乳糖醇的溶液中静息细胞转化的实施同实施例7。然 后在此转化液中按照体积比为10X接入假丝酵母(Candidassp.)CGMCCNO : 3268以及加 入质量百分比为0.5%的酵母粉(除菌后)，在32t:继续培养10小时。离心分离菌体，得到澄清的含L-塔格糖的上清液。HPLC分析该澄清上清，结果如图8，由图8可见，假 丝酵母(Candidassp.)CGMCC NO : 3268已经将全部D-塔格糖以及绝大部分残留的D-半 乳糖醇消耗完全，L-塔格糖的纯度达到95X以上。
实施例13 从弱氧化醋酸杆菌静息细胞转化液以及酵母发酵液中净化分离L-塔格糖
弱氧化醋酸杆菌静息细胞转化液以及酵母发酵除去D-塔格糖以及残留的D-半乳 糖醇的实施同实施例4与实施例8。在250ml澄清发酵液中加入粉末活性炭5克，80°C 脱色60分钟，转速为150转/分，0.45微米微孔滤膜过滤除去活性炭得到无色的发酵液。 无色的发酵液再进行离子交换处理依次通过001*7型阳离子交换柱，201*7型阴离子交 换柱以及001*7型阳离子交换柱(上海树脂厂有限公司生产)。检测流出液的电导率，当 流出液的电导率低于20 ii s/cm时停止离子交换。将脱盐后的发酵液通过旋转蒸发浓縮直 到折光率大于60%，加入4倍体积的无水乙醇混匀，轻轻搅拌，4t:放置24小时充分结 晶，离心得到白色晶体，再用95%乙醇洗涤2次，然后干燥，得到5.5克干燥的L-塔格 糖白色粉末晶体。经HPLC分析，此晶体中L-塔格糖的纯度在99X以上，如图9所示。
权利要求
一种制备L-塔格糖的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，制备培养产酸细菌的培养基，培养基的成分为1L培养基由以下组分组成D-卫矛醇2～20克，多元醇1～10克，葡萄糖5～50克，酵母粉10克，无水硫酸镁0.5克，碳酸钙10克，余量为水；步骤二，将产酸细菌接种在步骤一所得培养基上，25～35℃振荡培养，得一级种子液；步骤三，将一级种子液接种到步骤一所得培养基中，25～35℃振荡培养，得二级种子液；步骤四，将二级种子液按照体积比为5～20％的接种量接种到发酵培养基中，培养，离心，得到发酵液；所述发酵培养基的成分为，1L发酵培养基由以下组分组成D-卫矛醇10～100克，多元醇1～10克，葡萄糖5～50克，酵母粉5～50克，硫酸镁0.5克，磷酸氢二钾2克，余量为水；步骤五，制备用来培养酵母的培养基，培养基成分为1L培养基由以下组分组成葡萄糖15克，酵母粉10克，无水硫酸镁0.5克，余量为水；步骤六，将酵母接种在步骤五所得培养基中，25～35℃振荡培养，得到酵母一级种子液；步骤七，将酵母一级种子液接种到步骤五所得培养基中，25～35℃振荡培养，得到二级酵母种子液，离心，得酵母细胞；步骤八，将酵母细胞接种到步骤四所得发酵液中，25～35℃振荡培养5～40小时，离心，得澄清的发酵液；步骤九，将步骤八所得发酵液浓缩至原体积的1/10，加入质量百分比为2％的粉末性活性炭，80℃下，100rpm条件下脱色120分钟，过直径为0.22～0.45微米的微孔滤膜，得溶液；步骤十，将步骤九所得溶液依次经过D001阳离子交换树脂和D201阴离子交换树脂，直至电导率≤20μs/cm，再浓缩到折光率为＞60％，加入2～8倍体积的无水乙醇，混匀，4～30℃下结晶20～30小时，离心，得晶体，加入2倍质量的体积百分比为95％的乙醇洗涤2～3次，干燥，即得L-塔格糖。
2. 根据权利要求l所述的制备L-塔格糖的方法，其特征是，步骤一和步骤四中，所 述多元醇为甘油、赤藓糖醇、木糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、山梨醇和甘露醇中的一种 或几种的混合。
3. 根据权利要求l所述的制备L-塔格糖的方法，其特征是，步骤二中，所述产酸细 菌为醋酸杆菌属、氧化葡萄糖杆菌属或者葡糖酸杆菌属中的任一细菌。
4. 根据权利要求l所述的制备L-塔格糖的方法，其特征是，步骤二中，所述产酸细 菌为弱氧化醋酸杆菌、汉逊醋酸杆菌或者巴氏醋酸杆菌。
5. 根据权利要求l所述的制备L-塔格糖的方法，其特征是，步骤二中，所述产酸细 菌为弱氧化醋酸杆菌。
6. 根据权利要求l所述的制备L-塔格糖的方法，其特征是，步骤二中，所述产酸细 菌为氧化葡糖杆菌、弱氧化葡糖杆菌或者Gluconobacterfrateurii。
7. 根据权利要求l所述的制备L-塔格糖的方法，其特征是，步骤二中，所述产酸细菌为汉逊葡糖醋酸杆菌。
8. 根据权利要求l所述的制备L-塔格糖的方法，其特征是，步骤六中，所述酵母为假丝酵母CGMCC NO : 3268。
9. 一种制备L-塔格糖的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，制备培养基，培养基的成分为1L培养基由以下组分组成，D-卫矛醇5克，山梨醇5克，葡萄糖20克，酵母粉15克，硫酸镁0.5克，磷酸氢二钾2克，碳酸钙5克，余量为水；将醋酸杆菌属、氧化葡萄糖杆菌属或者葡糖酸杆菌属中的任一细菌接种于培养基中，培养；步骤二，培养结束后，离心，得菌体细胞，悬浮菌体细胞，25 35°C、 100 300rpm下转化24 96小时，得溶液；所述悬浮使用的溶液为，溶液的组分为1% 10X的D-卫矛醇，0.1 0.5%酵母粉，余量为水，所述百分数为质量分数；步骤三，将假丝酵母CGMCC NO : 3268接入步骤二所得溶液中，25 35。C培养`10 48小时，得发酵液；步骤四，将步骤三所得发酵液依次经过脱色和脱盐处理，得到澄清水溶液，将水溶液浓縮到折光率>60%，加入2 8倍体积的无水乙醇，混匀，4 3(TC下结晶20 30小时，离心，得晶体，加2倍质量的体积百分比为95%的乙醇洗涤2 3次，干燥晶体，即得L-塔格糖。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域的制备L-塔格糖的方法。制备L-塔格糖的方法，包括如下步骤制备培养基；培养产酸细菌，得一级种子液；得二级种子液；将二级种子液接种到发酵培养基中，得到发酵液；得到酵母一级种子液和二级酵母种子液，离心，得酵母细胞；将酵母细胞培养，得澄清的发酵液；浓缩，脱色，过滤，得溶液；将溶液过离子交换树脂，结晶，洗涤，干燥，得L-塔格糖；利用静息细胞转化D-卫矛醇制备L-塔格糖的方法，包括如下步骤制备培养基，培养细菌；悬浮菌体细胞，得溶液；接种假丝酵母(Candida ssp.)CGMCCNO3268，得发酵液；将发酵液经过脱色和脱盐处理，得到水溶液，浓缩，结晶，洗涤，干燥，得L-塔格糖。本发明的方法可用来制备医药级L-塔格糖。
文档编号C12P19/00GK101691597SQ200910307138
公开日2010年4月7日 申请日期2009年9月17日 优先权日2009年9月17日
发明者程海荣, 邓子新 申请人:上海交通大学;淄博科锐控制系统工程有限公司