专利名称：抗adam-15抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及特异性地识别ADAM-15 (去整合素金属蛋白酶=ADisintegrinAnd Metalloprotease)的抗体以及该抗体的片段(以下，总称为“抗体等”)、编码该抗体等的 DNA、含有该DNA的重组载体、用该载体转化的细胞、产生前述抗体等的细胞、前述抗体等的 制造方法、含有前述抗体等的药物组合物、含有前述抗体等的诊断药。另外，本发明涉及特 异性地识别人ADAM-15的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体(改型抗体)以及人源抗体 (全人源性抗体)；产生前述单克隆抗体的杂交瘤细胞；前述单克隆抗体的制造方法；前述 杂交瘤细胞的制造方法；含有前述抗体的治疗药；含有前述抗体的诊断药等。
背景技术：
ADAM是含有富含半胱氨酸残基的去整合素结构域和金属蛋白酶样结构域的分子， 作为功能性蛋白质不仅有金属蛋白酶活性还能发挥粘附分子活性，因此，受到人们的关注。 多数ADAM具有跨膜域，局部存在于细胞膜，对于细胞表面的分子控制起到极为重要的作 用。ADAM蛋白质家族现在已鉴定出30种以上，其膜外部具有细胞粘附、细胞融合、蛋白质 分解、细胞内信号传导的功能，因此，参与受精、神经发生、成肌细胞融合、细胞因子或其他 膜蛋白质的膜外部的切断。尤其是，ADAM蛋白质家族是与蛇毒解离素结构相似的膜锚定 (membrane-anchor)蛋白质，因此，关系到与细胞间和细胞-基质相互作用有关的各种生物 学上的过程(例如，受精、成肌细胞发生以及神经发生等)。至此，关于新型的ADAM分子的 探索及其功能阐明及其控制方法，从制药上的观点考虑，进行了深入的研究。例如有认为ADAM-I和ADAM-2通过卵子的整合素的介入，参与卵子和精子的受 精(参照非专利文献1)。有指出ADAM-IO参与Notch信号的控制，在神经形成中起到重要 的作用，以及，还在膜蛋白的加工过程中参与细胞外基质成分的分解(参照非专利文献2)。 最近，报告了 1种被认为是软骨细胞外基质聚蛋白多糖(aggrecan)的分解酶的聚蛋白多糖 酶(aggrecanase)得到纯化、克隆，其为ADAM家族的分子(参照非专利文献3)。因而，期待 开发出通过控制ADAM-IO的酶活性治疗关节炎、变形性关节症的药物。ADAM-13在非洲爪 蟾中，在发生期表达，认为对其形态的形成具有重要作用(参照非专利文献4)。现在，还没 有来自哺乳动物的ADAM-13的报告。ADAM-17作为肿瘤坏死因子(TNF)的转化酶(可溶性 TNF的合成酶)已为人所知。目前正致力于研究ADAM-17的抑制剂作为由TNF的异常亢进 所引起的疾病(炎症、发热、循环系统异常、移植物抗宿主反应、自身免疫疾病等)的预防和 /或治疗药。关于ADAM-17本身及ADAM-17的抑制剂的筛选方法已经公开(参照专利文献 1、专利文献2)。ADAM-15是分子量约90kDa的跨膜型糖蛋白质，属于ADAM蛋白质家族。已知 ADAM-15具备作为通过其去整合素域参与细胞与细胞粘附的粘附分子的功能(参照非专利 文献5)。在有20种以上的ADAM蛋白质家族之中，仅人ADAM-15在去整合素区域中具有RGD 三肽序列，显示出重组型人ADAM-15和整合素α ν β 3的特异的相互作用取决于RGD序列。 另外，ADAM-15有可能与整合素(α νβ3、α5β1、α II β 3、α 9 β 1)相互作用，已指出与细胞_细胞间的粘附有关。另外，包括去整合素域的RGD序列的第481号至第492号氨基 酸序列(RPTRGDCDLPEF)(环序列)中的 R481、C487、D488、L489、P490、E491 和 / 或 F492 被 丙氨酸取代的ADAM-15，与α 9β 1整合素的相互作用能力降低。因此，显示出ADAM-15中 的 R481、C487、D488、L489、Ρ490、Ε491 和 / 或 F492 对于 ADAM-15 与 α 9 β 1 整合素的相互 作用是必要的(参照非专利文献6)。当以基因重组ADAM-15去整合素结构域进行给药时，乳癌细胞的增殖受到抑制， 因此，认为ADAM-15与整合素的相互作用与癌细胞的增殖有关(参照非专利文献7)。另外，ADAM-15也被认为与细胞迁移有关。例如，有人报道了在过量表达ADAM-15 的ΝΙΗ3Τ3细胞中，迁移降低(参照非专利文献8)。另外，有人报道了当在Jurkat细胞中过 量表达ADAM-15时，细胞凝聚增加(参照非专利文献9)。此外，有人报道了 ADAM-15与作为 细胞粘附分子的VE钙粘蛋白在局部共同存在(参照非专利文献10)。根据这些信息，认为 ADAM-15对于细胞间粘附来说具有重要的作用。ADAM-15在全身的组织中进行表达，但在血管内皮细胞中也表达，在ADAM-15基因 敲除的小鼠中，新血管形成受到抑制(参照非专利文献11)。此外，用VEGF刺激HUVEC时， VEGFR-2和ADAM-15的表达增加，因此，显示出ADAM-15和新血管形成有关(参照非专利文 献 12)。报道了与ADAM-15有关的细胞增殖、细胞迁移、细胞间粘附、新血管形成分别与癌 以及癌的转移密切相关，因此，认为ADAM-15与癌以及癌的转移有关。此外，ADAM-15在类风湿关节炎或动脉硬化等中表达亢进，因此认为与组织修复过 程有关。另外，ADAM-15在心肌梗塞发病早期在梗塞部位和非梗塞部位，其表达亢进，因此， 认为与心脏的组织修复过程有关。但是，关于ADAM-15的结构和这些ADAM-15的多种功能的关系并没有详细的报告， 关于通过何种结构发挥ADAM-15的功能也是未知的。另外，作为针对ADAM-15的单克隆抗体，例如，已知有R&D公司出售的23G9等，但 也没有报道这些抗体和ADAM-15的功能的关系。另外，识别ADAM-15的去整合素结构域的 抗体至今未见报道。现在，作为癌的治疗药，已知有多种药物，但其中的多数具有较强的副作用，因此， 人们期望开发出副作用进一步降低且具有治疗效果的癌的预防药和/或治疗药等。此前的 抗癌药对于癌细胞具备特异的细胞杀伤作用或细胞增殖抑制作用，由此，作为副作用少且 能治疗癌症的药剂而进行开发。但是，实际上，多数这类的药剂也作用于正常细胞，带来严 重的副作用。专利文献1 美国专利第5830742号专利文献2 美国专利第6013466号非专利文献1 :Almeida，Ε. A. et al.，Cell，81，1095-1104，1995非专利文献2 :ffen, C. et al.，Development, 124,4759-4767，1997非专利文献3 =Tortorella, M. D. et al.，Science, 284,1664-1666，1999非专利文献4 :Alfandari，D. et al.，Dev. Biol.，182，314-330，1997非专利文献5 Zhang, X. P. et al.，J. Biol. Chem. 273，7345-7350，1998 ；Nath，D. et al. , J. Cell Sci. 112，579-587，1999 P. 468-473.
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非专利文献6 :Eto, K. et al. J. Biol. Chem. 277，17804-17810，2002非专利文献 7 =Trochon-Joseph, V.，et al.，Cancer Res, 64，2062-2069，2004非专利文献8 :Herren，B.，et al.，Exp Cell Res, 271，152-160，2001非专利文献9 =Charrier, L.，et al.，J Biol Chem, 282，16948-16958，2007非专利文献10 :Ham, C.，et al.，Exp Cell Res, 279，239-247，2002非专利文献11 :Horiuchi, K.，et al.，Mol Cell Biol，23，5614-5624，2003非专利文献12 =Komiya, K.，et al.，Arthritis Res Ther, 7, Rl 158-1173，200
发明内容
发明要解决的课题本发明的目的在于提供一种癌的治疗药，其中，所采用的开发思路不同于此前的 抗癌药，而是聚焦于癌细胞的细胞_细胞间粘附。即，本发明的目的在于提供一种抑制癌细 胞增殖以及癌细胞的细胞-细胞间粘附且降低副作用的癌的治疗药。另外，本发明的目的 在于提供一种识别ADAM-15的去整合素结构域，且能用作抗癌药的抗体等。解决课题的技术方案本发明人等对识别ADAM-15的抗体进行了深入研究，结果发现，识别ADAM-15的去 整合素结构域的抗体具有抑制癌细胞增殖作用以及阻碍细胞粘附作用。本发明人等认为该 抗体的抑制癌细胞增殖作用和阻碍细胞粘附作用是通过ADAM-15和整合素的结合来发挥 的，进一步研究的结果有令人惊异的发现该抗体并不识别此前一直认为是ADAM-15的整 合素结合部位的去整合素结构域中的RGD序列以及环序列。本发明人等根据这些研究成 果，发现识别与此前所知的ADAM-15的整合素结合部位不同的部位的抗体具有抑制癌细胞 增殖作用和阻碍细胞粘附作用，从而完成本发明。S卩，本发明提供以下所述的特异性地识别ADAM-15的抗体等、编码该抗体等的 DNA、含有该DNA的重组载体、用该载体转化的细胞、产生前述抗体等的细胞、前述抗体等的 制造方法、含有前述抗体等的药物组合物、含有前述抗体等的诊断药。(1) 一种抗体或其片段，其识别ADAM-15的去整合素结构域，并且不识别ADAM-15 的去整合素结构域内的RGD序列。(2) 一种抗体或其片段，其识别ADAM-15的去整合素结构域，并且不识别ADAM-15 的去整合素结构域内的环区。(3) 一种抗体或其片段，其为上述⑴或(2)记载的抗体或其片段，其阻碍 ADAM-15和整合素α ν β 3依赖性细胞粘附。(4) 一种抗体或其片段，其为上述⑴ (3)中任一项所记载的抗体或其片段，其 阻碍ADAM-15和整合素α 9 β 1依赖性细胞粘附。(5) 一种抗体或其片段，其为上述⑴ ⑷中任一项所记载的抗体或其片段，其 抑制癌细胞的增殖。(6)根据上述(1) (5)中的任一项所记载的抗体或其片段，其中，上述抗体是单 克隆抗体。(7)根据上述⑴ (6)中任一项所记载的抗体或其片段，其中，上述抗体含有具 有序列号12的氨基酸序列的重链和/或具有序列号14的氨基酸序列的轻链。
(8)根据上述(6)所记载的抗体或其片段，其中，上述抗体是通过以保藏受理号 FERMABP-10950特定的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。(9)根据上述⑴ (7)中的任一项所记载的抗体或其片段，其中，上述抗体是嵌 合抗体、人源化抗体或人源抗体。(10)根据上述(1) (5)中的任一项所记载的抗体或其片段，其中，上述抗体片段 是F(ab' )2、Fab'、Fab、单链Fv (scFv)、二硫键稳定性Fv (dsFv)或它们的聚合物，或者是 二聚体化V区(Diabody 二聚体化抗体片段)。(11)根据上述⑴ (5)中的任一项所记载的抗体或其片段，其中，上述抗体的片 段是含有抗体的CDR序列的肽。(12)根据上述(11)所记载的抗体或其片段，其中，上述CDR序列具有序列号15、 序列号16、序列号17、序列号18、序列号19或者序列号20的氨基酸序列。(13) 一种DNA，其编码上述(1) (12)中的任一项所记载的抗体或其片段。(14) 一种重组载体，其含有上述(13)所记载的DNA。(15) 一种转化细胞，其通过向宿主细胞导入上述(14)所记载的重组载体而得到。(16)根据上述(15)所记载的细胞，其中，其为杂交瘤细胞系。(17)根据上述(16)所记载的细胞，其中，其为以保藏受理号FERMABP-10950特定 的杂交瘤细胞系。(18) 一种抗体或其片段的制造方法，其中，其为上述(1) (12)中的任一项所记 载的抗体或其片段的制造方法，其特征在于，培养上述(15)或(16)所记载的细胞，在培养 物中生成抗体或其片段，从培养物中提取抗体或其片段。(19) 一种药物组合物，其含有上述(1) (12)中的任一项所记载的抗体或其片段 作为有效成分。(20)根据上述(19)所记载的药物组合物，其中，其为细胞增殖、细胞迁移、细胞间 粘附或者新血管形成所引起的疾病的治疗药或预防药。(21)根据上述(19)所记载的药物组合物，其中，其为抗癌药或癌转移抑制剂。(22) 一种诊断药，其具备上述(1) (12)中的任一项所记载的抗体或其片段。(23)根据上述(22)所记载的诊断药，其中，其为细胞增殖、细胞迁移、细胞间粘附 或者新血管形成所引起的疾病的诊断药。发明的效果本发明的抗ADAM-15抗体等显示出优异的ADAM-15功能抑制作用，因此，对于细胞 增殖、细胞迁移、细胞间粘附或者新血管形成所引起的疾病起到治疗效果。因而，本发明的 抗体等对于癌(例如，癌细胞的增殖、转移)、炎症性疾病(例如，类风湿关节炎、变形性关节 炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化症、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、炎症性肠病(溃疡性结肠 炎、克罗恩病等))、传染病(例如，肝炎)、自身免疫疾病(例如，系统性红斑狼疮、多发性肌 炎、自身免疫性甲状腺疾病、肾小管间质性肾炎、重症肌无力)以及骨疾病(例如，骨质疏松 症)等起到治疗效果。另外，本发明的抗体能够以病理学的方式检测出细胞以及组织中的 ADAM-15的表达。
图1是表示通过ELISA法测定抗人ADAM-15单克隆抗体8F7的结合特异性的结果 的图。图中，纵轴表示490nm处的吸光度，横轴表示固相化的多肽的浓度。将GST、人ADAM-15 去整合素结构域-GST蛋白质(d. d. -GST)、人ADAM-15去整合素结构域环区-GST蛋白质 (loop-GST)、人ADAM-15去整合素结构域蛋白质(d. d.)、人ADAM-15去整合素结构域蛋白质 (RAA取代产物)(d. d. -RAA)以及小鼠骨桥蛋白N-半GST蛋白质(mOPNN-haIf-GST)，分别 从10 μ g/mL开始进行系列稀释，固定于固相，作为一次抗体，采用调节至0. 1 μ g/mL的8F7。 作为基线采用仅是PBS的吸光度。图2是表示通过蛋白质印迹法(western blotting)测定人ADAM-15单克隆抗体 8F7的结合特异性的结果的图。图中，(+)表示导入ADAM-15基因的C0S-7的细胞溶液样 品，(_)表示未导入基因的C0S-7的细胞溶液样品。另外，箭头表示目标条带。图3是表示通过ELISA法测定8F7和23G9对ADAM-15去整合素结构域的结合活 性的结果的图。图中，纵轴表示490nm处的吸光度，横轴表示固相化的多肽的浓度。另外， hTNC-GST表示人肌糖蛋白C-GST蛋白质。图4表示测定8F7的RGD序列非依赖性细胞粘附阻碍活性的结果。A表示测定 CHO-Kl和ha 9/CH0对hADAM-15去整合素结构域的细胞粘附的结果。图中，纵轴表示590nm 处的吸光度，横轴表示固相化的多肽的浓度。B表示测定8F7针对h a 9/CH0对hADAM-15去 整合素结构域的细胞粘附的阻碍活性的结果。图中，纵轴表示590nm处的吸光度，横轴表示 固相化的多肽的浓度。图5表示通过流式细胞仪测定人肾癌细胞株NRC-12的整合素的表达的结果。α 9β 1 整合素采用Υ9Α2检测，α ν β 3整合素采用LM609检测，a 5 β 1整合素采用JBS5检测。图6表示测定8F7的RGD序列依赖性细胞粘附阻碍活性的结果。A表示对NRC-12 和hADAM-15去整合素结构域的细胞粘附进行研究的结果。图中，纵轴表示590nm处的吸光 度，横轴表示固相化的多肽的浓度。B表示测定8F7针对NRC-12对hADAM-15去整合素结构 域的细胞粘附的阻碍活性的结果。图中，纵轴表示590nm处的吸光度，横轴表示固相化的多 肽的浓度。图7表示通过流式细胞仪测定人乳腺癌细胞株(MDA-MB-435S)中的整合素的表达 的结果。α9β 1整合素采用Y9A2进行检测，α ν β 3整合素采用LM609进行检测，α5β1 整合素采用JBS5进行检测。图8表示采用人乳腺癌细胞株(MDA-MB-435S)的细胞粘附试验的结果。A表示测 定对hADAM-15去整合素结构域的细胞粘附的结果。图中，纵轴表示590nm处的吸光度，横 轴表示固相化的多肽的浓度。B表示在Mn离子存在下测定对hADAM-15去整合素结构域的 细胞粘附的结果。图中，纵轴表示590nm处的吸光度，横轴表示固相化的多肽的浓度。图9表示采用人乳腺癌细胞株(MDA-MB-435S)的细胞粘附阻碍试验的结果。A表示 由8F7阻碍人乳腺癌细胞株(MDA-MB-435S)对ADAM-15去整合素结构域的粘附的结果。B表 示由8F7阻碍人乳腺癌细胞株(MDA-MB-435S)对ADAM-15去整合素结构域(RAA取代产物) 的粘附的结果。C表示由Y9A2或LM609阻碍人乳腺癌细胞株(MDA-MB-435S)对ADAM-15去 整合素结构域的粘附的结果。D表示由Y9A2或LM609阻碍人乳腺癌细胞株(MDA-MB-435S) 对ADAM-15去整合素结构域(RAA取代产物)的粘附的结果。在全部图中，纵轴表示以未添加抗体为100%时的细胞粘附率，横轴表示给与的抗体。图10表示对ADAM-15在人乳腺癌细胞株(MDA-MB-435S)的细胞增殖中起的作用 以及8F7对该作用的阻碍活性进行测定的结果。各抗体以20 μ g/mL的量添加。图中，纵轴 表示48小时后的细胞增殖率。图11表示采用人乳腺癌细胞株435S细胞的细胞浸润阻碍试验的结果。图12表示抗人ADAM-15抗体(8F7)重链的碱基序列以及氨基酸序列。氨基酸序 列以单字母代码表示。信号序列是斜体，相当于抗体的N端的氨基酸残基(Q)用双下划线 表示。通过Kabat编号系统类推的CDR用下划线表示。另外，抗体的可变部和恒定部的边 界的氨基酸残基(A)用粗下划线表示。图13表示抗人ADAM-15抗体(8F7)轻链的碱基序列和氨基酸序列。氨基酸序列 用单字母代码表示。信号序列是斜体，相当于抗体的N端的氨基酸残基(D)用双下划线表 示。通过Kabat编号系统类推的CDR用下划线表示。另外，抗体的可变部和恒定部的边界 的氨基酸残基(R)用粗下划线表示。
具体实施例方式根据本发明的一个实施方式，本发明提供一种抗体，其为与ADAM-15结合且不 识别ADAM-15的去整合素结构域内的RGD序列的抗体等，以及与ADAM-15结合且不识别 ADAM-15的去整合素结构域内的环区的抗体等。对于本发明的抗体等而言，只要是能用作本发明的抗体等，也可以对ADAM-15以 外的物质结合(或识别)，但优选为与ADAM-15特异性地结合(或识别)的抗体等。此处， 抗体与某种蛋白质或其片段“特异性地结合(或识别)”是指，与该抗体对其他的氨基酸 序列的亲和性相比，对这些蛋白质或其片段的特定的氨基酸序列以实质上更高的亲和性结 合。此处，所说的“实质上更高的亲和性”是指，亲和性的程度高到通过所希望的测定装置或 方法，能够将其特定的氨基酸序列与其他的氨基酸序列区别开并检测出的意思。作为以实 质上更高的亲和性结合的情况下的结合常数(Ka)，例如，至少是lOl1，优选至少为IO8M4, 更优选至少为IO9MA作为这种结合常数，进一步更优选为IOkiM-1UO11M-1UO12M-1或者比其 高，例如IO13M4或者还要更高的常数。作为本发明的抗体等识别的ADAM-15，并无特别限制，优选为小鼠、大鼠、仓鼠、兔 子、人等哺乳动物的ADAM-15，更优选为人ADAM-15。这些ADAM-15的氨基酸序列以及编码其 的核苷酸序列的信息可通过GenBank这样的基因序列数据库获得(例如，GeneID :8751 (人 (Homo sapiens))，11490 (小鼠(Mus musculus))，57025 (大鼠(Rattus norvegicus))等)。另外，本发明的抗体等识别的ADAM-15包含具有与ADAM-15实质上相同的氨基酸 序列的多肽。此处，“具有实质上相同的氨基酸序列的多肽”是具有与天然型的ADAM-15 (优 选为人ADAM-15)实质上同等的生物学性质的多肽，是指具有在该氨基酸序列中的多个氨 基酸(优选为1 10个氨基酸，更优选为1 数个(例如，1 5个、1 4个、1 3个、 1 2个)氨基酸)被取代、缺失和/或插入的氨基酸序列的变异多肽，以及具有在该天然 型ADAM-15 (优选为人ADAM-15)的氨基酸序列中添加有多个氨基酸(优选为1 10个氨 基酸，更优选为1 数个(例如，1 5个、1 4个、1 3个、1 2个)氨基酸)的氨基 酸序列的变异多肽。另外，具有与ADAM-15实质上相同的氨基酸序列的多肽，可以是具有前述的取代、缺失、插入以及添加中的多种变异的变异多肽。另外，根据本发明的其他实施方式，提供识别ADAM-15且阻碍ADAM-15和整合素 ανβ3依赖性细胞粘附的抗体等，以及，阻碍ADAM-15和整合素α 9 β 1依赖性细胞粘附的 抗体等。ADAM-15和整合素可以是在同一细胞表面上表达的物质，也可以是分别在不同细胞 的表面上表达的物质，优选为分别在不同的细胞的表面上表达的物质。本发明的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，优选为单克隆抗体。在本 发明中，“单克隆抗体”对抗原有高度的特异性，识别单一的抗原。进一步，本发明的抗体包括非人动物的抗体、具有非人动物的抗体的氨基酸序列 和来自人的抗体的氨基酸序列的抗体以及人源抗体。作为非人动物的抗体，例如，可举出 小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、狗、猴子、绵羊、山羊、鸡、鸭子等的抗体，优选为能制备杂交瘤 的动物的抗体，更优选为小鼠的抗体。作为具有非人动物的抗体的氨基酸序列和来自人 的抗体的氨基酸序列的抗体，可举出人型嵌合抗体、人源化抗体。在上述中，所说的“嵌合 抗体”是以基因工程的方式对来自非人动物的抗ADAM-15抗体的恒定区进行改变的抗体， 使其具有与人的抗体相同的恒定区，优选为人_小鼠嵌合抗体(参照欧洲专利公开公报 ΕΡ0125023)。所说的“人源化抗体”是以基因工程的方式将来自非人动物的抗人ADAM-15 抗体的H链和L链的互补决定区(CDR)以外的一级结构改变成对应于人的抗体的一级结构 的贞#。 ift^h，Mil的 CDRi由 Kabat “Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E.等，U. S. Department of Health and Human Services,1983)或 Chothia 等(Chothia&Lesk，J. Mol. Biol.，196，901-917，1987)定义的。所说的“人源抗体” 是完全来自于人的抗体基因的表达产物的抗体，例如，可举出采用导入了与人的抗体产生 相关的基因的转基因动物来制备的单克隆抗体(参照欧洲专利公开公报EP0546073)等。治 疗对象是人，在ADAM-15抗体产生动物为小鼠的情况下，优选为人_小鼠的嵌合抗体或人源 化抗体，更优选为人单克隆抗体。本发明的抗体的免疫球蛋白类并无特别限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、IgY 中的任一免疫球蛋白类。另外，本发明的抗体也包括任意的同型的抗体。本发明还在一个实施方式中提供一种抗ADAM-15抗体的片段。此处，所说的“抗 体的片段”是抗体的一部分(例结构域)，其保持抗体对抗原的作用(例结合能力，中 和能力)。作为这种抗体的片段，例如，可举出F(ab' )2、Fab'、Fab、单链Fv(以下，称为 “8冲7)、二硫键？￥(以下称作“dsFv”)或它们的聚合物，或者二聚体化V区(以下称作 "Diabody 二聚体化抗体片段)”)、或者包含⑶R的肽。F(ab' )2是用作为蛋白分解酶的胃 蛋白酶处理IgG所得到的片段中的分子量约10万的具有抗原结合活性的抗体片段。Fab' 是切割该F(ab')的铰链区域的二硫键而获得的分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体 片段。sdFv是用肽接头连结1条VH和1条VL的具有抗原结合活性的多肽。dsFv是VH和 VL中的被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基通过二硫键结合的具有抗原结合活性的片段。 Diabody是scFv 二聚体化的片段。本发明的Diabody可以是单特异性的，也可以是双特异 性(多特异性抗体)。二聚体化的scFv可以相同也可以不同。作为本发明的抗体的片段，包括含有抗ADAM-15抗体的一部分的肽。此处，所说的 “含有抗体的一部分的肽”是具备构成抗体的氨基酸序列的一部分的氨基酸序列的肽，是保 持抗体对抗原作用(例如，结合能力、中和能力)的物质。含有抗体的一部分的肽可以含有不来自于该抗体的氨基酸序列。作为含有抗ADAM-15抗体的一部分的肽，优选为含有抗 ADAM-15抗体的CDR序列的肽。此处，所说的含有CDR序列的肽，是含有选自重链可变区的 ⑶R1、⑶R2和⑶R3以及轻链可变区的⑶R1、⑶R2和⑶R3的至少一种⑶R的氨基酸序列的 肽。作为含有抗ADAM-15抗体的一部分的肽，更优选为含有重链可变区的CDR3和/或轻链 可变区的CDR3的氨基酸序列的肽。本发明的抗ADAM-15抗体的代表例子的重链和轻链，分别具有序列号12和序列号 14的氨基酸序列。另外，本发明的抗ADAM-15抗体的代表例子的重链可变区的⑶R1、⑶R2 和⑶R3以及轻链可变区的⑶R1、⑶R2和⑶R3分别具有序列号15、序列号16和序列号17 以及序列号18、序列号19和序列号20的氨基酸序列。本发明的抗体由于阻碍ADAM-15的功能，因此，能够用作ADAM-15相关的疾病的治 疗药和预防药。此处，ADAM-15相关的疾病是由细胞增殖、细胞迁移、细胞浸润、细胞间粘附、 或者新血管形成所引起的疾病，作为这类疾病，例如，可举出癌(食道癌、甲状腺癌、膀胱 癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、胸部癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、子宫 癌、卵巢癌、前列腺癌、肾母细胞瘤)以及其转移、子宫内膜异位症等的细胞增殖或新血管 形成所引起的疾病；关节炎、传染病(肝炎等)、支气管哮喘、纤维化症、自身免疫疾病(例 如，系统性红斑狼疮(SLE)、多发性肌炎(PM)、自身免疫性甲状腺疾病、肾小管间质性肾炎、 重症肌无力(EAMG)、器官特异性自身免疫病等)、类风湿关节炎(慢性类风湿关节炎(RA)、 变形性关节炎(OA))、多发性硬化(复发-缓解型多发性硬化等)、炎症性肠病(溃疡性结 肠炎、克罗恩病等)、进行性系统性硬化症(PSS)、干燥综合征、皮肌炎(DM)、结节性动脉周 围炎(PN)、甲状腺疾病(格雷夫斯病等)、格林_巴利综合征、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、 特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、肌萎缩侧索硬化(ALS)、I型糖尿病、移 植时的排斥反应、手术后的粘连、子宫内膜异位症、牛皮癣、狼疮、过敏、哮喘、中性粒细胞功 能异常等炎症性疾病或细胞迁移所引起的疾病；血管重建手术后再狭窄、心脏冠动脉血管 闭塞性疾病、脑血管闭塞性疾病、肾血管闭塞性疾病、末梢血管闭塞性疾病、动脉硬化、脑梗 塞等血管闭塞性疾病或血管内膜增生所引起的疾病。作为本发明的ADAM-15相关疾病，优 选为癌。本发明的抗体能够用作ADAM-15相关疾病的诊断药。用作诊断药的情况下，使用 的抗体或其片段优选为特异性地识别ADAM-15的抗体或其片段。1.抗ADAM-15抗体的制备本发明的抗体例如可通过如下方法制备将ADAM-15或具有ADAM-15的一部分的 肽与符合需要的免疫调节剂(例如，矿物油或铝沉淀物和加热灭活细菌或脂多糖、弗氏完 全佐剂、或弗氏不完全佐剂等)一起，对非人哺乳动物或鸟类进行免疫。用作免疫原的ADAM-15，优选为哺乳动物的ADAM-15，特别优选为人ADAM-15。在 本发明中用作抗原的ADAM-15可以作为如下形式的物质来得到(1)来自于表达人或其他 哺乳动物的ADAM-15的所有细胞，或者这些细胞所存在的所有组织的蛋白质；(2)将编码 ADAM-15的基因DNA优选为cDNA导入细菌、酵母、动物细胞等细胞株，使其表达的重组蛋白 质；或者(3)合成蛋白质。例如，用于制备本发明抗体的免疫原，可通过如下方法得到将含有编码ADAM-15 的cDNA的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等，使其表达。例如，作为用于制备本发明抗体的免疫原，可以采用使ADAM-15在细胞膜上过量表达的细胞自身。另 外，作为用于制备本发明抗体的免疫原，也可以采用表达ADAM-15的细胞的膜组分等。使 ADAM-15在细胞膜上过量表达的细胞可通过如下方法得到采用公知的基因工程技术，对 编码ADAM-15的基因(例如，cDNA)进行克隆，使ADAM-15在细胞膜上过量表达。另外，使 ADAM-15在细胞膜上过量表达的细胞的膜组分，可通过如下方法得到对表达ADAM-15的细 胞(优选为过量表达的细胞)进行破坏，提取该膜组分。作为免疫原，采用具有ADAM-15的一部分的肽的情况下，可通过将含有编码这些 肽的cDNA的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等，使其表达来得到免疫 原。作为具有ADAM-15的一部分的肽，优选为含有ADAM-15的环区的肽。另外，ADAM-15或具有ADAM-15的一部分的肽，可采用Fmoc法或Boc法等通过化 学合成来制备。例如，将ADAM-15或具有ADAM-15的一部分的肽的C端的氨基酸固定于聚 苯乙烯载体上，采用二异丙基碳二亚胺(DIC)等缩合剂使其与用9-芴甲氧羰基(Fmoc基) 或叔丁氧羰基(Boc基)保护的氨基酸进行反应来结合，通过反复洗涤、脱保护的工序，能够 得到具有所希望的氨基酸序列的肽。另外，ADAM-15或具有ADAM-15的一部分的肽，也可以采用自动肽合成机来合成。 作为这种肽合成机，例如，可举出PSSM-8(岛津制作所)、型号433A的多肽合成仪( 手卜ν > 七寸 4 廿(P印tide synthesizer)) {r λ 卜K 4 才 ν ^ r Λ 文社(Applied Biosystems, Inc. ))、ACT396Apex ( 7 F > ^ 卜》Λ 歹y 夕社(Advanced ChemTech Inc.))等。另夕卜，作为具有与ADAM-15实质上相同的氨基酸序列的多肽的制造方法，例如，可 举出合成寡聚核苷酸部位突变导入法(gapped duplex法)、通过亚硝酸或亚硫酸处理随机 导入点突变的方法、通过Bal31酶等制备缺失变异体的方法、盒式突变法、接头筛选法、错 掺法、错配引物法、DNA片段合成法等。免疫原单独或者与载体、稀释剂一起施与对免疫的动物给药能产生抗体的部位。 在给药时，为了提高抗体产生能力，可以给药弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。作为免疫动物，只要是小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、狗、猴子、绵羊、山羊、鸡、鸭子 等能制备杂交瘤的动物即可，并无特别限制，优选为小鼠或大鼠，更优选为小鼠。对动物给药免疫原，例如，可通过皮下注射、腹腔注射、静脉注射、皮下注射、肌肉 注射或足踱注射来进行，优选为皮下注射或腹腔注射。使用的免疫原的量只要是能产生抗 体的量即可，并无特别限制，优选为0. 1 1000 μ g，更优选为1 500 μ g，进一步优选为 10 100 μ g。免疫可以进行1次或者以适当的间隔分开进行数次。通常，每1 6周进行 1次免疫，合计进行2 10次左右，优选1 5周进行1次免疫，合计进行2 5次，更优选 3周进行1次免疫，合计进行3次。距离最后一次免疫1 2周后，从免疫的动物的眼窝或 尾静脉采血，采用其血清进行抗体效价的测定。抗体效价的测定可通过本领域技术人员公 知的方法进行。例如，可举出放射性同位素免疫定量法(RIA法)、酶联免疫定量法(ELISA 法)、荧光抗体法、被动血凝法，优选为ELISA法。本发明的抗体可通过从显示出足够的抗体 效价的动物的血清进行纯化来得到。本发明的单克隆抗体可通过如下方法得到将由通过上述方法免疫的免疫致敏动 物所得到的抗体产生细胞和骨髓瘤系细胞(骨髓瘤细胞)进行融合，培养由此得到的杂交瘤。作为该融合方法，例如，可举出Milstein等的方法(Galfre,G. &Milstein,C.，Methods Enzymo1. 73 :3_46，1981)。使用的抗体产生细胞可以从通过上述方法免疫且血清显示出足够的抗体效价的 小鼠或大鼠的脾、胰腺、淋巴结、末梢血中采集，优选从脾中采集。使用的骨髓瘤系细胞例如是来自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔子或人等哺乳动物 的细胞，只要是能在体外增殖的细胞即可，并无特别限制。作为这种细胞，例如，可举 出 P3-X63Ag8 (X63) (Nature, 256, 495,1975)、P3/NSl/l_Ag4_l (NSl) (Eur. J. Immunol.， 6,292, 1976)、 P3X63Ag8Ul (P3U1) (Curr.Top.Microbiol. Immunol. ，81，1，1978)、 P3X63Ag8. 653(653) (J. Immunol.，123，1548，1979)、Sp2/0_Agl4 (Sp2/0) (Nature, 276, 269, 1978)、Sp2/0/F0-2 (F0-2) (J. Immunol. Methods, 35,1,1980)等，优选为来自与抗体产生细 胞为同种动物的细胞，更优选为来自与抗体产生细胞为同系统的动物的细胞。例如，作为来 自小鼠的骨髓瘤系细胞，优选为P3U1或P3X63-Ag8-653。骨髓瘤细胞可以冷冻保存或者用 添加有马、兔子或牛胎儿血清的通常的培养基进行继代来维持。另外，作为用于细胞融合的 骨髓瘤系细胞，优选为对数增殖期的细胞。作为使抗体产生细胞和骨髓瘤细胞融合来形成杂交瘤的方法，可举出使用聚乙二 醇(以下，称为“PEG”)等的方法(PEG法)、使用HVJ病毒(日本仙台病毒)的方法、使用 电融合装置的方法等。例如，在PEG法的情况下，用培养基、磷酸盐缓冲盐水(PBS =PhosphateBuffered Saline)等对通过上述方法得到的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞洗涤后，在含有30 60%的 PEG(平均分子量1000 6000)等细胞凝聚性介质的适当的培养基或缓冲液中，以1 2 10 1(优选为5 1 10 1)的混合比悬浮脾细胞和骨髓瘤细胞，在温度约25 37°C、 pH6 8的条件下，反应约30秒 3分钟左右(Elsevier Publishing, 1988)。反应结束后， 除去PEG溶液，再悬浮于培养基中，接种于细胞孔板中，持续培养。通过公知的方法或与之对应的方法，对产生单克隆抗体的杂交瘤细胞进行筛 选。通常，用添加有HAT(次黄嘌呤(Hypoxanthine)-氨基蝶呤(aminopterin)-胸苷 (thymidine))的动物细胞用培养基选择性地增殖，由此进行杂交瘤细胞的筛选。作为筛选 以及育种用培养基，任何培养基只要是杂交瘤细胞能够生育的培养基，就可以使用。例如， 可以使用含有1 20%优选为10 20%的胎牛血清的RPMI 1640培养基、含有1 10% 的胎牛血清的GIT培养基(和光纯药工业株式会社)或杂交瘤细胞培养用无血清培养基 (SFM-101,日水制药株式会社)等。培养温度通常为20 40°C，优选为约37°C。培养时间 通常为5天 3周，优选为1周 2周。培养通常在5% CO2下进行。培养后，采取培养上清液，通过ELISA等，选出结合于抗原蛋白质且不结合于非抗 原蛋白质的样品。例如，采用“新临床免疫实验操作法”(part 3)(科学评论社，1997)中记 载的细胞ELISA法进行确认和筛选。从这种克隆中重复1 5次，优选为2 4次的有限 稀释法，由此进行单一细胞化，选出显示出稳定且抗体效价高的细胞。本发明的单克隆抗体可通过如下方法获得将通过上述方法得到的杂交瘤在体外 培养，纯化培养液。另外，本发明的单克隆抗体也可通过如下方法得到对预先向腹腔内给 予降植烷的同类动物或免疫低下的动物接种杂交瘤后，使其腹水化，纯化采集的腹水。得到的抗体能够纯化至均勻。抗体的分离、纯化可以使用通常的对蛋白质使用的分离、纯化方法。例如，通过对亲和层析等的色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析、SDS聚丙 烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳等进行适当选择、组合，能够分离、纯化抗体((Antibodies =A Laboratory Manual. Ed Harlow andDavid Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)0 作为用于亲和层析的色谱柱，例如，可举出蛋白A色谱柱、蛋白G色谱柱。例如，作为蛋白A 色谱柱，可举出 Hyper D、POROS> Sepharose F. F (Amersham Biosciences 公司)。另夕卜，在 IgY和IgM的情况下，可以使用以巯基吡啶作为配体(Iigand)的色谱柱。进一步，不管抗 体的类型如何，也可以使用ADAM-15固相化色谱柱、离子交换色谱柱、疏水相互作用色谱柱 等。单克隆抗体的纯化，例如，可通过在离心分离后，采用蛋白A色谱柱或蛋白G色谱柱等 回收IgG组分来进行。2.人型嵌合抗体·人源化抗体、人源抗体的制备(1)人型嵌合抗体本发明的人型嵌合抗体，可通过如下方法得到制备编码来自非人动物单克隆抗 体的VH以及VL的DNA，所述单克隆抗体与ADAM-15结合并阻碍ADAM-15的功能，将该DNA 与来自人免疫球蛋白的恒定区cDNA结合，组入表达载体中，将该载体导入适当的宿主细胞 中使其进行表达(Morrison，S. L.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81，6851-6855，1984)。对来自非人动物单克隆抗体的VH以及VL进行编码的DNA，例如，可通过如下方法 得到。从产生该单克隆抗体的动物B细胞中提取mRNA。mRNA的提取可通过本领域技术人员 公知的方法来进行，例如，通过胍-超速离心法(guanidine ultracentrifugation method) (Chirgwin, J. Μ.等，Biochemistry，18，5294-5299，1979)、AGPC 法(Chomczynski, P 等， Analytical Biochemistry, 162，156-159，1987)等制备 RNA，然后，通过 mRNA 纯化试剂盒 (Purification Kit) ( 7 T ；^ ν T社制造，夕力，K 4才社制造)等进行纯化。通过使用 寡聚dT引物由提取的mRNA制备cDNA，组入载体中。使用来自非人动物单克隆抗体的一部 分作为探针，从组入到载体的cDNA中，分离出编码来自非人动物单克隆抗体的cDNA。通过 确定被分离的cDNA的碱基序列，能够得到对VH以及VL进行编码的目标DNA序列。另外，作为得到对来自非人动物单克隆抗体的VH以及VL进行编码的DNA的其他 方法，可举出如下方法。采用能够扩增VH或者VL的引物(例如，利用小鼠作为非人动物的 情况下，与小鼠H链恒定区(C区)杂交的引物以及与小鼠L链γ链恒定区的保守序列杂 交的引物等(R. Orlandi 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，86，3833，1989))，对通过上述方法 得到的cDNA，按照PCR法进行扩增，或者，从产生单克隆抗体的动物B细胞提取mRNA，采用 能扩增该VH或者VL的引物，对该VH或者VL，按照RT-PCR法进行扩增。从得到的PCR产物 中，提取目标DNA片段。作为目标DNA片段的提取，可通过如下方法进行例如，在琼脂糖凝 胶电泳后，切下显示目标DNA的大小的条带，从该凝胶切片中提取DNA。用限制酶处理该载 体以及提取的DNA后，将提取的DNA组入载体中，确定被组入的DNA所编码的DNA序列，由 此得到对VH以及VL进行编码的目标DNA序列。作为人型嵌合抗体的人源抗体CH以及CL，可以使用任意的人源抗体的CH以及 CL。例如，可举出人Y 1、Y 2的CH以及人κ的CL。作为编码人源抗体的CH以及CL的基 因，可以采用染色体DNA或者cDNA。通过上述方法得到的编码来自非人动物单克隆抗体的 VH以及VL的DNA，例如，分别与编码人源抗体的CH以及CL的DNA结合，组入动物细胞所用 的表达载体中，由此制备表达本发明的嵌合抗体的载体。
作为用于表达人型嵌合抗体的增强子以及启动子，可举出免疫球蛋白基因自身的 增强子和启动子或者非免疫球蛋白所用的增强子和启动子。例如，作为非人动物使用小鼠 的情况下，免疫球蛋白基因的表达调节机理在小鼠和人中是相同的，因此，可以通过含有存 在于J基因和C基因之间的小鼠或人的增强子序列的方式来制备重组DNA。作为动物细胞所用的表达载体，例如，可使用pSV2-gpt (R. C. Mulliganand P. Berg, Science，209，1422，1980)。通过上述方法制备的编码本发明的人型嵌合抗体的H 链以及L链的基因，可以组入同一载体中，也可以组入不同的载体中。(2)人源化抗体本发明的人源化抗体，可通过如下方法得到将编码与ADAM-15结合且阻碍 ADAM-15的活性的来自非人动物单克隆抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列，移植至人源 抗体的VH和VL的框架区(FR)，构建针对前述移植后的V区进行编码的DNA，将构建的DNA 与来自人免疫球蛋白的恒定区cDNA结合，组入表达载体中，将该载体导入适当的宿主细 胞中使其表达(参照L. Rieohmann 等，Nature，332，323，1988 ；Kettleborough, C. A.等， ProteinEng.，4，773—783，1991 ；Clark M.，Immunol.Today.，21，397—402，2000)。来自非人动物单克隆抗体的CDR，将由通过上述方法得到的对来自非人动物单克 隆抗体的VH和VL进行编码的DNA序列所预测的氨基酸序列，与已知抗体的VH和VL的全 部氨基酸序列进行对比，能得到各CDR的氨基酸序列。已知的抗体的氨基酸序列，例如，可 通过登记于蛋白数据库等的数据库的抗体的氨基酸序列来得到。另外，作为人源抗体的FR，只要移植后的抗体起到本发明的效果即可，并无特别限 制，优选为人源化抗体的V区形成与来自非人动物单克隆抗体的V区类似的空间结构的人 源抗体的FR，或者与使用的来自非人动物单克隆抗体的FR的氨基酸序列同源性高的人源 抗体FR。具有选择的人源抗体的FR的人源化抗体的V区是否形成与来自非人动物单克隆 抗体的V区类似的空间结构，例如可通过如下方法判断根据含有选择的人源抗体的FR的 V区的DNA序列信息，通过电脑模拟来预测空间结构，与使用的来自非人动物单克隆抗体的 V区的空间结构进行比较。使用的来自非人动物单克隆抗体的FR的氨基酸序列，可由根据 利用上述方法得到的编码VH和VL的DNA序列所预测的氨基酸序列以及CDR的氨基酸序列 的信息来得到。另外，为了制成人源化抗体的V区形成与来自非人动物单克隆抗体的V区 类似的空间结构的人源抗体的FR，或者与使用的来自非人动物单克隆抗体的FR的氨基酸 序列同源性高的人源抗体FR，也可以在得到的人源抗体的FR的氨基酸序列中适当地导入 变异。对所使用的人源化抗体的V区进行编码的DNA序列，设计成与下述氨基酸序列对 应的DNA序列，即，将来自非人动物单克隆抗体的CDR的氨基酸序列和人源抗体的FR的氨 基酸序列结合而成的氨基酸序列。编码人源化抗体的V区的DNA，可根据设计的DNA序列通 过本领域技术人员公知的方法来制备。例如，可通过如下方法得到根据设计的DNA以合成 DNA的方式化学合成长IOObp左右的DNA片段，通过PCR来扩增该DNA片段。另外，也可通 过如下方法得到采用连接酶等酶使该IOObp左右的DNA片段结合，采用对DNA序列两末端 序列进行编码的引物进行PCR，所述DNA序列对被设计的人源化抗体的V区进行编码，提取 所希望长度的DNA片段。此外，PCR中使用的编码人源化抗体的V区的DNA，也可以通过作为 CDR移植法而为人所知的方法来得到。另外，对使用的人源化抗体的V区进行编码的DNA也可通过如下方法得到通过定点突变将编码⑶R的DNA组入人源抗体的V区的DNA中。定 点突变可采用例如基因定点突变系统(GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System) (Invitrogen公司)、转化(Transformer)定点突变诱变试剂盒(Clontech公司)、定点突变 系统(Site-Directed Mutagenesis System)(夕力，广4才社)等，根据该试剂盒的说明 进行。作为人源化抗体的人源抗体CH以及CL，可使用任意的人源抗体的CH和CL。例如， 可举出人Y 1、Y2的CH和人κ的CL。作为编码人源抗体的CH和CL的基因，可采用染色 体DNA或cDNA。通过上述方法得到的编码人源化抗体的V区的DNA，例如，分别与针对人源 抗体的CH和CL进行编码的DNA结合，组入动物细胞用表达载体中，由此能制备表达本发明 的人源化抗体的载体。作为用于表达人源化抗体的增强子和启动子，可举出免疫球蛋白基因自身的增强 子和启动子，或者非免疫球蛋白用增强子和启动子。例如，作为非人动物使用小鼠的情况 下，免疫球蛋白基因的表达调控机理在小鼠和人中是相同的，因此，也能以含有存在于J基 因和C基因之间的小鼠或者人的增强子序列的形式来制备重组DNA。作为动物细胞所用的表达载体，例如，可使用pSV2_gpt (R. C. Mulligan and P. Berg, Science, 209,1422，1980)。通过上述方法制备的编码本发明的人源化抗体的H链 和L链的基因，可以组入同一载体，也可以组入不同的载体。上述人型嵌合抗体、人源化抗体的制备中所使用的来自非人动物的单克隆抗体， 只要是与ADAM-15结合并阻碍ADAM-15的活性的抗体即可，并无特别限制，优选为小鼠单克 隆抗体。(3)人源抗体人源抗体，例如，可通过利用人源抗体噬菌体文库或者产生人源抗体的转基因小 鼠来获得(富塚等，Nature Genet.，15，146-156 (1997))。人源抗体噬菌体文库，通过从具有来自人B细胞的各种序列的抗体基因库中将VH 基因和VL基因导入噬菌体基因中，将人源抗体的Fab或者scFV等以融合蛋白的形式呈 示于表面的噬菌体的文库。作为这种人源抗体噬菌体文库，可举出如下的免疫文库利用 RT-PCR从末梢血淋巴细胞等中扩增正常人所带有抗体的VH基因和VL基因，进行文库化而 得到的天然非免疫文库(剑桥抗体技术公司(Cambridge Antibody Technology)、英国医学 研究理事会(Medical Research Council)、Dyax公司等)；选择人B细胞内的功能性特定的 抗体基因，通过编码适当长度的任意的氨基酸序列的寡聚核苷酸对V基因片段的CDR3区等 的抗原结合区的部分进行取代，而经过文库化的合成文库(Biolnvent公司、Crucell公司、 Morphosys公司)；以及，由癌、自身免疫疾病或者感染症的患者、或者以对象抗原为疫苗而 接种的人的淋巴细胞所制作的文库。例如，天然人源抗体噬菌体文库可通过以下的方法制备。由人的末梢血制备mRNA， 采用对免疫球蛋白的Y、μ、κ、λ链的恒定区特异性的引物，合成V基因的cDNA，采用对 V基因家族特异性的DNA引物组合，合成各V基因，采用编码(Gly4Ser) 3等的接头肽的接头 DNA，通过PCR将它们进行连接，合成scFv基因。对两侧使用载体导入用的限制酶位点，将 合成的scFv基因插入到pCANTAb5E等噬菌粒载体(phagemid vector)中，将该载体转化到 大肠杆菌中，利用辅助噬菌体进行援助。
利用人源抗体噬菌体文库的情况下，例如，将作为靶的ADAM-15固定为固相，使其 与噬菌体抗体文库反应，洗涤除去未结合的噬菌体后，回收结合的噬菌体，由此能够得到期 望的克隆(淘筛法(panning))。另外，对所得到的噬菌体进行扩增，对于扩增的文库，进一 步重复进行淘筛，由此能够提高所得到的克隆的准确度。通过对所得到的克隆的VH基因和 VL基因进行解析，也能制备具有这些基因序列的完全的人源抗体。产生人源抗体的转基因小鼠，是对已敲除内源性免疫球蛋白(Ig)基因的小鼠导 入人源抗体的Ig基因后的小鼠。产生人源抗体的转基因小鼠，例如可通过以下的方法得 到。通过对人-小鼠杂交细胞进行48小时的秋水仙胺(纺锤丝形成的抑制剂)处理，形成 由核膜包裹1至数条染色体的结构体即微细胞。在细胞松弛素B的存在下，将分离出来的 微细胞与染色体受容细胞(小鼠ES细胞)通过聚乙二醇融合，制备微细胞杂交ES细胞，注 入到小鼠胚胎中。以产生人源抗体的转基因小鼠作为免疫动物，根据上述的抗ADAM-15抗体制备方 法对抗原进行免疫，由此能够得到抗ADAM-15人源抗体。3.抗体片段的制备本发明的抗体的片段(F(ab' )2、Fab'、Fab、scFv、dsFv或它们的聚合物、 Diabody、或者含⑶R的肽)，可通过以下的方法制备。本发明的F(ab' )2片段，用作为蛋白分解酶的胃蛋白酶处理结合于本发明的 ADAM-15的IgG抗体，在H链的第234号氨基酸残基上切割，由此能得到作为分子量约为10 万的具有抗原结合活性的抗体片段。另外，本发明的F(ab' )2片段可通过使后述的Fab' 进行硫醚键或者二硫键结合来得到。本发明的Fab'片段，通过用二硫苏糖醇作为还原剂对利用上述方法得到的本发 明的结合于ADAM-15的F(ab' )2进行处理来得到。另外，本发明的Fab'片段可通过如下 方法得到将编码本发明的结合于ADAM-15的抗体的Fab'的DNA插入表达载体中，将该载 体导入宿主细胞使其表达。本发明的Fab片段，用作为蛋白分解酶的木瓜蛋白酶对本发明的结合于ADAM-15 的抗体进行处理，在H链的第224号的氨基酸残基上切断，得到H链的N末端侧的约一半的 区域和L链的整个区域通过二硫键进行结合的、分子量约5万的、具有抗原结合活性的抗体 片段。另外，本发明的Fab片段可通过如下方法得到将编码本发明的结合于ADAM-15的抗 体的Fab的DNA插入表达载体，将该载体导入宿主细胞中使其表达。本发明的scFv可通过如下方法得到取得编码本发明的结合于ADAM-15的抗体的 VH和VL的cDNA，在这些基因之间插入编码接头序列的DNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA 插入表达载体中，将该载体导入宿主细胞中，使其表达。接头的长度只要是能够使VH和VL 缔合的长度即可，并无特别限制，优选为10 20残基，更优选为15残基。另外，接头的序 列只要是不阻碍VH和VL的两个结构域的多肽链的折叠即可，并无特别限制，优选为由甘氨 酸和/或丝氨酸构成的接头，更优选为GGGGS (G 甘氨酸；S 丝氨酸)或其重复序列。本发明的dsFv可通过如下方法得到通过定点突变将VH和VL中的各1个氨基酸 残基取代为半胱氨酸，以该半胱氨酸残基间的二硫键来使VH和VL结合。取代的氨基酸只 要是基于空间结构对抗原结合没有影响的氨基酸残基即可，并无特别限制。本发明的Diabody可通过如下方法获得在编码上述scFv的DNA中，构建成接头的氨基酸序列为8个残基以下(优选为5个残基)，将该DNA插入表达载体中，将该载体导 入宿主细胞中，使其表达。双特异性抗体的Diabody可通过组合2种不同的scFv的VH和 VL的DNA来制备scFv而得到。本发明的含⑶R的肽可通过如下方法得到构建编码本发明的与ADAM-15结合的 抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列的DNA，将该DNA插入表达载体，将该载体导入宿主细 胞，使其表达。4.对于识别ADAM-15的去整合素结构域并且不识别ADAM-15的去整合素结构域内 的RGD序列的抗体等的选择本发明的结合于ADAM-15的抗体等，可通过在按照上述方法所得到的抗体等之 中，选择识别期望的抗原决定簇的抗体等来得到。另外，本发明的识别ADAM-15的抗体等， 可通过在上述抗ADAM-15抗体制备方法中，作为抗原将具有期望的抗原决定簇序列(优选 为去整合素结构域序列)的肽进行投药来得到。识别ADAM-15的去整合素结构域的抗体等，可通过本领域技术人员所公知的方法 来选择而获得。例如，识别ADAM-15的去整合素结构域的抗体等，可通过对ADAM-15的去整 合素结构域肽和由上述方法得到的抗体等的结合活性进行测定，选择结合活性高的抗体等 来得到。作为本发明的抗ADAM-15抗体等和ADAM-15的去整合素结构域的结合中的结合常 数(Ka)，例如至少为lOl1，优选至少为lOl1，更优选至少为IO9MA作为这种结合常数，进 一步优选为IOkTiUO11M-1UO12M-1或更高的常数，例如IO13M4或比之还高的常数。另外，识 别ADAM-15的去整合素结构域的抗体等可通过如下方法得到在构成ADAM-15的氨基酸中， 制备在ADAM-15的去整合素结构域中导入有丙氨酸突变的全长ADAM-15变异体或ADAM-15 变异体片段，对该变异体等和通过前述方法得到的抗体等的结合活性进行测定，比较该抗 体等和全长ADAM-15或者ADAM-15片段的结合活性，选择与变异体的结合活性低的抗体等。识别ADAM-15的去整合素结构域并且不识别ADAM-15的去整合素结构域内的RGD 序列的抗体等可通过如下方法得到从通过前述方法得到的ADAM-15的去整合素结构域的 抗体等之中，通过本领域技术人员公知的方法来选择不识别ADAM-15的去整合素结构域内 的RGD序列的抗体等。例如，识别ADAM-15的去整合素结构域并且不识别ADAM-15的去整 合素结构域内的RGD序列的抗体等可通过如下方法获得针对在构成ADAM-15的氨基酸中 的ADAM-15的去整合素结构域内的RGD序列的至少1个氨基酸中导入丙氨酸突变的全长 ADAM-15变异体或ADAM-15变异体片段进行制备，对该变异体等与所得到的抗体等之间的 结合活性进行测定，和与全长ADAM-15或者ADAM-15片段之间的结合活性进行比较，选择结 合活性没有变化的抗体等。5.对识别ADAM-15的去整合素结构域并且不识别ADAM-15的去整合素结构域内的 环区的抗体的选择识别ADAM-15的去整合素结构域并且不识别ADAM-15的去整合素结构域内的环区 的抗体等，可通过如下方法得到从通过前述方法得到的识别DAM-15的去整合素结构域的 抗体等中，通过本领域技术人员公知的方法，选择不识别ADAM-15的去整合素结构域内的 环区的抗体等。例如，识别ADAM-15的去整合素结构域并且不识别ADAM-15的去整合素结 构域内的环区的抗体等，可通过如下方法得到针对在构成ADAM-15的氨基酸中在ADAM-15 的去整合素结构域内的环区的至少1个氨基酸中导入丙氨酸突变的全长ADAM-15变异体或ADAM-15变异体片段进行制备，对该变异体等和所得到的抗体等之间的结合活性进行测定， 和与全长ADAM-15或者ADAM-15片段之间的结合活性进行比较，选择结合活性没有变化的 抗体等。所得到的抗体同ADAM-15或者其片段或它们的变异体之间的结合，可通过本领域 技术人员公知的方法来测定。作为这种方法，例如，可举出蛋白质印迹法、X射线结晶解析 以及 Biacore ( ^ r ζχ 7 )系统( ' 7 ^ 7 社(Biacore 公司))。6. ADAM-15和整合素α ν β 3依赖性细胞粘附的抑制活性测定例如，在所得到的抗体的存在下/不存在下，针对整合素α νβ 3表达细胞对固定 有ADAM-15重组蛋白质的平板的结合进行比较，由此调查所得到的抗体是否抑制ADAM-15 和整合素α νβ 3依赖性细胞粘附。作为对照，通过在抗整合素α νβ 3抗体的存在下/不 存在下，测定整合素α νβ 3表达细胞对固定有ADAM-15重组蛋白质的平板的结合，可知测 定的细胞粘附是否是整合素α νβ 3依赖性细胞粘附。7. ADAM-15和整合素α 9 β 1依赖性细胞粘附例如，在得到的抗体的存在下/不存在下，针对整合素α 9β 1表达细胞对固定有 ADAM-15重组蛋白质的平板的结合进行比较，由此调查所得到的抗体是否抑制ADAM-15和 整合素α νβ 3依赖性细胞粘附。作为对照，通过在抗整合素α 9β 1抗体的存在下/不存 在下，测定整合素α 9β 1表达细胞对固定有ADAM-15重组蛋白质的平板的结合，可知测定 的细胞粘附是否是整合素α 9β 1依赖性细胞粘附。5.药物组合物所得到的抗体等，通过抑制ADAM-15和整合素的结合，能够阻断信息在细胞内的 信号传递，因此，能够用作与这种信号相关的疾病的治疗药。采用表达有ADAM-15和整合素 的细胞或癌细胞，通过在体外或体内观察在所得到的抗体等的存在下的结合抑制，能够发 现本发明的抗体等的对象疾病。以本发明的抗体等(尤其是单克隆抗体)作为有效成分的制剂，可用作以下疾病 的治疗药(therapeutic agent)或者预防药(prophylactic agent)癌(食道癌、甲状腺 癌、膀胱癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、胸部癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞 瘤、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肾母细胞瘤)以及其转移、子宫内膜异位症等的细胞增殖或 新血管形成所引起的疾病；关节炎、传染病(肝炎等)、支气管哮喘、纤维化症、自身免疫疾 病(例如，系统性红斑狼疮(SLE)、多发性肌炎(PM)、自身免疫性甲状腺疾病、肾小管间质性 肾炎、重症肌无力(EAMG)、器官特异性自身免疫病等)、类风湿性关节炎(慢性类风湿关节 炎(RA)、变形性关节炎(OA))、多发性硬化(复发-缓解型多发性硬化等)、炎症性肠病(溃 疡性结肠炎、克罗恩病等)、进行性系统性硬化症(PSS)、干燥综合征、皮肌炎(DM)、结节性 动脉周围炎(PN)、甲状腺疾病(格雷夫斯病等)、格林_巴利综合征、原发性胆汁性肝硬化 (PBC)、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、肌萎缩侧索硬化(ALS)、I型糖 尿病、移植时的排斥反应、手术后的粘连、子宫内膜异位症、牛皮癣、狼疮、过敏、哮喘、中性 粒细胞功能异常等炎症性疾病或细胞迁移所引起的疾病；血管重建手术后再狭窄、心脏冠 动脉血管闭塞性疾病、脑血管闭塞性疾病、肾血管闭塞性疾病、末梢血管闭塞性疾病、动脉 硬化、脑梗塞等血管闭塞性疾病或血管内膜增生所引起的疾病等。通过上述方法得到抗体等，根据需要纯化后，基于常规方法制剂化，可用作各种疾病等的预防和/或治疗剂。将本发明的抗体用作药物时，作为给药部位，可举出口服给 药、口腔注射、气管灌注、皮下给药、肌肉注射、血管内(静脉内)给药。本发明的抗体可 以单独给药，也可以以使用有制药上和药理学上可接受的载体(参照《药品添加物百科 词典》药事日报社(「医薬品添加物事典」薬事日報社、“Handbook of Pharmaceutical Excipients”APhA Publications))、稀释剂或添加剂等的药物组合物的形式来给药。另外， 本发明的药物组合物以非口服给药或适于口服给药的剂型来提供。作为用于非口服给药的组合物，例如，可举出注射剂、滴鼻剂、栓剂、贴剂、软膏等。 注射剂包括静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂型。这种注 射剂可按照公知的方法，例如，通过将上述抗体等在通常用于注射剂的无菌的水性或油性 液体中溶解、悬浮或者乳化来制备。作为注射用的水性液，例如，可使用生理盐水、葡萄糖、 蔗糖、甘露醇、其他辅助药的等渗溶液等，可以与适当的增溶剂(例如，醇(例如，乙醇)、多 元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇))、非离子表面活性剂(例如，聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯 20>HC0-50 (polyoxyethylene (50mol) adduct of hydrogenated castor oil 氧化蓖麻油的 聚氧乙烯(50mol)加合物)等并用。作为油性液，例如，可使用芝麻油、大豆油等，可以与作 为增溶剂的苯甲酸苄酯、苯甲醇等进行并用。制备的注射液，通常填充于适当的安瓿、小瓶、 注射器中。用于直肠给药的栓剂，通过将上述抗体混合于通常的滴鼻剂用基质、栓剂用基质 来制备。另外，也可以通过对上述抗体添加适当的赋形剂，制备冷冻干燥剂，在应用时用注 射用水、生理盐水等溶解制成注射液。通常，抗体等蛋白质的口服给药会被消化器分解，因 此难以应用。然而，通过在抗体片段或修饰的抗体片段和剂型上想办法，也可能进行口服给 药。作为口服给药的制剂，例如，可举出微囊剂型、片剂、糖浆剂、颗粒剂等。上述非口服用药物组合物，最好制备成适合活性成分的给药量的单位剂量给药的 剂型。作为这种单位剂量给药的剂型，可例示注射剂(安瓿、小瓶、预装药物注射器)、滴鼻 剂、栓剂等，各自的单位剂量给药剂型通常为5 500mg，理想情况是，如果是注射剂则含有 5 IOOmg的上述抗体等，如果是其他剂型，则含有10 250mg的上述抗体等。本发明的药物组合物的给药量，可根据给药对象、对象疾病、症状、给药途径等进 行适当选择，例如，用于对癌患者进行预防和/或治疗时，本发明的抗体的单次给药量通常 可通过静脉注射给与0. 01 20mg/kg体重左右，优选为0. 1 10mg/kg体重左右，进一步 优选为0. 1 5mg/kg体重左右，给药次数为1个月1 10次左右，优选为1个月1 5次 左右。其他的非口服给药和口服给药的情况下，也能够给与以此为准的量。症状特别重的 情况下，也可根据该症状增加给药量或者给药次数。6.诊断药本发明的抗体等，可特异性地识别ADAM-15，因此，可用于被检液中的ADAM-15的 定量。具备本发明的抗体等的诊断药，可用于以下疾病的诊断药例如，炎症性疾病(例如， 类风湿关节炎、肝炎)、支气管哮喘、纤维化症、糖尿病、癌转移、动脉硬化、多发性硬化、肉芽 肿等，或者脏器移植后的慢性排斥反应抑制、全身性自身免疫疾病 系统性红斑狼疮 葡萄 膜炎·贝切特氏病·多发性肌炎·系膜增生性肾炎·结节病等自身免疫疾病。本发明的 诊断药可以基于使用抗体分子的公知的方法。作为这种方法，例如，可举出ELISA(Catty， Raykundalia，1989)、放射免疫测定(Catty，Murphy，1989)、免疫组织化学的方法(Heider 等，1993)、免疫测量法或者蛋白质印迹法等。作为本发明的诊断药的检验用材料，例如，可
20使用从被验者处采集的组织试样或者液体作为活检体。使用的活检体只要是成为ADAM-15 的免疫学测定的对象的物质即可，并无特别限制，例如，可举出组织、血液、尿、血清、脊液、 关节液、眼房水、泪液、唾液或它们的分级物或者处理物。利用本发明的诊断药的分析可定 性地、定量地或者半定量地进行。为了将得到的抗体用作诊断药，例如，可通过公知的方法或市售的试剂盒进行各 种标记化(例如，生物素标记、FITC标记、APC标记)。作为这种标记，优选为使用有生物素 标记试剂盒(Biotin Labeling Kit)(同仁化学公司)的生物素标记。当将这些各个免疫学的测定法应用于本发明的测定方法时，不需要设定特别的条 件、操作等。在各个方法中的通常的条件、操作法中添加本领域技术人员的通常的技术性考 虑，构建测定体系即可。关于这些一般的技术手段的详细说明，可以参照总论、已出版书籍 内容等。如上所述，通过采用本发明的抗体等，可以以良好的灵敏度对ADAM-15定量。进一 步，通过利用采用本发明的抗体等的在生物体内的ADAM-15的定量法，能够诊断与ADAM-15 相关的各种疾病的预知、有无、程度、预后、医药品的效果等。例如，在检测出ADAM-15的浓 度增减的情况下，能够诊断为与ADAM-15相关的疾病(如炎症性疾病)的可能性高或者将 来罹患的可能性高。另外，本发明的抗体等，可以在用于纯化ADAM-15的抗体柱的制备、纯化时的各组 分所含的ADAM-15的检测、被检细胞内的ADAM-15的特性变化的分析等中使用。以下，为了更详细地说明本发明，例示实施例，但是，本发明不限于此。在以下的实施例中没有特别说明的情况下，作为细胞培养用的培养基，使用以下 的培养基。培养CHO-Kl细胞时，使用含有5% FCS的D-MEM Ham' sF-12培养基(和光 纯药)；培养使人α 9整合素稳定地表达的CHO细胞(ha9/CH0)时，使用含有600 μ g/mL G418,5% FCS的D-MEM Ham' s F-12培养基；培养人肾癌细胞株(NRC-12)和人乳癌细胞 株(MDA-MB-435S :435S)时，使用含有10% FCS的TIL培养基(IBL公司)；培养C0S-7细胞 时，使用含有10% FCS的D-MEM培养基(和光纯药)。实施例(实施例1)人α9整合素稳定表达株的制备人α 9整合素基因是按如下方法克隆的采用ReverTraAce (东洋纺织株式会 社)，由提取自G361细胞的总RNA合成cDNA，以该cDNA为模板进行PCR。人α 9整合素基 因的克隆，分为5'端片段和3'端片段，使用以下引物进行。人α 9整合素基因5'端片段正义引物5'-TTTTAAGCTTGCCACCATGGGCGGCCCGGCTG-3'(序列号 1)反义引物5'-AAACTGCAGTCCGGAGCACTGGATTTATCTTCT-3'(序列号 2)人α 9整合素基因3'端片段正义引物5'-AAATCCGGATGTTTGGTCCATATC-3‘(序列号 3)反义引物5'-AAATCTAGATCACTGGTTTTTCTGGACCCAGTC-3'(序列号 4)人ci9整合素基因5'端片段的PCR产物使用HindIII和Pstl，3'端片段的PCR 产物使用EcoRV，在37°C下限制酶处理1小时，将各产物组入pBluescript SK(+)载体 (Stratagene公司)，进行质粒提取(5'端片段α 9F/pBS，3'端片段α 9R/pBS)。对这些
21质粒使用AccIII和XbaI在37°C下限制酶处理1小时。纯化α 9R片段，连接到α 9F/pBS 的AccIII和XbaI部位。使用HindIII和XbaI对该质粒进行限制酶处理，切出插入部位， 导入 pcDNA3. 1 (+)载体(Invitrogen 公司)(α 9/pcDNA3. 1 (+))。使用Lipofectamine-2000 (Invitrogen 公司)将 α 9/pcDNA3. 1 (+)基因转染至 CHO-Kl细胞中，通过如下培养基挑选出抗药性细胞含有Geneticin G418 (Invitrogen公 司)600μ g/ml, 10% FCS(SIGMA-Aedrich 公司)的 DMEM Ham' sF_12(和光纯药)。被挑 选出的细胞通过流式细胞仪筛选，并经过反复有限稀释，确立出稳定表达人α 9整合素的 CHO-Kl细胞(以下，称为“ha9/CH0细胞”)。(实施例2)人ADAM-15去整合素结构域/pGEX_6P_l的制备通过PCR法复制人ADAM-15去整合素结构域的DNA链。以HUVEC的cDNA IyL为模 板，分别将0. 5 μ L的100 μ M正义引物禾口 100 μ M反义引物、8 μ L的2. 5mM dNTP mix、0. 5μ L 的 EX-Tag 聚合酶(2. 5U/100y L :Takara 公司)、10 μ L 的 10 XPCR 缓冲液，加入至Ij 79. 5 μ L 超纯水中，制备PCR反应液。使用热循环仪，以如下热循环进行PCR反应94°C 5分钟1循 环，94°C 1分钟、55°C 1分钟、72°C 1分钟35循环，72°C 5分钟1循环。使用的引物如下。正义引物5'-CCTATGGCTGCTTTCTGC-3‘(序列号 5)反义引物5'-CATGCACACAGCTTGCCC-3‘(序列号 6)将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，切出目的条带，使用DNA纯化试剂盒(Wizard SV Gel and PCR Cl earn-up System :PR0MEGA 公司)进行纯化。将制备的 DNA 链通过 TA 克隆进行复制。TA克隆的方法如下。将IyL的PCR产物、0. 5yL的pCRII-TOPO载体 (Invitrogen 公司)、1 μ L 的盐溶液(salt solution) (Invitrogen 公司)，力口入至Ij 3. 5 μ L 的灭菌水中，调节反应液，室温静置5分钟后，转化入JM-109中。以这样制备的人ADAM-15 去整合素结构域/Τ0Ρ0为模板，在人ADAM-15去整合素结构域的DNA链上添加BamHI/XhoI 部位。将0. 5yL的模板DNA、各0. 2yL的100 μ M正义引物和100 μ M反义引物、8 μ L的 2. 5mM dNTP mix、0. 5μ L 的 EX-Tag 聚合酶(2. 5U/100y L Takara 公司)、10μ L 的 10XPCR 缓冲液，加入到80. 6μ L的超纯水，调节PCR反应液。使用热循环仪，以如下热循环进行PCR 反应94°C 5分钟1循环，94°C 1分钟、53°C 1分钟、72°C 30秒钟35循环，72°C 5分钟1循 环。使用的引物如下。正义引物5'-AAGGATCCGCTGCTTTCTGCGGA-3‘(序列号 7)反义引物5'-ATTCTCGAGATCCCCTAGGCTGACAT-3‘(序列号 8)将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，切出目的条带，使用DNA纯化试剂盒(Wizard SV Gel and PCR Cl earn-up System :PR0MEGA公司)进行纯化。将制备的DNA链，插入到 用BamHI/XhoI限制酶处理过的pGEX_6P_l载体。将其转化入JM-109，进行复制。之后，使 用midi prep试剂盒(QIAGEN公司)进行纯化。(实施例3)人ADAM-15去整合素结构域-GST蛋白质的制备将在实施例2中制备的人ADAM-15去整合素结构域/pGEX_6P_l转化入JM-109， 在添加了氨苄青霉素(SIGMA-Ardrich)的LB培养基中进行培养，通过在对数生长期添加 200 μ M IPTG(Amersham Bioscience公司)，诱导GST融合蛋白质的表达。回收大肠杆菌后， 悬浮于 NETN-150 缓冲液(50mM Tris ρΗ7· 2，ImM EDTA, 150mM NaCl，0· 5% NP-40)，通过超 声波破碎提取蛋白质。离心后，将其上清液添加到谷胱甘肽琼脂糖凝胶微珠4B(AmershamBioscience公司)，在4°C下颠倒混合2小时。将微珠用NETN-100缓冲液(50mM Tris pH7. 2, ImM EDTA, IOOmM NaCl,0. 5% NP-40)洗涤，用还原型谷胱甘肽溶液(IOOmM Tris pH8.8，20mM还原型谷胱甘肽(和光纯药))洗脱，由此制成GST融合蛋白质。另外，在制备 切断了 GST的蛋白质时，在使由大肠杆菌表达的蛋白质吸附到谷胱甘肽琼脂糖凝胶微珠之 前，用同样的方法进行，用NETN-100缓冲液洗涤微珠后，用prescission蛋白酶(Amersham Bioscience公司)进行酶处理以切断GST。(实施例4)人ADAM-15去整合素结构域蛋白质(RAA取代产物)的制备将人ADAM-15去整合素结构域中的RGD序列取代为RAA序列的蛋白质(以下，称为 “人ADAM-15去整合素结构域蛋白质(RAA取代产物)”)通过以下方法制备。以在实施例2 中制备的人ADAM-15去整合素结构域/pGEX-6P-l为模板，分别将1. 25 μ L的100 μ g/ml的 正义引物和 100 μ g/ml 的反义引物、1 μ L 2. 5mM dNTP mixU μ L pfu turbo 聚合酶(2. 5U/ μ 、5μ 10XPCR缓冲液加入到40. 4μ L超纯水中，制备PCR反应液。使用热循环仪，以 如下热循环进行PCR反应95°C 30秒钟1循环，95°C 30秒钟、55°C 1分钟、68°C 5分钟30 秒钟18循环，72°C 7分钟1循环。使用的引物如下。正义引物5'-CAGTGTCCTACCAGAGCTGCTTGTGACTTGCCTG-3'(序列号 9)反义引物5'-CAGGCAAGTCACAAGCAGCTCTGGTAGGACGACACTG-3'(序列号 10)其后，根据QuickChange 定点突变试剂盒(Site-Directed Mutagenesis Kit) (Invitrogen公司)手册，用DpnI进行限制酶处理，插入到pGEX_6P_l载体。将其转化入 JM-109，进行复制。然后，用midi pr印试剂盒(QIAGEN公司)纯化。之后，通过与实施例 3同样的方法制备GST融合蛋白质，用prescission蛋白酶对GST进行酶处理，制备去除了 GST的人ADAM-15去整合素结构域蛋白质(RAA取代产物)。(实施例5)抗人ADAM-15去整合素结构域单克隆抗体(8F7)的制备将在实施例3中制备的人ADAM-15去整合素结构域-GST蛋白质对BALB/c小 鼠(雌性，7周龄SAMKYO LABO SERVICE CORPORATION)进行共计4次的免疫。初次，将 IOOyg蛋白质用弗氏完全佐剂(SIGMA公司)乳化，此后，将50 μ g蛋白质用弗氏不完全佐 剂(SIGMA公司)乳化，对小鼠进行免疫。4次免疫后，从小鼠身上采血，采用其血清，通过 ELISA进行抗体免疫效价测定。然后，将50μ g的蛋白质溶解于PBS，进行补加免疫。免疫后，从小鼠身上摘取脾脏，采用聚乙二醇(IBL公司)，使脾细胞和 X63-Ag8-653骨髓瘤细胞进行细胞融合。然后，用HAT培养基进行选择培养，确认形成杂交 瘤细胞的菌落后，采用其培养上清液，通过ELISA法鉴别对抗原蛋白质的结合性。在ELISA 法中，将人ADAM-15去整合素结构域-GST蛋白质固定于各孔50ng固相作为抗原，作为一次 抗体采用稀释了 2倍的杂交瘤细胞的培养上清液。通过对阳性菌落有限稀释2次，得到单 一克隆。用抗原柱对所得到的克隆的培养上清液进行纯化，确立单克隆抗体(克隆名8F7 ； 以下称作“8F7”)。产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞，在2008年2月13日以受理号FERM ABP-10950 (保藏号FERM BP-10950)，保藏于茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6 (邮 编305-8566)、独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心。通过ELISA法确认制备的8F7的抗原特异性。在ELISA法中，将GST、人ADAM-15 去整合素结构域-GST蛋白质、人ADAM-15去整合素结构域环区-GST蛋白质、人ADAM-15去 整合素结构域蛋白质、人ADAM-15去整合素结构域蛋白质(RAA取代产物)以及小鼠骨桥蛋白N-半GST蛋白质，分别从10μ g/mL开始进行系列稀释，固定于固相。作为一次抗体，采 用调节成0. 1 μ g/mL的8F7。结果示于图1。在利用ELISA法进行研究时，虽然对GST显示 交叉反应，但是其反应微弱。另一方面，确认出对人ADAM-15去整合素结构域-GST的反应 强。此外，在去整合素结构域内，对于被认为与整合素的粘附所必需的环区(以下，称为“环 区”)，显示出不结合。另外，通过蛋白质印迹法确认出制备的8F7的抗原特异性。用XhoI和BamHI对人 ADAM-15/p0TB7(从Invitrogen公司购入)进行限制酶处理，重组于经过同样限制酶处理 的pcDNA3. 1 (+)载体(Invitrogen公司)。将其转化于JM-109，进行复制。然后，采用midi prep试剂盒(QIAGEN公司)进行纯化，由此得到人ADAM_15/pcDNA3. 1 (+)。将C0S-7细胞 在6cm培养板上培养至8成汇合，采用添加有4 μ g的人ADAM-15/pcDNA3. 1⑴和20 μ L的 Lipofectamine-2000 (Invitrogen 公司)的 3mL 的 0ΡΤΙ-ΜΕΜ 培养基(GIBC0 公司)，在 37°C 下培养6小时。然后，换成3mL的含10% FCS的DMEM培养基，在37°C下培养48小时，由此 得到导入人ADAM-15的C0S-7细胞。用含有蛋白酶抑制剂(complete mini =Roche公司)的LIPA缓冲液，对所制备的 暂时地过量表达ADAM-15的C0S-7细胞以及未导入基因的C0S-7细胞进行溶解，以10% SDS 对细胞溶解液进行电泳，转印于PVDF膜(MILLIP0RE)。对于转印的PVDF膜，通过5%脱脂 奶/TBS-T在室温下进行1小时的封闭反应，然后，用TBS-T洗涤3次，添加在实施例5中制 备的8F7 (0. 5 μ g/mL)，在4°C下反应一夜。用TBS-T洗涤3次，添加稀释10000倍的二次抗 体(anti-mouse IgG HRP 标记Jackson immunoresearch 公司)，在室温下反应 1 小时。用 TBS-T洗涤3次，在室温下使其与ECL溶液(GEimaginationatwork公司)反应5分钟，在暗 室下转印到膜上，进行显影。结果示于图2中。在利用蛋白质印迹法进行研究时，仅在暂时地过量表达人 ADAM-15的C0S-7的细胞溶液中检测到条带，由此体现了 8F7特异性地识别人ADAM-15。(实施例6)对于抗ADAM-15单克隆抗体23G9和8F7的结合活性的比较通过与前述ELISA法同样的方法，对市售的抗ADAM-15单克隆抗体即23G9 (R&D公 司)和8F7的结合活性进行比较。结果示于图3中。8F7对于ADAM-15的去整合素结构域，显示出不依赖于RGD序 列的高的结合活性。另一方面，就23G9而言，对人ADAM-15去整合素结构域(d. d.)以及人 ADAM-15去整合素结构域-GST蛋白质(d. d. -GST)的结合活性，低于对GST的结合活性，由 此显示出不识别ADAM-15的去整合素结构域。因而可以看出，8F7通过与不同于此前所知的 抗ADAM-15抗体的结合部位结合，而具备此前未发现的通过阻碍ADAM-15而获得的各种功 能。(实施例7)采用hα 9/CH0细胞的细胞粘附以及细胞粘附抑制试验用PBS，将除去了 GST的人ADAM-15去整合素结构域重组蛋白质、或者人ADAM-15 去整合素结构域蛋白质(RAA取代产物)配制成O 5 μ g/mL,以各孔50 μ L的添加量添加 于96孔板的各孔中，在37°C下孵育1小时，使其固相化。然后，在各孔中各加入200 μ L的 0. 5% BSA/PBS，在室温下孵育1小时，进行封闭反应。用PBS洗涤后，用含有0. 25% BSA的 培养基(D-MEMHam' sF-12)将在实施例1中制备的h α 9/CH0细胞或者未进行基因导入的 CH0-K1细胞调节至1 X 105cells/mL,在各孔中各添加200 μ L，在37°C下孵育1小时，使其与固定于固相上的蛋白质粘附。然后，用预先保温于37°C的PBS洗涤，除去未粘附的细胞。在 各孔中各添加50 μ L的结晶紫，在室温下孵育30分钟，对细胞进行固定、染色。用自来水洗 涤后，向各孔中各添加100 μ L的20%乙酸水，溶解细胞后，用酶标仪测定590nm的吸光度。用与细胞粘附试验同样的方法，使除去了 GST的人ADAM-15去整合素结构域重组 蛋白(调节成2.5yg/mL)固相化，进行封闭反应。在通过阻碍ADAM-15以抑制细胞粘附活 性的试验中，对固相化了的蛋白质添加浓度从0 10 μ g/mL被系列稀释的8F7。在37°C下 孵育20分钟，使细胞粘附。然后，用与细胞粘附试验同样的方法研究细胞粘附。将h α 9/CH0细胞和未进行基因导入的CHO-Kl细胞(空白对照)对人ADAM-15去 整合素结构域(以下，称为“d. d. ”)以及人ADAM-15去整合素结构域(RAA取代产物)(以 下，称为“d. d. -RAA”)的粘附试验的结果示于图4A中。就h α 9/CH0细胞而言，在将d. d.固 定化的情况下，细胞粘附活性依赖于其固相化浓度而增高。另外，就h α 9/CH0细胞而言， 在将d. d. -RAA固相化的情况下，显示出与固相化d. d.的情况几乎相同的细胞粘附活性， 由此显示出，h α 9/CH0细胞和d. d.的相互作用不依赖于d. d.的RGD序列。此处，CHO-Kl 细胞内在表达α νβ 1整合素、α νβ 5整合素、α 5 β 1整合素等结合于RGD序列的整合素 (Eto, K. , Huet, C. , Tarui, Τ. , Kupriyanov, S. , Liu, H. Ζ. , Puzon-McLaughlin, W. , Zhang, Χ. P. , Sheppard, D. , Engval 1, Ε. , and Takada, Y. Functional classification of ADAMs based on a conserved motif for binding to integrin alpha 9beta 1implications for sperm-egg binding and other cell interactions. J Biol Chem,277 :17804-17810, 2002)。因而，针对CH0-K1细胞对d.d.或d.d.-RAA固相化表面的细胞粘附是否与这些整 合素有关进行了研究。结果，未进行基因导入的CH0-K1细胞与d.d.或d.d.-RAA有无固相 化无关，显示出低的细胞粘附活性。由此认为，ha 9/CH0对ADAM-15去整合素结构域固相化 表面的粘附是经由a 9整合素的粘附。另外，就ha9/CH0对ADAM-15去整合素结构域固相 化表面的粘附而言，即使有d. d. -RAA存在也不减少，由此认为，经由a 9整合素和ADAM-15 去整合素结构域的粘附不依赖于ADAM-15去整合素结构域的RGD序列。另外，将利用8F7抗体抑制h a 9/CH0细胞对d. d.或d. d. -RAA固相化表面的粘附 的试验结果示于图4B中。8F7抗体抑制h a 9/CH0对d. d.和d. d. -RAA的细胞粘附，该抑制 具有浓度依赖性。由前述结果确认，ha9/CH0对d.d.或d.d.-RAA固相化表面的粘附是经 由a 9整合素的粘附，由此确认出8F7抑制人ADAM-15和人a 9 β 1整合素的相互作用。(实施例8)人肾癌细胞株NRC-12细胞中的整合素的表达为了采用人肾癌细胞株NRC-12细胞，研究能否抑制8F7的RGD非依赖性的粘附， 而通过流式细胞仪确认NRC-12细胞中的整合素的表达。用0. 5% BSA、0. 01NaN3/PBS (FACS 缓冲液)将细胞调节至5X106/mL，在96孔V底板的各孔中各添加IOOmL,用平板离心机 回收细胞。然后，在各孔中各添加IOOmL的CFBS，在冰上孵育30分钟，由此，封闭细胞膜 表面上的Fc受体。添加0. 5 μ g的一次抗体，在冰上孵育20分钟。用FACS缓冲液洗涤2 次后，在各孔中各添加100 μ L的稀释200倍的二次抗体(抗小鼠IgG FITC标记Jackson immunoresearch公司)，在冰上孵育20分钟。用FACS缓冲液洗涤2次后，在各孔中各添加 20 μ L的7-AAD (50 μ g/mL)，在冰上孵育20分钟。用FACS缓冲液洗涤3次后，使细胞通过 筛网，最终，溶解于500yL的FACS缓冲液。然后，采用FACS Calibur流式细胞仪(日本贝 克顿-迪金森公司=Becton,Dickinson and Company)，检测 FL-1，用 cell quest 软件进行解析。结果示于图5中。人肾癌细胞株NRC-12细胞中并未发现α9β1整合素的表达， 而表达有α νβ 3整合素、α 5β1整合素等结合于RGD序列的整合素。(实施例9)采用人肾癌细胞株NRC-12细胞的细胞粘附和细胞粘附抑制试验通过与实施例6同样的方法，测定人肾癌细胞株NRC-12细胞株对d.d.、固定 化的d. d.和合成肽(GRGDS)的混合物(d. d. +GRGDS)、d. d.和合成肽(GRGES)的混合物 (d. d.+GRGES)、合成肽(GRGDS)与BSA(牛血清蛋白)结合的物质(GRGDS-BSA)、合成肽 (GRGDS)与BSA (牛血清蛋白)结合的物质和合成肽(GRGDS)的混合物(GRGDS-BSA+GRGDS)、 或者合成肽(GRGDS)与BSA(牛血清蛋白)结合的物质和合成肽(GRGES)的混合物 (GRGDS-BSA+GRGES)的细胞粘附活性。另外，通过与实施例6同样的方法，测定8F7对于人 肾癌细胞株NRC-12细胞对d. d.固相化表面的细胞粘附的抑制活性。结果示于图6中。人肾癌细胞株NRC-12细胞依赖于RGD序列来粘附于ADAM-15 的d. d.和合成肽GRGDS-BSA。另外，8F7抗体以依赖于浓度地阻碍人肾癌细胞株NRC-12细 胞对d.d.固相化表面的粘附。如前所述，人肾癌细胞株NRC-12细胞不表达α9β1整合 素，表达结合于RGD序列的整合素(α ν β 3整合素，α 5 β 1整合素)，由此认为，8F7通过由 d. d.和整合素的依赖于RGD的相互作用来抑制细胞粘附。(实施例10)人乳腺癌细胞株435S中的整合素的表达用流式细胞仪确认人乳腺癌细胞株435S(MDA-MB-435S)中的ADAM-15和整合素的 表达。流式细胞仪根据实施例7所记载的方法进行。结果示于图7。在人乳腺癌细胞株435S中，对Α ΑΜ-15、ανβ3整合素、α5β1整 合素、α 9β 1整合素的表达进行了研究，结果确认出所有分子都表达。但是，其表达水平存 在差异，α νβ 3整合素、α5β1整合素与a 9 β 1整合素相比，表达水平高。(实施例11)采用人乳腺癌细胞株435S细胞的细胞粘附以及细胞粘附阻碍试验为了能确认整合素在人乳腺癌细胞株435S的表达，通过细胞粘附试验研究这些 整合素是否起作用。即，通过以下方法测定435S对d. d.或d. d.-RAA的细胞粘附。将d. d.、 d. d. -RAA、人肌糖蛋白C分子内存在的第3号的纤维粘连蛋白type III结构域的重组蛋白 (hTNfn3)的RGD序列取代为RAA的蛋白(hTNfn3 (RAA))、或者GRGDS-BSA用PBS配制为0 5μ g/mL，在96孔板的各孔中各添加50μ L，在37°C下孵育1小时，使其固相化。然后，在各 孔中各添加200 μ L的0. 5% BSA/PBS，在室温下孵育1小时，由此进行封闭反应。用PBS洗 涤后，用含有0. 25% BSA的培养基(TIL)将人乳腺癌细胞株435S配制为1 X 105cellS/mL， 在各孔中各添加200 μ L，在37°C下孵育1小时，使其粘附于固相化的蛋白质。然后，用预先 保温于37°C的PBS洗涤，除去未粘附的细胞。在各孔中各添加50 μ L的结晶紫，在室温下孵 育30分钟，对细胞进行固定、染色。用自来水洗涤后，向各孔中各添加100 μ L的20%乙酸 水，溶解细胞后，用酶标仪测定590nm的吸光度。采用人乳腺癌细胞435S细胞的细胞粘附试验的结果示于图8A。人乳腺癌细胞株 435S粘附于d. d.或d. d. -RAA，但其粘附率低。此前的报告证明，整合素通过2价离子(Mn、Mg、Ca离子等)活化。另外，也有 人报道了 ADAM-15和整合素的粘附中需要利用2价离子对整合素进行活化(Eto，K et al. RGD-independent binding of integrin alpha9betal to the ADAM-12 and-15disintegrin domains mediate cell-cell interaction. J Biol. Chem. 275 :34922_34930, 2000)。因此，在上述的采用人乳腺癌细胞株435S细胞的细胞粘附试验中，通过采用Mn离
子，使整合素活化。结果示于图8B。通过添加Mn离子，使得人乳腺癌细胞株435S细胞对d.d.或 d. d. -RAA的粘附率增加。(实施例12)采用人乳腺癌细胞株435S细胞的细胞粘附阻碍试验在采用人乳腺癌细胞株435S细胞的细胞粘附阻碍试验中，通过采用Mn离子，使整 合素活化。通过与细胞粘附试验同样的方法，使d.d.或者d.d.-RAA(配制成6.25yg/mL) 固相化，进行封闭反应。在利用阻碍ADAM-15进行的细胞粘附阻碍活性试验中，在固定于固 相的蛋白质中添加8F7。另外，在利用阻碍整合素进行的细胞粘附阻碍活性试验中，对人乳 腺癌细胞株435S细胞2 X IO4细胞中，添加针对人α 9 β 1整合素的抗体即Υ9Α2 (chemicon 公司)、或者针对人α νβ 3整合素的抗体即LM-609 (chemicon公司)，在37°C下孵育20分 钟。然后，通过与细胞粘附试验同样的方法在各孔中添加细胞，测定细胞粘附。结果示于图9中。采用8F7和针对整合素的抗体进行细胞粘附阻碍试验的结果 是，针对d. d.的细胞粘附通过针对α ν β 3整合素的抗体被抑制。但是，如果是针对α 9 β 1 整合素的抗体则未被抑制。另一方面，针对d.d.-RAA的细胞粘附，由针对α9β1整合素的 抗体而被抑制。另外，8F7抑制针对d.d.的细胞粘附和针对d.d.-RAA的细胞粘附这两者。 即，含有R⑶序列的d.d.中，α νβ 3整合素等经由R⑶受体而结合，并未发现经由α9β1 整合素的结合。另一方面，对于不含有R⑶序列的d.d._RAA，发现了经由α9β1整合素的
纟口口。如前所述，通过流式细胞仪确认乳腺癌细胞株435S细胞中的整合素的表达的结 果可知，与α9β 1整合素相比，ανβ3整合素和α 5β1整合素的表达水平高。由此预测， 在乳腺癌细胞株435S细胞中的ADAM-15和整合素的结合中，α ν β 3整合素、α 5 β 1整合素 起首要的作用。(实施例13)细胞增殖试验用含有10% FCS的TIL培养基将人乳腺癌细胞株435S细胞(MDA_MB_435S :435S) 调节至2X 104/mL，在96孔板的各孔中各接种100 μ L，在37°C下培养一夜，然后，换成不含 FCS的TIL培养基，同样地培养一夜。除去培养基，在各孔中各添加100 μ L的用含有5% FCS 的TIL培养基调节至20 μ g/mL的抗体(在实施例5中制备的8F7，或者抗人α ν β 3整合素 抗体LM-609 (chemicon公司))，在各孔中各添加IOyL的细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，D0UJIND0公司)。在37°C下孵育2小时30分钟后，用酶标仪测定450nm处的吸光 度。以此为0小时，用含有抗体的含5% FCS的TIL培养基培养48小时的细胞，也用同样的 方法进行实验。算出450nm(48小时)/450nm(0小时)的比例，将这些的比例与未添加抗体 组比较。结果示于图10。通过添加8F7，使得人乳腺癌细胞株435S细胞的细胞增殖率降低 约20%。由此显示出，ADAM-15和整合素的相互作用对于乳腺癌细胞的细胞增殖起促进作 用。有报道指出，当ADAM-15去整合素结构域重组蛋白质作用时，乳腺癌细胞的增殖受到抑 制，这与本实验的结果一致。(ELISA 法)
在本说明书记载的实施例中，ELISA法通过如下方法进行。首先，在96孔板中添加 抗原，在4°C下进行一夜的固相化。然后，用PBS洗涤3次，以200mL/孔的量添加BSA、 0. 05% NaN3/PBS,由此进行封闭反应。用0. 05 %吐温/PBS洗涤5次后，在各孔中各添加 IOOyL的用BSA、0. 05%吐温/PBS稀释的一次抗体，在37°C下反应1小时。用0.05% 吐温/PBS洗涤7次后，以50mL/孔的量添加用BSA、0. 05%吐温/PBS稀释1000倍的二 次抗体(抗小鼠IgG HRP标记Jackson immunoresearch公司)，在37°C下反应30分钟。 用0. 05%吐温/PBS洗涤9次后，以50mL/孔的量添加邻苯二胺溶液(和光纯药)，在室温 下、在暗处使其反应15分钟。用2N硫酸使其反应终止后，采用酶标仪测定0D490的吸光度。在抗体效价的测定中，作为抗原，在各孔中使50ng的人ADAM-去整合素结构 域-GST蛋白质固相化，作为一次抗体，将免疫了抗原的小鼠的血清稀释1000 1000000倍 来使用。(统计学的处理)在本说明书的细胞粘附阻碍试验中，以未添加抗体组的0D590为基准，算出在抗 体添加组中得到的0D590的比例。在细胞增殖试验中，算出各自中48小时后/0小时的值， 以在未添加抗体组中得到的比例为基准，算出抗体添加组的比例。这些实验全部都进行3 次，进行T检验。(实施例14)采用人乳腺癌细胞株435S细胞的细胞浸润阻碍试验为了调查8F7对细胞浸润的影响，进行细胞浸润试验。细胞浸润试验采用基质胶 侵袭室(Matrigel invation chamber) (BD公司)进行。在孔和插入器(insert)中各添加 500mL的无血清的TIL培养基(免疫生物研究所社)，将插入器浸渍于孔中。在37°C下孵育 2小时，由此，水化基质胶(matrigel)。然后，吸除插入器内的培养基，浸渍于其他的添加有 750mL的化学诱导物质的孔中。化学诱导物质采用人纤维肉瘤细胞株HT-1080细胞株的培 养上清液。在插入器中添加500mL的用无血清的TIL培养基调节至1 X IO5个/mL的435S 细胞悬浮液，在37°C下孵育22小时，由此诱导浸润。在调查由抗体产生的对细胞浸润的阻 碍效果时，在对插入器添加乳腺癌细胞之前，添加8F7抗体或对照抗体至浓度为10mg/mL， 在37°C下孵育20分钟，在插入器中添加435S细胞悬浮液。浸润后，吸除插入器内的细胞悬 浮液，用棉棒拭去基质胶和非浸润细胞。然后，将插入器浸入冷却的甲醇中，在-80°C下孵育 20分钟，由此固定浸润细胞。固定后，将插入器浸入吉姆萨溶液(武藤化学株式会社)15分 钟，对浸润细胞进行染色。用自来水洗涤后，从插入器中取下过滤器，放置在载玻片上，用封 固剂进行封片。用光学显微镜观察过滤器下层的浸润面，以能观察到核的细胞作为浸润细 胞进行计数。对6处观察域进行计数，算出其平均值。结果示于图11。以未添加抗体时的浸润细胞数为基准，算出由抗体添加组所得到 的浸润细胞数的比例。另外，这些实验各进行3次，进行T检验。添加对照抗体时，浸润细 胞数基本无变化，与此相对，添加8F7抗体时，浸润细胞的比率减少至30%左右，可以确认 8F7对细胞浸润存在具有统计学上显著性差异的阻碍效果。(实施例15)抗体的氨基酸序列的解析采用iIlustra快速微量mRNA分离纯化试剂盒(QuickPr印Micro mRNA Purification Kit) (GE Healthcare bioscience 公司)，从杂交瘤细胞中提取 RNA，通过 superscript First-strand cDNA for RT—PCR 试剂盒(Invitrogen 公司)制备 cDNA。采
28用 Heavy Primer 扩增试齐[J盒(Amersham Biosciences 公司)以及 Light Primer 扩增试齐[J 盒(Amersham Biosciences公司)进行PCR，使抗体的重链(Heavy chain)和抗体的轻链 (Light chain) cDNA延伸，将重链的PCR产物组入pTA载体(东洋纺织株式会社)，并且将 轻链的PCR产物用Mighty克隆试剂盒(Cloning Kit)〈平滑末端(Blunt End) > (夕力W ^才社)组入载体，确定cDNA区域、氨基酸序列。⑶R区利用Kabat编号系统来确定。
根据由上述方法得到的cDNA序列为母本制备引物，采用GeneRacer试剂盒 (Invitrogen公司)进行抗体的重链和抗体的轻链的5' RACE和3' RACE，进行抗体基因 的全长解析。结果，重链和轻链、CDR区的氨基酸序列如下所示(参照图12和图13)。(重链)
[CDRH1]
SYNMH (序列号15)
[CDRH2]
AIYPGDGDTSYNQKFKG(序列号 I6)
[CDRH3]
DRGDYGYGFAY(序列号 17)
(轻链)
[CDRL1]
RSSQSLVHSNGNTYLH(序列号 18)
[CDRL2]
KVSNRFS (序列号 19)
[CDRL3]
SQNTHVPPWT(序列号 20)
工业实用性
本发明的抗ADAM-15抗体等，显示出优异的ADAM-15功能抑制作用，因此，能够
作因细胞增殖、细胞迁移、细胞浸润、细胞间粘附、新血管形成所引起的疾病的治疗药或预 防药。尤其是，本发明的抗体能够用作针对如下所述疾病的治疗药或预防药癌(例如，癌 细胞的增殖、转移)、炎症性疾病(例如，类风湿关节炎、变形性关节炎、肝炎、支气管哮喘、 纤维化症、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、炎症性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩病等))、传 染病(例如，肝炎)、自身免疫疾病(例如，系统性红斑狼疮、多发性肌炎、自身免疫性甲状腺 疾病、肾小管间质性肾炎、重症肌无力)以及骨疾病(例如，骨质疏松症)等。另外，本发明 的抗体能够从病理学上检测出细胞或组织中的ADAM-15的表达，因此，能够用作上述各种 疾病的诊断药。
权利要求
一种抗体或其片段，其特征在于，识别ADAM 15的去整合素结构域，并且不识别ADAM 15的去整合素结构域内的RGD序列。
2.一种抗体或其片段，其特征在于，识别ADAM-15的去整合素结构域，并且不识别 ADAM-15的去整合素结构域内的环区。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其片段，其特征在于，阻碍ADAM-15和整合素 α νβ 3依赖性细胞粘附。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，阻碍ADAM-15和整 合素1依赖性细胞粘附。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，抑制癌细胞的增殖。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体为单克隆 抗体。
7.根据权利要求1 6中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体含有具有 序列号12的氨基酸序列的重链和/或具有序列号14的氨基酸序列的轻链。
8.根据权利要求6所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体是由以保藏号FERM ΒΡ-10950所特定的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
9.根据权利要求1 7中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体是嵌合抗 体、人源化抗体或者人源抗体。
10.根据权利要求1 5中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体片段是 F(ab' )2、Fab'、Fab、单链Fv、二硫键稳定性Fv或它们的聚合物，或者是二聚体化V区。
11.根据权利要求1 5中的任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体的片 段是含有抗体的CDR序列的肽。
12.根据权利要求11所述的抗体或其片段，其特征在于，所述CDR序列具有序列号15、 序列号16、序列号17、序列号18、序列号19或者序列号20的氨基酸序列。
13.—种DNA，其特征在于，编码权利要求1 12中的任一项所述的抗体或其片段。
14.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求13所述的DNA。
15.一种转化细胞，其特征在于，通过向宿主细胞导入权利要求14所述的重组载体而 得到。
16.根据权利要求15所述的细胞，其特征在于，其为杂交瘤细胞系。
17.根据权利要求16所述的细胞，其特征在于，其为以保藏号FERMBP-10950特定的杂 交瘤细胞系。
18.一种抗体或其片段的制造方法，其为权利要求1 12中的任一项所述的抗体或其 片段的制造方法，其特征在于，培养权利要求15或16所述的细胞，在培养物中生成抗体或 其片段，从培养物中提取抗体或其片段。
19.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1 12中的任一项所述的抗体或其片 段作为有效成分。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，其为细胞增殖、细胞迁移、细胞 浸润、细胞间粘附或者新血管形成所引起的疾病的治疗药或预防药。
21.根据权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，其为抗癌药或癌转移抑制剂。
22.—种诊断药，其特征在于，其具备权利要求1 12中的任一项所述的抗体或其片段。
23.根据权利要求22所述的诊断药，其特征在于，其为细胞增殖、细胞迁移、细胞浸润、 细胞间粘附或者新血管形成所引起的疾病的诊断药。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种癌症治疗药，对该抗癌药的开发观点不同于此前的观点，而是以癌细胞的细胞-细胞间粘附为着眼点。即，本发明的目的在于提供一种抑制癌细胞的增殖以及癌细胞的细胞-细胞间粘附的、降低了副作用的癌症治疗药。另外，本发明的目的在于提供一种能够识别ADAM-15的去整合素结构域而可用作抗癌药的抗体等。本发明提供的抗体等识别ADAM-15的去整合素结构域，并且不识别ADAM-15的去整合素结构域内的RGD序列或者环区。本发明提供的抗体等阻碍ADAM-15和整合素αvβ3依赖性细胞粘附，并且，阻碍ADAM-15和整合素α9β1依赖性细胞粘附。
文档编号C12N5/10GK101946003SQ20098010523
公开日2011年1月12日 申请日期2009年2月12日 优先权日2008年2月14日
发明者上出利光, 松井裕 申请人:株式会社遗传科技;国立大学法人北海道大学