专利名称：大豆GmSGT基因和其5"UTR的克隆及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因及其编码蛋白和基因的5’ UTR，特别是涉及一个来源于大豆的具有氨基转移酶功能的抗病基因及其编码蛋白与其在培育抗病性提高的植物中的应用。
背景技术：
细菌及真菌是危害农作物的主要病原菌。虽然目前对某些病害已找到有效的防治方法，但对大多数严重危害农作物生长的病害尚无切实有效的防治措施。培育抗病品种是防治植物病害的根本措施。但由于病原菌变异迅速，可供利用的抗原匮乏，常规育种的作用受到很大程度的限制。随着分子生物学、植物病理学及基因工程技术的迅猛发展，运用基因工程手段提高植物的抗病性为抗病育种开辟了一条崭新途径。Taler等对印度野生、高抗霜霉病甜瓜品种Pl进行遗传学研究发现，P45蛋白与抗病性紧密连锁(PlanteR Genes That Encode Photorespiratory Enzymes Confer Resistance against Disease The Plant Cell，Vol. 16，172-184，January 2004)。根据 P45蛋白部分氨基酸测序结果，设计简并引物，利用RT-PCR的方法克隆得到两个编码P45蛋白的eR基因，分别命名为Atl和At2。Atl和At2核苷酸序列的同源性为88%，氨基酸序列同源性为93%。研究发现Atl和At2不属于任何一类已知的eR基因，其编码蛋白与丝氨酸乙醛酸氨基转移酶(Ser glyoxylate aminotransferase, SGT)、丙氨酸乙醛酸氨基转移酶(Ala glyoxylate aminotransferase, AGT)氨基酸序列同源性均大于80%。酶学活性分析实验发现，植物抗、感病性与SGT、AGT的酶活有直接相关性，高抗品种中SGT、AGT酶活最高，接近100%，中抗品种中酶活大约70%，感病品种中酶活则低于25%。Taler等将Atl或At2基因转入感病品种，感病品种即获得抗病性，同时，SGT、 AGT和乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase, GO)的酶活性均显著提高(Plant eR Genes That Encode Photorespiratory Enzymes ConferResistance against Disease The Plant Cell，Vol. 16，172-184，January 2004)。推测 SGT 和 AGT 可能具有提高 GO 活性的功能。经检测，抗病植株中GO的活性是感病植株中GO活性的10-20倍。SGT、AGT和GO 是植物光呼吸中的关键酶，它们都在植物的过氧化物体中起作用。在过氧化物体中，GO 催化乙醇酸向乙醛酸转化并产生H2O2，而SGT、AGT分别以丝氨酸和丙氨酸作为氨基供体， 催化乙醛酸向苷氨酸转化。SGT、AGT、GO协同作用导致植物体内H2O2的产生和积累。已知H2O2在植物抗病过程中起很重要的作用，H2O2不仅能够直接杀死病原菌(Peng & Kuc， Phytopathol. 82 =696-699,1992)，还可通过诱导细胞壁结构蛋白的氧化交联阻止病菌的侵 Λ (Bradley et al., Cell70 :21-30,1992 ；Brisson et al.，Plant Cell 6:1703—1712， 1994)及通过激活水杨酸合成以诱导防卫基因的表达，使植物产生系统获得性抗性(Leon et al. , PlantPhysiol. 108 :1673-1678,1995 ；Chen et al. , Science 162 :1883-1886, 1993)。悬浮细胞试验证明H2O2能激活植保素的合成(Apostol et al. ,Plant Physiol. 90 109-116，1989 ；Davis et al.，Phytochem. 32 :607-611,1993 ； Degousee et al.，Plant Physiol. 104 :945-952,1994)。在近来的研究中还发现在不亲和的植物一病原互作中氧化激增产生的H2A不仅可作为区域信号导致细胞死亡，而且还可作为扩散信号诱导周围未侵染细胞中防卫基因如谷胱甘肽S转移酶基因的表达(Levine et al. , Cell 79:583-593， 1994)。上述研究表明，eR基因对病原菌没有种属专化性，是具有氨基转移酶活性的酶学抗病基因。霜霉病是农业生产上的重要病害，霜霉菌寄生谱广，能引起葫芦科等多种作物的霜霉病，尤其是黄瓜，大豆等作物上损失惨重。霜霉菌主要引起叶片枯萎，在有利的环境条件下，菌丝的生长和病害的传播都很迅速。19世纪后期the oomycete Plasmopara viticola引起的葡萄霜霉病几乎摧毁了法国的酿酒业，直到1885年波尔多液的发现才使得病害得以控制。最近由klerospora graminicola引起的霜霉病的流行导致了印度和西部非洲重要的原料作物一珍珠栗的严重损失。
发明内容
本发明的目的是提供一个来源于大豆的具有氨基转移酶功能的酶学抗病基因及编码蛋白和该基因的5’ UTR序列。本发明所提供的酶学抗病基因，名称为GmSGT (Glycine max serine glyoxylate aminotransferase),来源于大豆属大豆(Glycine max L. Merril)，是下述核苷酸序列之1)序列表中SEQ ID NO 1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO 2的DNA序列；3)序列表中SEQ ID NO 3的DNA序列4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO=I限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为在0. IX SSPE (或0. IX SSC)、0. SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。序列表中的SEQ ID NO 1由1260个碱基组成，其编码序列为自5，端第146位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO :2的氨基酸残基序列的蛋白质。
5)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO 3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为在0. IX SSPE (或0. IX SSC)、0. SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。本发明酶学抗病基因所编码的蛋白(GmSGT)，具有下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的 SEQ ID NO 2 ；2)将序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、 缺失或添加且具有提高植物抗病性的蛋白质。序列表中的SEQ ID NO 2由401个氨基酸残基组成。含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增GmSGT中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。本发明的另一个目的是提供提供一种提高植物抗病性的方法。
6)序列表中SEQ NO :4的DNA序列；7)在高严谨条件下可与序列表中SEQ NO 4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为在0. IX SSEP (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。8)序列表中SEQ NO 4由拟8个核苷酸组成，具有起始基因转录的功能，其中包括有有 3 个 TATA-box (_17bp、-57bp 和 _196bp)，3 个 CAAT-box (_23bp、_291bp、_341bp)和有 3 个 G-box (_139bp、_214bp、_547bp)9)序列表中SEQ NO :4通过分析发现，包含有与生物抗病相关的顺式作用元件 as-1 (激活序列1)顺式调控元件。该元件位于转录起始位点下游有+236bp和+272bp处， 它们的共有序列为TGACGTAC。本发明所提供的提高植物抗病性的方法，是将所述大豆酶学抗病基因导入植物组织或细胞，得到抗病性提高的植物。所述大豆酶学抗病基因可通过含有所述大豆酶学抗病基因的植物表达载体导入植物组织或细胞。用于构建所述植物表达载体的出发载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用GmSGT构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。 翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。具体来讲，用于构建所述植物表达载体的出发载体可为pBI121、pCAMBIA2301、 pCAMBIA1301、pCAMBIA1300 等，优选为 pCAMBIA2301。以pCAMBIA2301为出发载体，构建的植物表达载体为pGmSGT2301。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、 萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。携带有本发明GmSGT的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、 直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是玉米、小麦、等单子叶植物， 也可以是烟草、拟南芥、菜豆等双子叶植物。本发明从大豆品种“早丰5号”中克隆得到GmSGT，该基因与具有氨基转移酶功能的甜瓜eR基因的核苷酸序列同源性为79. 52 %，氨基酸序列同源性为96. 76 %。将该基因转入烟草，转基因烟草高抗烟草青枯病和烟草黑胫病，表明GmSGT转基因植物可高抗霜霉、 灰霉病等真菌病害。本发明将在植物病害的防治领域及抗病品种的繁育工作中发挥重要作用。 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
图1为GmSGT5’ Race PCR产物的1 %琼脂糖凝胶电泳检测结果
图2为质粒pGsR的限制性内切酶EcoRI和I^stI酶切鉴定结果
图3为GmSGT全基因PCR产物的1 %琼脂糖凝胶电泳检测结果
图4为pGmSGTa的限制性内切酶I^stI酶切鉴定结果
图5为GmSGT植物表达载体pGmSGT2301的酶切鉴定结果
图BGmSGT转基因烟草抗青枯病检测
图7为构建GmSGT基因启动子的克隆步移文库的2%琼脂糖凝胶电泳检测结果
图8为GmSGT基因启动子序列分析图
图9为GmSGTP植物表达载体的酶切检测图
图10为转基因烟草的GUS染色结果
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物均由上海生工合成，测序工作均由中国农业科学院重大工程楼实验室协助完成。实施例1、GmSGT的克隆植物材料大豆品种“早丰5号”，苗龄4周时，整株喷2. OmM水杨酸，诱导48h。一、GmSGT5，Race 的引物设计根据gene bank (www. ncbi. nlm. nih. gov)中公布的甜瓜eR基因序列，网上进行比对，发现大豆受2. OmM水杨酸诱导48小时的EST序列中有1个46^ρ的DNA片段，与甜瓜 eR基因3’端序列同源性高达83%，推测该序列可能是大豆中同源基因的3’端基因序列， 将大豆中的该同源基因命名为GmSGT，据此设计用于GmSGT5’ Race的3’端PCR引物Pl和 P2，5，端引物 P3 和 P4 由 Invitrogen 公司的 GeneRacer 试剂盒(Cat. No. L1502-01)提供， 上述引物序列如下Pl :5，-CTGGTTGCTTTGCCTAAACGACTGTG-3，P2 :5’ -AAGAGCAGCTCTCAGACCATACAGC-3’P3 :5’ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’P4 :5’ -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3，二 GmSGT2全基因的克隆用下述方法进行GmSGT全基因的克隆，具体过程包括以下步骤1、大豆RNA提取使用hvitrogen 公司的 TRIZOLk Reagent 试剂盒(Cat. No. 15596-026)并参照试剂盒说明书提取上述经水杨酸诱导的大豆品种“早丰” 5号的叶片RNA，具体过程如下
1)取50_100mg大豆叶片在液氮中磨成粉末，转入1. 5mL离心管中。2)加入ImL TRIZOL Reagent充分混勻，室温放置5min。3)加 200 μ L 氯仿，振荡 15s，室温放置 2-3min, 4°C、12000g 离心 IOmin04)取上清，加入500 μ L异丙醇，室温放置lOmin，4°C、12000g离心5min，在离心管底部可见白色片状的RNA沉淀。5)弃上清，小心加入ImL 70%乙醇，不要破坏RNA片状沉淀，k后用加样器将液体全部吸出。6)室温放置5-lOmin，使乙醇挥发(不要让其完全干，否则影响溶解性)，加入 20 μ L DEPC水溶解沉淀，得到经水杨酸诱导后的大豆叶片RNA。2、RNA去磷酸化本实验中所用10 μ L CIP 缓冲液、RNaseOUTTM、CIP、DEPC 水、氯仿 / 苯酚、10mg/mL 贝糖原(musselglycogen)，3M 醋酸钠(ρΗ5· 2)均由 Invitrogen 公司的 GeneRacer 试剂盒提供。对步骤1提取的大豆叶片RNA用hvitrogen公司的GeneRacer试剂盒并参照试剂盒说明书进行去磷酸化处理，具体方法如下1)取提取的RNA 2yL(5-10g)置于1.5mL离心管中，放置冰上，再顺次加入 10 X CIP 缓冲液 1 μ L、RNaseOUT 1 μ L、CIP 1 μ L 禾口 DEPC /K 5 μ L 至总体积为 10 μ L。2)轻柔混勻，4°C稍加离心，收集液体，50°C温浴lh。3)4°C稍加离心，置于冰上，加90 μ L DEPC水和100 μ L氯仿/苯酚，振荡30秒， 12000g室温离心5min。4)取上层液相，置于1个新的1. 5mL离心管中，加入2ul 10mg/mL贝糖原(mussel glycogen), 10 μ L 3Μ醋酸钠(ρΗ 5. 2)，混勻后，加入220 μ L95%乙醇，稍加混合。5) _70°C冰箱中放置lOmin，4°C、12000g离心20min，用移液器小心吸去上清，不要碰到RNA沉淀。6)加入500μ1 70%乙醇，颠倒混勻几次，4°C、12000g离心anin。用移液器小心吸去上清，稍加离心，将乙醇吸出。7)室温下风干l-2min，立即加入7 μ L DEPC水将RNA沉淀溶解，得到经去磷酸化处理的大豆RNA。3、去掉RNA 5’端帽状结构本实验中所用TAP缓冲液、RNaseOUT 、TAP、DEPC水、氯仿/苯酚、10mg/mL贝糖原 (musselglycogen)，3M 醋酸钠(pH5. 2)均由 hvitrogen 公司的 GeneRacer 试剂盒提供。对步骤2经去磷酸化处理的大豆叶片RNA用hvitrogen公司的GeneRacer试剂盒并参照试剂盒说明书进行5’端脱帽处理，具体方法如下 1)取步骤2经去磷酸化的RNA 7 μ L置冰上，再依次加入IyL TAP缓冲液、1 μ L RNaseOUT 和1 μ LTAP,至总体积为10 μ L，轻柔混勻，4°C短暂离心收集液体。2) 37°C温浴lh，4°C短暂离心收集液体，置冰上。3)加入90 μ L DEPC水和100 μ L氯仿/苯酚，振荡混勻30秒。4) 12000g室温离心5min，取上层液相，放入1个新的1. 5mL离心管中。5)加入 2 μ L 10mg/mL 贝糖原(mussel glycogen) ,IOyL 3M 醋酸钠(ρΗ5· 2)，混勻，加入220 μ L 95%乙醇，稍加混合。6) _70°C冰箱中放置lOmin，4°C、12000g离心20min。用移液器小心吸去上清，不要
碰到RNA沉淀。7)加入500 μ L 70%乙醇，颠倒混勻几次，4°C、12000g离心anin。用移液器小心吸去上清，稍加离心，将乙醇尽可能吸出。室温下风干Ι-aiiin，立即加入7yL DEPC水将RNA
沉淀溶解。4、将RNA Oligo与经5’端脱帽处理的大豆RNA连接本实验中所用装有0. 25 μ g GeneRacer RNA Oligo冻干粉的离心管、10X连接缓冲液、IOmM ATP,Rnase0ut ,T4 RNA 连接酶、DEPC 水、氯仿 / 苯酚、10mg/mL 贝糖原(mussel glycogen)，3M 醋酸钠(pH 5. 2)均由 Invitrogen 公司 GeneRacer kit 提供。对上述经去磷酸化、脱帽处理的大豆叶片RNA用hvitrogen公司的GeneRacer试剂盒并参照试剂盒说明书将其与RNA Oligo进行连接，具体方法如下1)取7yL上述经去磷酸、脱帽处理的大豆RNA，加入装有0. 25yg GeneRacer RNA Oligo冻干粉的离心管中，用移液器混勻，短暂离心。2) 65°C温浴5min，去掉RNA 二级结构(由于挥发作用，体积会减小到6 μ L)。冰上放置2min，短暂离心。3)加入 IyL IOx 连接缓冲液、1 μ L IOmM ATP、1 μ L RnaseOut , 1 μ L T4 RNA 连接酶，用移液器混勻，37°C温浴lh，短暂离心，置于冰上。4)加入90 μ L DEPC水和100 μ L氯仿/苯酚，振荡混勻30s。5) 12000g室温离心5min，取上层液相，放入1个新的1. 5mL离心管中。加入2 μ L 10mg/mL 贝糖原(mussel glycogen)，10 μ L 3Μ 醋酸钠(ρΗ5. 2)，混勻，加入 220 μ L 95% 乙醇，稍加混合，-70°C冰箱中放置lOmin。6)4°C、12000g离心20min，用移液器小心吸去上清。7)加入500yL 70 %乙醇，颠倒混勻，4°C、12000g离心anin。用移液器小心吸去上清。稍加离心，将乙醇尽可能吸出。室温风干Ι-aiiin。立即加入IOyL DEPC水溶解RNA沉淀。5、反转录合成cDNA本实验中所用Gene Racer Oligo dT Primer, dNTP Mix，无菌蒸馏水、5X 第一链缓冲液，0. IM DTT, RNaseOut , SuperScript III RT 缓冲液和 RnaseH 均由 hvitrogen 公司的GeneRacer试剂盒提供。以步骤5获得的大豆叶片RNA为模板，用hvitrogen公司的GeneRacer试剂盒并参照试剂盒说明书将其反转录合成cDNA，具体方法如下1)取步骤5经处理的大豆叶片RNA 10yL，加入IyL Gene Racer Oligo dT Primer, 1 μ L dNTP Mix, 1 μ L 无菌蒸馏水。2)65°C温浴5min，去掉RNA 二级结构，冰浴5min，短暂离心。3)依次加入 4yL 5X 第一链缓冲液，IyL 0. IM DTT, 1 μ L RNaseOut , 1 μ L superscript III RT缓冲液，至总体积20 μ L，用移液器混勻。4)离心，50°C温浴 50min。5)70°C温浴15min，停止反应，冰上放置2min，离心。
6)加入 1 μ L RnaseH, 37°C温浴 20min。7)短暂离心，反转录获得的cDNA可立即用于PCR扩增或置_20°C保存。6、目的基因的PCR扩增以上述获得的cDNA为模板，首先在引物Pl和P3的引导下，进行PCR扩增，PCR 反应条件为先 95°C 5min ；再 94°C 30s, 67°C lmin，72°C 2min，共 30 个循环；最后 72°C IOmin0再取1μ 1上述PCR产物，并以之为模板，在引物P2和P4的引导下，进行第二次PCR 扩增，PCR 反应条件为先 95°C 5min;再 94°C 30s，64°C lmin，72°C 2min，共 30 个循环；最后72°C IOmin0 PCR反应结束后，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图 1所示，在944bp处有一明显的扩增条带。7、冻融法回收PCR产物1)将上述扩增的长度约960bp的目的基因片段从琼脂糖凝胶上切下，置于一新的
离心管中。2)加入TE缓冲液200 μ L，在振荡器上振荡5min，再放入液氮中冷冻5min。3)取出，在65°C下水浴5min。4)按步骤2-3所述方法重复冷冻、融化两次。5)依次用苯酚、苯酚/氯仿、氯仿抽提，用无水乙醇沉淀DNA，然后加入4μ L无菌水溶解沉淀，沉淀即为回收的目的片段。8、PCR产物的克隆使用载体pMD18-T (TaKaRa，Cat. No. D504A)试剂盒进行PCR产物的克隆。具体方法为取步骤7获得PCR回收产物2 μ L，依次加入0. 5 μ L载体pMD18_T、2. 5 μ L Ligase Solution I，然后16°C连接8h。将连接产物用热激法转化大肠杆菌DH5 α，经筛选得到阳性重组克隆，将阳性克隆质粒命名为pkR，用限制性内切酶EcoRI和I^stI进行酶切鉴定，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，表明944bp的目的片段已正确连接入载体PMD18-T中，对pMeR做进一步的测序鉴定，测序结果表明插入片段具有序列表中 SEQ ID NO 3的核苷酸序列。9、GmSGT全基因的克隆根据pGsR的测序结果，设计引物P5和P6PCR扩增GmSGT的全基因序列，引物序列如下P5 :5， -CTGCAGATGGATTATTTCAATGCACCAGGAAG-3，P6 :5， -CTGCAGGTCGACGAATGACTTGTGACTCAAATCCTGG-3，以大豆cDNA为模板，P5和P6为引物，进行PCR扩增。PCR反应条件为94°C lmin,52°C lmin,72°C 1. 5min，共35个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示，回收约1.2bp的PCR产物，将其与载体pMD18-T Simple (TaKaRa, Cat. no. D506A)进行连接，将连接产物用TSS法转化大肠杆菌DH5 α，经筛选得到阳性重组克隆，将阳性克隆质粒命名为PSGT3，对其用限制性内切酶I^stI进行酶切鉴定，酶切鉴定结果表明约1.2bp的目的片段已正确连接入载体pMD18-TSimple中，测序结果表明插入片段具有序列表中SEQ ID NO 1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO :1由 1260个碱基组成，其编码序列为自5，端第146位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸残基序列的蛋白质。进行核苷酸及氨基酸序列比对，比对结果表明该基因与甜瓜eR基因DNA序列的同源性为79. 52% ；其编码的氨基酸序列与甜瓜eR基因所编码的氨基酸序列同源性为88. 03%。实施例2、GmSGT植物表达载体pGmSGT2301的构建一、中间载体pSGT3a构建本实施例所构建的基因GmSGT的表达盒中包括以下基因表达调控元件5’端的 35S启动子、基因GmSGT和3’端的NOS终止子。首先利用限制性内切酶I^stI单切克隆载体 PSGT3，回收1. 2bp的目标片段，连接入载体ρΤΩ4Α。酶切验证1. 2bp的目标片段已连接入 ΡΤΩ4Α(如图 4)。二、GmSGT植物表达载体pGmSGT2301的获得GmSGT植物表达载体pGmSGT2301的具体方法为对质粒载体pSGT3a用限制性内切酶HindIII和EcoRI进行酶切，回收约2100bp的含GmSGT目的表达盒，将其与经相同酶酶切的植物表达载体PCAMBIA2301进行连接，得到GmeR植物表达载体，命名为pGmSGT2301。 对其用限制性内切酶I3StI进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图5所示，酶切产物片段大小为 2100bp，与预期结果相符。实施例3、GmSGT转基因烟草的抗病性鉴定将实施例2构建的植物表达载体pGmSGT2301用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404。 再用叶盘法将整合有pGmSGT2301的根癌农杆菌LBA4404转化子转化烟草NC89，获得GmSGT 转基因烟草20株。采用整株叶片接种法，以非转基因烟草为对照，进行转基因烟草进行青枯病的抗病性鉴定，具体方法如下测定烟草品种抗青枯病的程度，一般在病区的连作田块自然发病，也可以经过人工接种观察对青枯病的抗性。青枯病菌接种体的制备将20°C下保存于无菌水中的青枯菌，在PAD培养基平板上划线，培养于观-30 V下，24h后挑取典型单菌落移置于PAD培养基斜面，在观°C下再培养 24h后用无菌水稀释，稀释成所需要的接菌浓度(3 X IO8个细菌/mL)。将苗龄40天的转基因烟苗，移栽至营养钵中，待烟苗成活后，用根灌菌液的方法， 每株灌20mL的细菌悬浮液，接种后置于恒温室中，并将营养钵中放在盛水的瓷盘中保湿，观察发病情况，并于接种后第7、10、15、21、30天进行调查，计算发病率和病情指
数，病情指数的计算方法为
权利要求
1.大豆酶学抗病基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 1的DNA序列；2)编码序列表中SEQID NO 2的DNA序列；3)高严谨条件下可与序列表中SEQID NO 1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的大豆酶学抗病基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID NO 1 的 DNA 序列。
3.权利要求1所述的大豆酶学抗病基因的编码蛋白，其特征在于所述蛋白是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQID NO 2 ；2)将序列表中SEQID NO 2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有提高植物抗病性的的蛋白质。
4.权利要求3所述的大豆酶学抗病基因的编码蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸残基序列。
5.含有权利要求1或2所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
6.一种提高植物抗病性的方法，是将权利要求1或2所述的大豆酶学抗病基因导入植物组织或细胞，得到抗病性提高的植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述大豆酶学抗病基因通过含有所述大豆酶学抗病基因的植物表达载体导入植物组织或细胞；用于构建所述植物表达载体的出发载体为 pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301 或 pCAMBIA1300。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于用于构建所述植物表达载体的出发载体为 pCAMBIA2301。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述植物表达载体为pGmeR121。
10.大豆GmSGT基因5，UTR序列1)一种与抗病性相关基因GmSGT的启动子序列，其DNA序列如SEQ ID NO 4所示。2)包含SEQID NO 4所述DNA的重组载体。3)根据权利要求含SEQID NO :4的重组载体转化宿主细胞，包括原核细胞和真核细胞。
全文摘要
本发明公开了一个大豆酶学抗病基因，其编码蛋白及其5’UTR序列。其目的是提供一个大豆酶学抗病基因及其编码蛋白在培育高抗病性植物中的应用。该基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)序列表中SEQ ID NO4的DNA序列；5)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。其编码蛋白是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO2；2)将序列表中SEQ ID NO2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有提高植物抗病性的的蛋白质。本发明将在植物病害的防治领域及抗病品种的繁育工作中发挥重要作用。
文档编号C12N15/113GK102242134SQ20101016780
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月11日 优先权日2010年5月11日
发明者刘昱辉, 孙文丽, 李梅, 贾士荣 申请人:中国农业科学院生物技术研究所