专利名称：甘蔗黑穗病菌快速检测方法
技术领域：
本发明涉及植物保护领域，具体是一种快速、准确、操作简单的甘蔗黑穗病菌的检 测方法。
背景技术：
甘蔗(officinarum)是我国最重要的糖料作物和经济作物，同时也是一种重要的 能源植物。目前，甘蔗黑穗病(Ustilago scitaminea Syd.)已成为世界各植蔗区的主要病 害之一，其严重危害甘蔗的生产，对甘蔗的产量和含糖量影响较大，在部分高发病区甘蔗黑 穗病的发病率可达30%以上，尤其以旱地蔗区发生较为严重，因宿根年限的延长、黑穗病孢 子的积累和再侵染，甘蔗黑穗病的发生率有逐年加重的趋势，检测该病病原菌将有助于甘 蔗抗黑穗病育种研究。甘蔗黑穗病是由黑粉菌引起的一种真菌病害，指示植物法和电镜技术检测法均可 进行甘蔗黑穗病菌的检测，但是由于指示植物法需要耗费大量的时间且受外界因素影响， 检测的准确性和可靠性较差；电镜技术检测能直观的观察到病原菌，诊断比较可靠，但仪器 昂贵、程序繁琐。建立一种快速有效的检测甘蔗黑穗病的方法，将有利于在发病前期做好病 原的防治和处理，同时也为甘蔗抗黑穗病育种工作提供更加有力的证据。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘蔗黑穗病菌的检测方法，能够快速、准确地分离并准 确地检测甘蔗黑穗病菌。本方法采用弹射接种法将甘蔗黑穗病菌接种于马丁氏培养基中，使其产生单孢， 挑取甘蔗黑穗病的单孢于液体的马铃薯培养基中培养出大量的甘蔗黑穗病菌，并提取其基 因组DNA进行分子检测。只需要约一周的时间，即可以有效地分离和检测甘蔗黑穗病。本 方法具有快速、高效、结果稳定等特点。本发明的具体实施步骤如下1.单孢分离采集初形成但尚未破出叶鞘的黑穗病甘蔗植株顶端部分，长约 30-40cm，用无菌牛皮纸信封包好，太阳下爆晒或在60度的烘箱中烤6个小时左右，以除去 甘蔗茎干中的部分水分，有利于分离甘蔗黑穗病的单孢菌落。在超净工作台中打开牛皮纸 信封，将采集到的黑穗病甘蔗植株用75%酒精棉球擦洗茎的表面，用手剥开两片叶鞘，在无 菌报纸上横向切开至可见到黑色粉末，即是黑色冬孢子，用经灭菌的解剖针挑取少许黑色 冬孢子，弹射接种于马丁氏培养基表面。为了保证能培养到单孢菌落，同一解剖针挑取的冬 孢子可以敲于多个培养皿中，28°C黑暗培养，观察黑粉菌的生长情况，在马丁氏培养基上获 得纯白色菌丝，密生，初步认为分离物是甘蔗黑穗病菌。挑取单孢菌落于含10-50mg/L链霉 素马铃薯液体培养基中摇菌，28°C，220rpm黑暗培养36小时左右，可获得大量的病原菌。2.黑穗病基因组DNA的提取离心收集甘蔗黑穗病菌体，经液氮冷冻研磨，以CTAB 法提取甘蔗黑穗病菌的基因组DNA。操作的步骤如下
(1)离心收集甘蔗黑穗病菌体，经液氮冷冻研磨，加入少许石英砂和PVP，迅速研 磨；(2)将样品迅速转移至2. Oml离心管中，加入800μ 1经65 °C预热的DNA提取缓冲 液(100mmol/L Tris-Cl, pH8. 0 ；20mmol/L EDTA，pH8.0 ； 1. 4mol/LNaCl ；2% CTAB ；2% PVP), 加入4ul β -巯基乙醇，混勻后65°C保温30min，其间轻柔摇动2_3次；(3)取出离心管，冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混勻至乳白 色，室温静置IOmin ；(4) 10，OOOrpm,离心 IOmin ；(5)缓慢地用枪头吸出上清液，转移约600ul至另一 2. Oml无菌离心管中，加入2 倍体积的无水乙醇，轻缓颠倒混勻，-20°C放置30-60min ；(6) 12，OOOrpm,离心 lOmin，弃上清液；(7)用Iml 75%乙醇洗沉淀两次，吹干，溶于800 μ 1 TE (ρΗ 8. 0)中；(8)加入 2μ 1 5mg/ml 的 RNase，37°C，温育 Ih ；(9)加入等体积的氯仿/异戊醇进行抽提1-2次，10，OOOrpm离心IOmin ；(10)吸取上清液，加入1/10体积的的NaAc (3mol/L ρΗ 5. 2)和2倍体积的无水乙 醇-20°C放置Ih左右；(11)4°C，12，OOOrpm 离心 IOmin ；(12)弃上清，用75%乙醇洗沉淀两次；(13)吹干，溶于50 μ 1 ddH20中，_20°C保存。取2 μ 1样品进行电泳分析。3.甘蔗黑穗病的检测以甘蔗黑穗病菌基因组DNA为模板，采用真菌核糖体基因转录间隔 区(ITS)的通用引物 ITS3 禾Π ITS4, ITS3 :5，-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3，；ITS4 5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，。扩增真菌的核糖体转录间隔区中的一段，目的片段大小 480bp，按下列反应体系进行PCR扩增。
混勻，稍离心，置于PCR仪上扩增，程序如下预变性94°C，3min ；循环参数为94°C，30s ；53°C，30s ；72°C,40s ；30cycles，最后 72°C，7min，4°C保存。PCR 产物进行 琼 脂糖凝胶电泳分析并照相。本发明的优点和积极效果添加有孟加拉红与链霉素的马丁氏培基养可抑制放线菌和细菌生长，在此基础上 再用马铃薯液体培养基对病原菌进行培养，使甘蔗黑穗病的真菌性病原菌能很好地被分离 出来，并能获得大量的病原菌菌体，效果比较明显。本发明用经灭菌的解剖针弹射接种法将黑色冬孢子接种于马丁氏培养基表面，使 用同一解剖针挑取的冬孢子敲于多个培养基中，保证能培养到病原菌的单个孢子。与常规 的利用无菌水稀释，显微镜观察的方法相比，此方法具有快速、简单易行、分离效果好等特
点ο利用离心的方法收集菌丝体代替传统的棉花过滤方法，并以CTAB法提取甘蔗黑 穗病菌的基因组DNA，应用分子生物学的方法，以通用引物对甘蔗黑穗病菌的基因组DNA进 行PCR检测，通过测序还可以对分离获得的真菌进行分类鉴定分析等研究，总之，本方法具 有快速、高效、准确性好等特点。
权利要求
一种甘蔗黑穗病菌快速检测方法，其特征是在甘蔗黑穗病病发的甘蔗植株中提取分离获得甘蔗黑穗病菌，对甘蔗外表面进行的无菌处理，在分离真菌的马丁氏培养基中筛选获得单孢菌落，取单孢菌落于马铃薯液体培养基中培养得到大量的病原菌；通过CTAB法提取甘蔗黑穗病菌的基因组DNA，以真菌核糖体基因转录间隔区ITS的通用引物ITS3和ITS4，扩增真菌的核糖体转录间隔区中的一段，目的片段大小480bp，若能扩增获得480bp的目的片段，则初步证明分离获得了甘蔗黑穗病菌，对PCR产物进行测序则进一步证明分离获得了甘蔗黑穗病菌。
2.根据权利要求1所述的甘蔗黑穗病菌快速检测方法，其特征是从田间取回尚未破 出叶鞘的黑穗病甘蔗植株顶端部分，取其顶端30-40cm长的一段作为材料。
3.根据权利要求1或2所述的甘蔗黑穗病菌快速检测方法，其特征是将材料置于干 净的牛皮纸袋子中在太阳下晒或在60度的烘箱中烤6个小时左右；在超净工作台中，利用 75%的乙醇对甘蔗茎干进行表面除菌后，剥开两片甘蔗叶鞘，在无菌报纸上横向切开甘蔗， 用接种针挑取横切面中的黑色冬孢子，采用弹射接种法将一次挑取的黑粉接种于多个马丁 氏培养基中，经28°C黑暗培养约两天，得到甘蔗黑穗病的单孢菌落。
4.根据权利要求1所述的甘蔗黑穗病菌快速检测方法，其特征是在马丁氏培养基上 获得纯白色菌丝，密生，初步认为分离物是甘蔗黑穗病菌，利用马铃薯液体培养基培养获得 大量的甘蔗黑穗病菌。
全文摘要
一种甘蔗黑穗病菌检测方法，在甘蔗黑穗病病发的甘蔗植株中提取分离获得甘蔗黑穗病菌，对甘蔗外表面进行的无菌处理，在分离真菌的马丁氏培养基中筛选获得单孢菌落，取单孢菌落于马铃薯液体培养基中培养得到大量的病原菌；通过CTAB法提取甘蔗黑穗病菌的基因组DNA，以真菌核糖体基因转录间隔区ITS的通用引物ITS3和ITS4，扩增真菌的核糖体转录间隔区中的一段，目的片段大小480bp，若能扩增获得480bp的目的片段，则初步证明分离获得了甘蔗黑穗病菌，对PCR产物进行测序则进一步证明分离获得了甘蔗黑穗病菌。
文档编号C12Q1/68GK101880720SQ20101023053
公开日2010年11月10日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者刘家勇, 卢文洁, 吴才文, 吴转娣, 夏红明, 昝逢刚, 李文凤, 杨昆, 赵俊, 赵培方, 黄应昆 申请人:云南省农业科学院甘蔗研究所