专利名称：内皮细胞生长因子vegf抗原表位的模拟短肽11b及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域和医学领域，特别涉及一种内皮细胞生长因子VEGF 抗原表位的模拟短肽IlB及其应用。
背景技术：
VEGF是1989年Ferrara在牛垂体滤泡星形细胞体外培养液中首先纯化出来的一 种相对分子量在34 42KD的同源二聚体蛋白。人类的VEGF基因结构位于染色体的6p21. 3 上，由8个外显子和7个内含子交替构成。根据其mRNA的剪切方式不同，产生了 5种不同 的 VEGF 异构体，包括 VEGF206、VEGF189, VEGF165、VEGF145 和 VEGF121。这 5 种 VEGF 的异 构体均具有诱导内皮细胞增生的活性，是一种有效的血管形成和通透性诱导因子，其差异 主要在于它们与细胞表面以及细胞外基质中肝素的亲和力的不同。VEGF与其相应的VEGF受体结合来发挥作用。目前克隆出的VEGF受体主要有 Flt-I和KDR/Flk-Ι两种，二者均具有酪氨酸激酶活性，是一种跨膜的糖蛋白，选择性的表 达与内皮细胞表面，通过启动不同的信号通路来发挥生物学作用，即促进内皮细胞增殖、促 进血管的形成以及血管通透性的增加。噬菌体展示技术(Phage Display Technology)是一种将外源肽或者蛋白质与特 定的噬菌体衣壳蛋白PIII或者PVIII相融合，展示于噬菌体表面来构建蛋白质或多肽文 库，并从中筛选出目的蛋白、多肽或抗体的基因工程高新技术。它的优势在于可以将表现型 与基因型直接联系在一起，确保能方便快捷的展示出目的蛋白以及该蛋白的基因序列。基 于此，近年来在多肽序列鉴定、多肽模拟物的结构和功能的研究以及在人类病毒、细胞、肿 瘤等多种生物靶组织多肽的研究方面，噬菌体展示技术发挥着重要的不可替代的作用。研究表明，VEGF和其受体在许多肿瘤组织中有高表达，在乳腺癌、肺癌、大肠癌、胃 癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肉瘤、腺瘤等多种肿瘤组织内、外都可检测到大量的VEGF。原位杂交 试验显示VEGF的mRNA主要分布在肿瘤细胞内，且肿瘤细胞也高度表达Flk-I，提示肿瘤局 部存在自分泌和旁分泌机制促进血管生长。VEGF的表达程度与肿瘤的组织学类型、原发肿 瘤的大小、有无血管或淋巴管转移等多种因素有关肺腺癌组织中VEGF的表达程度显著高 于鳞癌；VEGF高表达者，淋巴结转移和远处转移明显增高；低分化肿瘤患者的VEGF表达高 于高分化者；VEGF阳性患者的复发率高、预后差、早期死亡率高。而肿瘤患者的年龄、性别、 肿瘤生长部位等与VEGF表达无关。鉴于此，研究者们设想，如果能通过噬菌体展示技术和 计算机模拟技术得到一系列VEGF的相关表位序列，制成小分子多肽，为今后抗原肽疫苗的 研发提供支持，在人体内产生专门针对VEGF的抗体，将会对人体内恶性肿瘤的治疗发挥巨 大作用。目前多肽类药物中，在抗肿瘤方面，Kathleen等人通过人工化学合成 了 2个多肽， 结果表明该多肽对人宫颈癌细胞的抑制率较高，但该肽段与人源性VEGF并无明显的同源 性，而Maruta等人得到的具有抗肿瘤活性的保守基序MXXP也与FGFs没有同源性。这些肽 段人工合成费用高，而且若作为疫苗，可能会在人体内诱导产生该肽段特异性的抗体，从而阻止其抗肿瘤效用的发挥。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种内皮细胞生长因子 VEGF抗原表位的模拟短肽11B。本发明的另一目的在于提供所述内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽 IlB的应用本发明的目的通过下述技术方案实现一种内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的 模拟短肽 11B，其氨基酸序列为 Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys HisLeu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn，即 CGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKN ；所述内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽IlB的核苷酸序列如下 TGCGGTCCGTGCTCCGAACGTCGTMACACCTGTTCGTTCAGGACCCGCAGACCTGCAAATGCTCCTGC AAAAAC ；所述的内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽IlB用于制备多肽疫苗、肿瘤血管生长抑制剂或者肿瘤导向药物；所述的肿瘤优选为黑色素瘤。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明所述内皮细胞生长因子 VEGF抗原表位的模拟短肽IlB根据人的VEGF189肽段序列通过生物信息学方法设计，接着 通过噬菌体展示技术获得。体外相关的实验证明模拟短肽IlB在内皮细胞增殖、成管、肿瘤 细胞增殖和迁移过程中具有明显的抑制作用，也就是其具有明显的抗肿瘤和抗血管新生作 用。本发明所述的内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽IlB对于以VEGF受体为目 标、诊断预测肿瘤的发生发展，探讨小分子多肽对肿瘤血管新生抑制剂的开发以及肿瘤导 向性药物的开发和研究具有十分重要的参考价值。
图1是重组载体11B-PCANTAB5-E酶切鉴定的电泳图。图2是用兔抗人VEGF多抗对噬菌体表位肽IlB进行ELISA检测的结果图。图3是模拟短肽IlB抑制内皮细胞HUVEC增殖的结果图。图4是模拟短肽IlB抑制肿瘤细胞B16增殖的结果图。图5是模拟短肽IlB抑制内皮细胞HUVEC成管的显微镜观察图。图6是模拟短肽IlB抑制肿瘤细胞B16F10迁移的结果图。图7是模拟短肽IlB抑制肿瘤细胞B16F10迁移的显微镜观察图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。实施例1(1)通过生物信息学方法，模拟得到内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽 IlB的核苷酸序列如下所述
TGCGGTCCGTGCTCCGAACGTCGTAAACACCTGTTCGTTCAGGACCCGCAGACCTGCAAATGCTCCTGC AAAAAC(2)为了将只有75个碱基的模拟短肽IlB高效的构建到噬菌体载体pCANTAB5_E 上，先根据PCANTAB5-E上的碱基序列和酶切位点，设计引物1和引物2进行第一轮PCR，两 者PCR产物作为第二轮PCR的模板。然后根据模模拟短肽IlB的碱基序列以及第一轮PCR 得到的产物碱基序列，设计引物A和引物B，进行第二轮PCR。扩增得到碱基长度在100 200bp、包含有模拟短肽IlB的产物进行下一步实验。
引物 1 :AAGCTTTGGAGCCTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGC引物 2 GGCCGGCTGGGCCGCATAGAAAGGAACAACTAAAGGAATTGCGAATAATAATTTTTTCA引物 A TATGCGGCCCAGCCGGCCTGCGGTCCGTGCTCCGAACGTCGTAAACACCTGTTCGTTCA引物 B GCGGCCGCGTTTTTGCAGGAGCATTTGCAGGTCTGCGGGTCCTGAACGAACAGGTGTTT第一轮PCR 条件94°C 5min，55°C 5min，72°C 5min，7 个循环。 第二轮PCR 条件94°C预变性 5min，94°C变性 40s，56°C退火 35s，72°C延伸 40s，30
个循环。 (3)将第二轮PCR产物切胶回收，连入T载体(Takara公司)，转入DH5 α大肠杆 菌(Takara公司)中挑取单菌落，提质粒进行酶切鉴定，并送样测序。测序由上海生物工程 技术服务有限公司完成。载体的构建、连接及转化通过HindIII和Not I进行双酶切反应将多肽片段从T 载体上切下，连入具有同样酶切位点的PCANTAB5-E载体(Pharmacia公司)中，得到重组载 体llB-pCANTAB5-E。酶切条件和体系如下37°C水浴酶切16h。
T载体链接VEGF表位肽酶切体系 Γ ηHindIIIΙμ 连接条件和体系如下16°C水浴连接24h。 将构建好的载体1 lB-pCANTAB5-E转化入TGl大肠杆菌(Pharmacia公司)中，挑取单克隆，提质粒进行酶切鉴定。酶切鉴定结果如图1所示。(4) VEGF表位肽噬菌体展示及鉴定用辅助噬菌体VCSM13 (Stratagene公司)去 感染构建好位于对数生长期的TGl菌，静置30min后加入卡那霉素至70mg/L ；在4°C条件下 8000rpm离心获得菌液上清，加入灭菌饱和硫酸铵冰浴沉淀3h，4°C下8500rpm离心获得噬 菌体沉淀，去除上清至无上清液流出状态，DMEM溶解，4°C保存；取10μ 1稀释后测滴度。模 拟短肽IlB的滴度为1. 9Χ 1012pfu/mL。将该噬菌体表位肽进行ELISA鉴定在酶标板中以 9ng/100 μ L包被兔抗人VEGF多抗(购自Abcam公司)，37°C，2h ；用1 XPBS-T洗板3次，每 次3min ；200 μ L/孔5%脱脂奶粉37°C封闭Ih ；用1 XPBS-T洗板3次，每次3min ；加入不 同稀释度的噬菌体表位肽并设立VCSM13对照、空白对照，100μ L/孔，37°C，Ih ；用IXPBS-T 洗板3次，每次3min ；加入抗噬菌体HRP酶标二抗(1 2500) 100 μ L/孔，37°C，30min ；用 1 XPBS-T洗板5次，每次3min ；加底物显色液(TMB) 100 μ L/孔，避光IOmin,加终止液2M H2SO4 50 μ L/孔，测0D450nm值。如图2所示，可知模拟短肽IlB已经被展示在噬菌体表面。(5)对内皮细胞和肿瘤细胞增殖抑制作用的检测
A、MTT法测噬菌体表位肽对内皮细胞的增殖抑制作用⑴原代人脐静脉内皮细 胞HUVEC的分离和培养取新生儿脐带一段(广州华侨医院提供)，用PBS将静脉冲洗干净， 用止血钳夹闭血管一端；用0. 25%胰酶消化液灌注，室温消化15min ；用含10%小牛血清 的培养液冲洗并终止胰蛋白酶的消化作用，将冲洗液收集到50mL无菌离心管中，1500rpm 离心IOmin ；加入含有20%胎牛血清的完全SFM(购自Gibco公司)培养液，接种于培养瓶 中，37°C、5% CO2恒温培养箱中培养24h，换液，去除红细胞和其他未贴壁细胞；待细胞贴 壁生长至90%融合状态后消化传代。(2)取对数生长期的原代人脐静脉内皮细胞HUVEC， 弃尽孔内培养液，加入适量0. 025%胰酶溶液消化，轻摇使消化液均勻作用于细胞，当成片 细胞圆缩、呈单个细胞状态时去除消化液，迅速加入适量培养基，用吸管轻轻吹打使成单细 胞悬液；取该单细胞悬液计数后以每孔5000个细胞的浓度分至96孔板中，用含10%小牛 血清的M199的培养液于37°C、含5% CO2的恒温培养箱中培养24h ；换用含0. 2%小牛血 清的M199培养液继续培养24h至单层细胞状态；加入不同稀释度的噬菌体表位肽、M13噬 菌体，并设立空白对照，于37°C、5% C02恒温培养箱中培养48h ；每孔加入5g/L MTT溶液 20μ 1，37°C，继续孵育3h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μ 1 DMSOjM 荡lOmin，使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔收值，记录结 果。实验重复3次。实验结果表明该噬菌体表位肽具有明显的抑制原代HUVEC增殖的效用， 如图3所示，在1/30的表位肽稀释度下，表位肽IlB对HUVEC的生长抑制率仍达到55. 7%。B、MTT法测噬菌体表位肽对肿瘤细胞的增殖抑制作用取对数生长期的黑色素瘤 细胞系B16 (购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)，弃尽孔内培养液，加入适量0. 25% 胰酶溶液消化，轻摇使消化液均勻作用于细胞，当成片细胞圆缩、呈单个细胞状态时去除消 化液，迅速加入适量培养基，用吸管轻轻吹打使成单细胞悬液；取该单细胞悬液计数后以每 孔5000个细胞的浓度分至96孔板中，用含10%小牛血清的DMEM的培养液于37°C、含5% CO2的恒温培养箱中培养24h ；换用含0. 2%胎牛血清的DMEM培养液继续培养24h至单层细 胞状态；加入不同稀释度的噬菌体表位肽、M13噬菌体，并设立空白对照，于37°C、5% CO2恒 温培养箱中培养48h ；每孔加入5g/L MTT溶液20 μ 1，37°C，继续孵育3h，终止培养，小心吸 弃孔内培养上清液，每孔加入150 μ 1 DMS0,振荡lOmin，使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔收值，记录结果。实验重复3次。如图4所示，在1/30的 表位肽稀释度下，表位肽IlB对B16的生长抑制率达到75. 7%。(6)对内皮细胞成管抑制作用的检测取450 μ 1的ECM gel置于4°C活化过夜。将ECM gel与450 μ 1的DMEM混勻，注 意不要出现气泡。每孔取60μ1铺于96孔板中，室温静置5min，待其铺平后置于37°C C02 培养箱中备用。取原代人脐静脉血管内皮细胞HUVEC，用0.025%的胰酶消化成单细胞悬 液，吹勻，以1. 5Χ 104/50 μ 1的量加入铺好ECM gel的96孔板中。取VEGF表位肽IlB和 VCSMl3用1640基本培养基稀释至1/100，加入96孔板中，同时设立空白对照，将96孔板置 于37°C C02培养箱中培养5hr后观察拍照。(40X)实验结果如图5所示，表明IlB能有效 抑制HUVEC的成管作用。(7)对肿瘤细胞迁移抑制作用的检测A、取对数生长期的黑色素瘤高转移细胞株B16F10 (南京凯基生物有限公司)，用 0. 25%胰酶消化成单细胞悬液，计数，用1640基本培养基稀释细胞数至5X 105/ml。B、在放入Transwell小室的24孔培养板中，于小室下层加入含10%小牛血清的 1640完全培养基600 μ 1。C、在小室上层加入B16F10细胞悬液100 μ 1，并相应加入IlB的噬菌体表位肽，浓 度为101Qpfu/ml，同时设立VCSM13(浓度为101Qpfu/ml)对照和空白对照。D、将24孔板置于37°C含5% CO2培养箱中，培养18h。Ε、将小室取出，用1640基本培养基淋洗2次，室温下放入70%乙醇中固定15min。F、将固定完毕的小室用0. 015M pH7. 4的PBS淋洗3次，风干，放回24孔板中，小室 上层加入100 μ 1吉姆萨染液，下层加入800 μ 1吉姆萨染液，染色15min后取出，用0. 015M PH7. 4的PBS淋洗3 4次，用棉签轻轻将小室上层的细胞擦去、风干。G、放入显微镜下计数(40X)，以Control组细胞迁移率100%做对照，用药组细胞 迁移率=用药组迁移到小室下层的细胞数/Control组迁移到小室下层的细胞数X 100% 计算，如图6所示，可知IlB表位肽能抑制高转移细胞株B16F10的迁移作用，抑制迁移率超 过80% ；拍照(100X)如图7所示，可直观的看到用药组与VCSM13以及Control组相比， 明显抑制了 B16F10的迁移作用。以上实验结果表明，本发明所述的内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽 11B，在一定程度上可在体外抑制内皮细胞和肿瘤细胞的增殖作用，并且能明显抑制HUVEC 成管和以及B16F10的迁移作用。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCE LISTING<110>暨南大学<120>内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽IlB及其应用<130>2<160>6<170>PatentIn version 3. 2
<210>1<211>25<212>PRT<213>artificial sequence<220><223>内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽IlB的氨基酸序列
<400>1Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro151015Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn2025<210>2<211>75<212>DNA<213>artificial sequence<220><223>内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽IlB的核苷酸序列<400>2tgcggtccgt gctccgaacg tcgtaaacac ctgttcgttc aggacccgca gacctgcaaa 60tgctcctgca aaaac75<210>3<211>54<212>DNA<213>artificial sequence<220><223> 引物 1<400>3aagctttgga gccttttttt tggagatttt caacgtgaaa aaattattat tcgc54<210>4<211>59<212>DNA<213>artificial sequence<220><223> 引物 2<400>4ggccggctgg gccgcataga aaggaacaac taaaggaatt gcgaataata attttttca 59<210>5<211>59
<212>DNA<213>artificial sequence<220><223> 引物 A<400>5tatgcggccc agccggcctg cggtccgtgc tccgaacgtc gtaaacacct gttcgttca 59<210>6<211>59<212>DNA<213>artificial sequence<220><223> 引物 B<400>6gcggccgcgt ttttgcagga gcatttgcag gtctgcgggt cctgaacgaa caggtgttt 59
权利要求
一种内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽11B，其特征在于所述模拟短肽11B的氨基酸序列如下所示Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys LysCys Ser Cys LysAsn。
2.根据权利要求1所述的模拟短肽11B，其特征在于所述模拟短肽IlB的核苷酸序列 如下所示TGCGGTCCGTGCTCCGAACGTCGTAAACACCTGTTCGTTCAGGACCCGCAGACCTGCAAATGCTCCTGCAAAAAC。
3.权利要求1或2所述内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽IlB的应用，其特 征在于所述模拟短肽IlB用于制备肿瘤多肽疫苗、肿瘤血管生长抑制剂或 者肿瘤导向药 物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为黑色素瘤。
全文摘要
本发明公开了一种内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽11B及其应用。本发明所述的模拟短肽11B的氨基酸序列为CGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKN，核苷酸序列为TGCGGTCCGTGCTCCGAACGTCGTAAACACCTGTTCGTTCAGGACCCGCAGACCTGCAAATGCTCCTGCAAAAAC。体外实验证明本发明的模拟短肽11B在内皮细胞增殖、成管、肿瘤细胞增殖和迁移过程中具有明显的抑制作用。因此，本发明所述的模拟短肽11B可用于制备多肽疫苗、肿瘤血管生长抑制剂或者肿瘤导向药物，而且其对于以VEGF受体为目标、诊断预测肿瘤的发生发展，探讨小分子多肽对肿瘤血管新生抑制剂的开发以及肿瘤导向性药物的开发和研究具有十分重要的参考价值。
文档编号C12N15/11GK101838317SQ20101001952
公开日2010年9月22日 申请日期2010年1月20日 优先权日2010年1月20日
发明者王宏, 赵鑫, 邓宁 申请人:暨南大学