专利名称：katG、inhA和ndh基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种katG、 inhA和ndh基因突变检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
结核分枝杆菌对抗结核化疗药物异烟胼的耐药机制较为复杂，大部分的结核分 枝杆菌耐药与katG、inhA和ndh等基因突变有关。katG基因(过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因)，其N端编码作用范围广的过 氧化物酶，C端编码过氧化氢酶。此酶在细菌的氧化应激反应中起作用，广泛存在于细 菌中。在结核杆菌中，katG基因编码的过氧化氢酶-过氧化物酶能转化异烟胼成为毒性 形式，这种活化的异烟胼形式能与分枝杆菌分枝菌酸生化合成途径中的编码烯酯酰载体 蛋白还原酶-NADH复合体结合，抑制其活性，进而干扰分枝菌酸合成，发挥抗菌作用。 katG基因突变常见第315位密码子AGC突变为ACC/ACA/AAC/ATC/CGC (Ser — Thr/ Asn/Ile/Arg), katG基因突变后，过氧化氢酶-过氧化物酶空间构型改变，活性降低或 丧失，与异烟胼结合能力下降，阻止异烟胼转换成活性形式，进而导致耐药性表型。此 外，katG基因第463密码子的突变(Arg —Leu)使MspI限制性内切酶酶切位点丢失，导 致亲水性精氨酸被疏水性亮氨酸代替，使异烟胼和过氧化氢_过氧化物酶作用靶位发生 改变，也会产生异烟胼耐药。inhA基因是一种与分枝菌酸生物合成有关的烯酰基还原酶的编码基因。异烟胼 进入菌体后，在分枝杆菌过氧化氢_过氧化物酶的作用下氧化脱氢生成亲电子形式，这 种形式能与分枝菌酸生化合成途径中的烯酰基还原酶-还原型烟酰胺二核苷酸复合体结 合，干扰分枝菌酸合成而发挥抗菌作用。研究发现，inhA基因的突变率较高的主要在 C(_15)T。ndh基因编码NADH脱氢酶II，该基因发生突变将导致酶活性下降，继而导致 NADH/NAD+比例增加，此时高浓度的NADH能竞争性抑制INH-NAD+结合到inhA活 性位点，同时还可竞争性抑制katG对异烟胼的活化，导致菌株产生耐药。ndh最常见突 变位点为突变位点AllOG和G268A。目前对katG、inhA和ndh基因突变的检测产品主要有实时荧光定量PCR、直接
测序法、变性梯度凝胶电泳、DHPLC等，存在灵敏度低、样品易污染、假阳性率高、不 能确定突变位置、价格昂贵等缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片。该液相 芯片可用于检测katG基因常见突变位点AGC315ACC/ACA/AAC/ATC/CGC和G463T、 inhA基因突变位点C (_ 15) T以及ndh基因突变位点Al 1OG和G268A的野生型和突变型。
实现上述目的技术方案如下一种katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片，主要包括有(A)针对每种突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物，每种ASPE 引物由5’端的tag序列和3’端的针对突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自 SEQ IDN0.1 SEQ ID N0.14 ；所述野生型和突变型的特异性引物选自针对katG基 因codon315位点的SEQ ID NO. 15及SEQ ID N0.16 20中的一种以上、针对katG基因 G463T 位点的 SEQ ID N0.21 及 SEQ ID N0.22、针对 inhA 基因 C (-15) T 位点的 SEQ ID N0.23 及 SEQ ID N0.24、针对 ndh 基因 AllOG 的 SEQ ID N0.25 及 SEQ ID N0.26、禾口 / 或针对 ndh 基因 G268A 位点的 SEQ ID N0.27 及 SEQ ID N0.28 ；(B)有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自 SEQ IDN0.29 SEQ ID N0.42，并能相应地与(A)中所选的微球上tag序列互补配对， 且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增出需要检测的、具有突变位点的目标序列的引物。所述扩增引物优选为针对katG基因codon 315位点的SEQ ID N0.43及SEQ ID N0.44、针对 katG 基因 G463T 位点的 SEQ ID N0.45 及 SEQ ID N0.46、针对 inhA 基因 C (-15) T 位点的 SEQ ID N0.47 及 SEQ ID N0.48、针对 ndh 基因 AllOG 的 SEQ ID N0.49 及 SEQ ID N0.50、禾Π / 或针对 ndh 基因 G268A 位点的 SEQ ID N0.51 及 SEQ ID N0.52。优选地，所述ASPE引物为由SEQ ID N0.1和SEQ ID NO. 15组成的序列及选 自如下至少一种序列由SEQ ID N0.2和SEQ ID NO. 16组成的序列，由SEQ ID N0.3和 SEQ IDN0.17 组成的序列，由 SEQ ID N0.4 禾口 SEQ ID NO. 18 组成的序列，由 SEQ ID N0.5 和SEQ IDNO. 19组成的序列，由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.20组成的序列、由SEQ ID N0.7禾Π SEQ IDNO.21组成的序列及由SEQ ID Ν0.8禾口 SEQ ID Ν0.22组成的序列、由SEQ ID Ν0.9和SEQ IDN0.23组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID N0.24组成的序列、 由 SEQ ID NO. 11 和 SEQID N0.25 组成的序列及由 SEQ ID NO. 12 和 SEQ ID N0.26 组成 的序列、禾口 /或由SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.27组成的序列及由SEQ ID N0.14和SEQ ID N0.28组成的序列。本发明的另一目的是提供一种katG、inhA和ndh基因突变检测特异性引物。具体技术方案下一种katG、inhA和ndh基因突变检测特异性引物，包括有针 对katG基因codon 315位点的SEQ ID NO. 15及SEQ ID N0.16 20中的一种以上、针 对 katG 基因 G463T 位点的 SEQ ID N0.21 及 SEQ ID N0.22、针对 inhA 基因 C (-15) T 位 点的 SEQ ID N0.23 及 SEQ IDN0.24、针对 ndh 基因 A110G 的 SEQ ID N0.25 及 SEQ ID N0.26、禾Π / 或针对 ndh 基因 G268A 位点的 SEQ ID N0.27 及 SEQ ID N0.28。本发明的主要优点在于(1)本发明所提供的katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片的检测结果与测 序法的吻合率高达100%，且检测所需的时间远远低于常用的测序技术。且所述检测液相 芯片具有很好的信号-噪声比，并且所涉及的探针以及anti-TAG序列之间基本上不存在 交叉反应，TAG标签序列、anti-TAG标签序列的选取以及TAG标签序列与具体ASPE弓丨 物的结合，均能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。(2)本发明所提供的ASPE引物特异性引物，能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点。在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的 PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，除了能够单独检测katG、inhA或ndh基因突 变情况，也能够同时并行检测多个基因突变位点的突变情况，检测效果一致。(3)本发明设计的ASPE特异引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型号的
基因型。(4)本发明的检测方法步骤简单，5种基因突变检测可通过一步PCR即可完成含 有目标突变位点的序列扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定 因素，因而可大大提高检测的准确率，同时能够定性、定量分析的特征。(5)本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高、检测结果可重复性差的缺陷， 同时对现有的液相芯片激素和进行改进，使得所制备的微球能适用于不同的检测项目， 具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提 高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例1 katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对katG 基因的突变位点 codon 315AGC — ACC/ACA/AAC/ATC/CGC 和 G463T、inhA基因突变位点C(_15)T以及ndh基因突变位点AllOG和G268A的野生型 和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组 成。ASPE引物序列如下表所示表1 ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有(A)针对每种突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物，每种ASPE引物 由5’端的tag序列和3’端的针对突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQ IDN0.1 SEQIDN0.14;所述野生型和突变型的特异性引物选自针对katG基因codon 315位点的SEQ ID NO. 15及SEQ ID NO. 16 20中的一种以上、针对katG基因G463T位 点的 SEQ ID N0.21 及 SEQ ID N0.22、针对 inhA 基因 C (-15) T 位点的 SEQ IDN0.23 及 SEQIDN0.24、针对 ndh 基因 AllOG 的 SEQ ID N0.25 及 SEQ ID N0.26、和 / 或针对 ndh 基因 G268A 位点的 SEQ ID N0.27 及 SEQ ID N0.28 ；(B)有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ IDN0.29 SEQ ID N0.42，并能相应地与(A)中所选的微球上tag序列互补配对，且所 述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增出需要检测的、具有突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片，其特征是，所述 扩增引物为针对katG基因codon 315位点的SEQ ID N0.43及SEQ ID N0.44、针对katG基 因 G463T 位点的 SEQ ID N0.45 及 SEQ ID N0.46、针对 inhA 基因 C (-15) T 位点的 SEQ ID N0.47 及 SEQ ID N0.48、针对 ndh 基因 AllOG 的 SEQ ID N0.49 及 SEQ ID N0.50、禾Π / 或 针对 ndh 基因 G268A 位点的 SEQ ID N0.51 及 SEQ ID N0.52。
3.根据权利要求1或2所述的katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片，其特征是， 所述ASPE引物为由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.15组成的序列及选自如下至少一种序 列由 SEQ ID N0.2 和 SEQ ID NO. 16 组成的序列，由 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID NO. 17 组成 的序列，由 SEQ ID N0.4 和 SEQ ID NO. 18 组成的序列，由 SEQ ID N0.5 和 SEQ ID NO. 19 组成的序列和由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.20组成的序列、由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.21组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.22组成的序列、由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.23组成的序列及由SEQ ID NO. 10和SEQ ID N0.24组成的序列、由SEQ ID NO. 11 禾口 SEQ ID N0.25组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID N0.26组成的序列、和/或由 SEQ ID NO. 13 和 SEQID N0.27 组成的序列及由 SEQ ID N0.14 和 SEQ ID N0.28 组成的序 列。
4.根据权利要求1所述的katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片，其特征是，主 要包括有(A)ASPE引物由 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID NO.15 组成的序列及由 SEQ ID N0.2 禾口 SEQ ID NO. 16组成的序列，由SEQ ID N0.3和SEQ ID NO. 17组成的序列，由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO. 18组成的序列，由SEQ ID N0.5和SEQ ID NO.19组成的序列，和由 SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.20 组成的序列、由 SEQ ID N0.7 和 SEQ ID N0.21 组成的序 列及由 SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.22 组成的序列、由 SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.23 组 成的序列及由SEQ ID NO. 10和SEQ ID N0.24组成的序列、由SEQ ID NO. 11和SEQ ID N0.25组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID N0.26组成的序列、和由SEQ ID NO. 13 禾口 SEQ ID N0.27组成的序列及由SEQ ID NO. 14和SEQ ID N0.28组成的序列；(B)有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ IDN0.35 SEQ ID N0.51，并能相应地与(A)中所选的微球上tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)扩增引物:针对 katG 基因 codon315 位点的 SEQIDN0.43&SEQIDN0.44、针 对 katG 基因 G463T 位点的 SEQ D N0.45 及 SEQ ID N0.46、针对 inhA 基因 C (-15) T 位 点的 SEQ ID N0.47 及 SEQ ID N0.48、针对 ndh 基因 AllOG 的 SEQ ID N0.49 及 SEQ ID N0.50、禾Π / 或针对 ndh 基因 G268A 位点的 SEQ ID N0.51 及 SEQ IDN0.52。
5.根据权利要求1所述的katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片，其特征是，所 述间隔臂序列为5-10个T。
6.—种katG、inhA和ndh基因突变检测特异性引物，其特征是，包括有针对katG基因 codon 315位点的SEQ IDN0.15及SEQ ID NO. 16 20中的一种以上、针对katG基因G463T 位点的 SEQ ID N0.21 及 SEQ ID N0.22、针对 inhA 基因 C (-15) T 位点的 SEQ IDN0.23 及 SEQ ID N0.24、针对 ndh 基因 AllOG 的 SEQ ID N0.25 及 SEQ ID N0.26、禾Π / 或针对 ndh 基因 G268A 位点的 SEQ ID N0.27 及 SEQ ID N0.28。
全文摘要
本发明公开了一种katG、inhA和ndh基因突变检测特异性引物和液相芯片，所述液相芯片主要包括有ASPE引物，每种ASPE的特异性引物选自针对katG基因codon 315位点的SEQ IDNO.15及SEQ ID NO.16～20中的一种以上、针对katG基因G463T位点的SEQ ID NO.21及SEQ IDNO.22、针对inhA基因C(-15)T位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24、针对ndh基因A110G的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、和/或针对ndh基因G268A位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28；微球；扩增引物。本发明所提供的katG、inhA和ndh基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，且检测所需的时间远远低于常用的测序技术。
文档编号C12N15/11GK102010907SQ201010539249
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者吴诗扬, 罗小笛, 许嘉森, 邓晶晶 申请人:广州益善生物技术有限公司