专利名称：一种emb B基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种embB 基因突变检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
乙胺丁醇(EMB)是1961年发现的一种具有抗分枝杆菌活性的合成药物，是第一 线抗结核药物。EMB是一种阿拉伯糖类似物，作用于靶分子阿拉伯糖基转移酶，抑制了 阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳聚糖，从而影响细胞壁分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖 复合物的形成，导致菌细胞的死亡，同时它也使靶分子在细胞内的药物(如利福平)更容 易进入细胞内，而与利福平联合应用时具有协同抗结核作用。最近的研究表明结核菌耐 EMB与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embABC操纵子突变或emb蛋白过度表达有关，该 操纵子由emb A、emb B和emb C等3个基因组成，其中emb B基因(尤其是306位密码 子)突变是耐乙胺丁醇产生的主要原因。结核分枝杆菌embB基因约3246bp，编码一个糖基转移酶emb B，基因突变使糖 基转移酶结构改变，影响了乙胺丁醇和糖基转移酶的相互作用，从而导致耐乙胺丁醇的 产生。emb B基因突变主要发生在codon 306，其为codon 306的Met(ATG) — lie (ATC/ ΑΤΑ/ATT)或 Leu(CTG)或 Val(GTG)，codon 285 的 Phe(TTC) — Leu (TTA)、codon 330Phe (TTC) — Val (GTC)、codon406 的 Gly(GGC) — Ala(GCC)或 Asp(GAC)或 Cys (TGC)或 Ser (TCC)、codon 497 的 Gln (CAG) — Arg (CGG)。目前，对emb B基因突变的检测方法主要有过聚合酶链反应_单链构象多态性 (PCR-SSCP)、PCR限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、PCR直接测序法等，存在灵 敏度低、假阳性率高、稳定性和可重复性差、价格昂贵等缺点，不能满足实际应用的需 要。
发明内容
本发明的目的是提供一种emb B基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用 于检测 emb B 基因常见突变位点codon 306 的 Met(ATG) — lie (ATC/ATA/ATT) 或 Leu(CTG)或 Val(GTG)，codon285 的 Phe(TTC) — Leu(TTA)、codon 330 的 Phe (TTC) — Val (GTC)、codon 406 的 Gly (GGC) — Ala (GCC)或 Asp (GAC)或 Cys (TGC) 或 Ser (TCC)、codon 497 的 Gln (CAG) — Arg (CGG)。实现上述目的的技术方案如下一种emb B基因突变检测液相芯片，包括有(A)针对每种突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物，每种ASPE 引物由5’端的tag序列和3’端的针对突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自 SEQ IDN0.1 SEQ ID NO. 17 ；所述野生型和突变型的特异性引物选自针对codon 285 位点的 SEQ ID NO. 18 及 SEQ ID N0.19、针对 codon 306 位点的 SEQ ID N0.20 及 SEQIDN0.21 25中的一种以上、针对codon 330位点的SEQ ID N0.26及SEQ IDN0.27、针对 codon 406 的 SEQ ID N0.28 及 SEQ ID N0.29 32 中的一种以上、禾口 / 或针对 codon 497 位点的 SEQ ID N0.33 及 SEQ ID N0.34 ；(B)anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ IDN0.35 SEQIDN0.51，并能相应地与(A)中所选的微球上tag序列互补配对，且所 述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增出需要检测的、具有突变位点的目标序列的引物。优选地，所述扩增引物为针对codon 285、codon306和/或codon 330突变位点 的 SEQ ID N0.52 及 SEQ ID N0.53,针对 codon 406 的 SEQ ID N0.54 及 SEQ ID N0.55, 和 / 或针对 codon 497 位点的 SEQID N0.56 及 SEQ ID N0.57。优选地，所述ASPE引物为，由SEQ ID N0.1和SEQ ID NO. 18组成的序列及由 SEQ ID N0.2 和 SEQ ID NO. 19 组成的序列、由 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.20 组成的序 列及选自如下至少一种序列由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.21组成的序列，由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.22组成的序列，由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.23组成的序列，由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.24组成的序列，由SEQID N0.8和SEQ ID N0.25组成的序列、由 SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.26组成的序列及由SEQ IDN0.10和SEQ ID N0.27组成的序 列、由SEQ ID NO. 11和SEQ ID N0.28组成的序列及选自如下至少一种序列由SEQ ID N0.12和SEQIDN0.29组成的序列，由SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.30组成的序列，由 SEQ ID NO. 14 禾Π SEQ ID Ν0.31 组成的序列，由 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID N0.32 组成的序 列、禾口 /或由SEQ ID NO. 16和SEQ ID N0.33组成的序列及由SEQ ID NO. 17和SEQ ID N0.34组成的序列。本发明的主要优点在于(1)本发明所提供的emb B基因突变检测液相芯片具的检测结果与测序法的吻合 率高达100%。所制备的emb B基因突变检测液相芯片具有很好的信号-噪声比，并且 所涉及的探针以及anti-TAG序列之间基本上不存在交叉反应，TAG标签序列、anti_TAG 标签序列的选取以及TAG标签序列与具体ASPE引物的结合，均能够避免交叉反应，实 现多个突变位点并行检测。(2)本发明所提供的ASPE引物特异性引物，能够灵敏特异地识别目标检测的 突变位点。在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的 PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，除了能够单独检测codon 306、codon 330、 codon 406或codon 497突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的SNP情况，检测
效果一致。(3)本发明设计的ASPE特异引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型号的
基因型。(4)本发明的检测方法步骤简单，5种基因突变检测可通过一步PCR即可完成含 有目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因 而可大大提高检测的准确率，同时能够定性、定量分析的特征。(5)本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高、检测结果可重复性差的缺陷， 同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备的微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提 高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例Iemb B基因突变检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对 emb B 基因的突变位点codon 285 的 Phe (TTC) — Leu (TTA)，codon 306 的 Met(ATG) — lie (ATC/ATA/ATT)或 Leu(CTG)或 Val (GTG)，codon 330 的 Phe (TTC) — Val (GTC)、codon406 的 Gly (GGC) — Ala (GCC)或 Asp (GAC)或 Cys (TGC) 或 Ser (TCC)，codon 497 的 Gln (CAG) — Arg (CGG)，分别设计特异性引物序列。ASPE 引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表IASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种emb B基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有(A)针对每种突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每种ASPE引物 由5’端的tag序列和3’端的针对突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQID N0.1 SEQIDN0.17;所述野生型和突变型的特异性引物选自针对codon285位点的 SEQ ID NO. 18 及 SEQ ID NO. 19、针对codon 306 位点的 SEQ ID N0.20 及 SEQ ID N0.21 25 中的一种以上、针对 codon33(Hl6mSEQIDN0.26&SEQIDN0.27、针对 codon 406 的SEQ ID N0.28及SEQ ID N0.29 32中的一种以上、和/或针对codon 497位点的SEQ ID N0.33 及 SEQ ID N0.34 ；(B)anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ IDN0.35 SEQ ID N0.51，并能相应地与(A)中所选的微球上tag序列互补配对，且所 述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增出需要检测的、具有突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的embB基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物 为针对 codon285、codon306 和 codon 330 突变位点的 SEQ ID N0.52 及 SEQ ID N0.53， 针对 codon 406 的 SEQID N0.54 及 SEQ ID N0.55，禾口 / 或针对 codon 497 位点的 SEQ ID N0.56 及 SEQ ID N0.57。
3.根据权利要求1所述的embB基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物 为，由SEQID N0.1和SEQ ID NO. 18组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID NO. 19组成 的序列、由SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.20组成的序列及选自如下至少一种序列由SEQ IDN0.4和SEQIDN0.21组成的序列，由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.22组成的序列，由 SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.23 组成的序列，由 SEQ ID N0.7 和 SEQ ID N0.24 组成的序 列和由 SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.25 组成的序列、由 SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.26 组 成的序列及由SEQ ID NO. 10和SEQ ID N0.27组成的序列、由SEQ ID NO. 11和SEQ ID N0.28组成的序列及选自如下至少一种序列由SEQID NO. 12和SEQ ID N0.29组成的 序列，由 SEQIDN0.13和SEQIDN0.30组成的序列，由 SEQID NO. 14 和 SEQ ID N0.31 组成的序列和由SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.32组成的序列、禾口 /或由SEQ ID NO. 16禾口 SEQ ID N0.33组成的序列及由SEQ ID NO. 17和SEQ ID N0.34组成的序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的embB基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括(A)ASPE 引物由 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID NO.18 组成的序列及由 SEQ ID N0.2 禾口 SEQID NO. 19组成的序列、由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.20组成的序列及由SEQ IDN0.4 禾口 SEQ ID N0.21组成的序列，由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.22组成的序列，由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.23组成的序列和由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.24组成的序列，由 SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.25组成的序列、由SEQ ID N0.9和SEQ IDN0.26组成的序列 及由 SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID N0.27 组成的序列、由 SEQ IDNO.ll 和 SEQ ID N0.28 组 成的序列及由SEQ ID NO. 12和SEQ ID N0.29组成的序列，由SEQ ID NO. 13和SEQ ID N0.30组成的序列，由SEQ ID N0.14和SEQ IDN0.31组成的序列，和由SEQ ID NO. 15 禾口 SEQ ID N0.32组成的序列、和由SEQ IDN0.16和SEQ ID N0.33组成的序列及由SEQ ID NO. 17和SEQ ID N0.34组成的序列；(B)有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ IDN0.35 SEQIDN0.51，并能相应地与(A)中所选的微球上tag序列互补配对，且所 述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)扩增引物针对codon 285、codon306 和 / 或 codon 330 突变位点的 SEQ ID N0.52 及 SEQ ID N0.53，针对 codon 406 的 SEQ ID N0.54 及 SEQ ID N0.55，和针对 codon 497 位点的 SEQ ID N0.56 及 SEQ ID N0.57。
5.根据权利要求1所述的embB基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列 为5-10个T。
6.—种用于embB基因突变检测的特异性引物，其特征是，包括有针对codon 285 位点的 SEQ ID N0.18 及 SEQ ID NO.19、针对 codon 306 位点的 SEQ ID N0.20 及 SEQ ID N0.21 25 中的一种以上、针对 codon33(Hl6mSEQIDN0.26&SEQIDN0.27、针对 codon 406 的 SEQ ID N0.28 及 SEQ ID N0.29 32 中的一种以上、和 / 或针对 codon 497 位点的 SEQ ID N0.33 及 SEQ ID N0.34。
全文摘要
本发明公开了一种emb B基因突变检测特异性引物和液相芯片，所述液相芯片包括有ASPE引物，ASPE引物的特异性引物选自针对codon 285位点的SEQ ID NO.18及SEQ IDNO.19、针对codon 306位点的SEQ ID NO.20及SEQ ID NO.21～25中的一种以上、针对codon330位点的SEQ ID NO.26及SEQ ID NO.27、针对codon 406的SEQ ID NO.28及SEQ IDNO.29～32中的一种以上、和/或针对codon 497位点的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34；微球；扩增引物。本发明所提供的emb B基因突变检测液相芯片具的检测结果与测序法的吻合率高达100％，并具有很好的信号-噪声比。
文档编号C12N15/11GK102010906SQ20101053924
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者甘丹翠, 罗彩英, 许嘉森, 陈家欣 申请人:广州益善生物技术有限公司