专利名称：rpsL和rrs基因SNP检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种rpsL和 rrs基因SNP检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
随着分子生物学技术的发展和结核分枝杆菌研究的深入，细菌耐药的分子机理 受到广泛的重视。链霉素(SM)是1945年发明的第一种有效的抗结核氨基环醇糖苷类抗 生素，目前仍是结核病治疗的一线药物。SM主要作用于结核分枝杆菌的核糖体，诱导 遗传密码的错读，抑制mRNA转译的开始，干扰转译过程中的校对，从而抑制蛋白质合 成。最近研究表明，核糖体蛋白S12编码基因(rpsL)和16S rRNA编码基因(rrs)突 变将导致结核分支杆菌对链毒素耐药。在结核菌耐链霉素菌株中，70% 85%由rpsL和 rrs基因突变所致。核糖体蛋白S12的作用是维持读码过程中的一些轻微的不准确性，rpsL基因突 变就会导致S12蛋白改变，而严格要求核糖体只使用与每一密码对应的氨酰-tRNA，更 准确地表达mRNA上的每一个密码，从而抑制了 SM诱导的遗传密码错读而产生耐药 性。rrs基因是16S rRNA编码基因，16S rRNA上的530发夹环是整个16S rRNA上最保 守的序列，它参与A位tRNA核糖体的译码过程，在RNA翻译过程中起重要作用。它的 这种作用与530发夹环上的513 516位碱基和相邻510区域凸出环上的491 497位碱 基对所产生的假结构有关。rpsL基因突变主要发生在两个部位43位和88位的赖氨酸(Lys)密码子(AAG) 突变成精氨酸(Arg)密码子(AGG)，rrs基因的主要突变位点为G426C、C491T、A513C/ T、C516T。据统计，结核分枝杆菌SM耐药分离株有rpsL基因点突变的占48.6%，有 rrs基因点突变的占29.0%，这两个基因双重突变的占1 %，未发现基因突变的占21.5%。 而rpsL基因突变82.7%发生在第43位氨基酸密码子，17.3%发生在第88位氨基酸密码 子。由此可见，约1/2的结核分枝杆菌分离株SM耐药产生是由于rpsL基因突变所致， 而最常见的突变位点是第43位密码子。目前对rpsL和rrs基因突变的检测产品主要有实时荧光定量PCR、直接测序法、 变性梯度凝胶电泳、DHPLC等，存在灵敏度低、样品易污染、假阳性率高、不能确定突 变位置、价格昂贵等缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种rpsL和rrs基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可 用于检测rpsL基因常见突变位点A43G和A88G、rrs基因常见突变位点G426C、C491T、 A513C/T和C516T的野生型和突变型。实现上述目的的技术方案如下
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一种rpsL和rrs基因SNP检测液相芯片，主要包括有(A)针对每种突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物，每种ASPE引 物由3’端的针对突变位点的特异性引物和5’端的tag序列组成，所述tag序列选自SEQ IDN0.1 SEQIDN0.13;所述野生型和突变型的特异性引物选自针对rpsL基因A43G 位点的 SEQ ID N0.14 及 SEQ ID N0.15、针对 rpsL 基因 A88G 位点的 SEQ ID N0.16 及 SEQ ID NO. 17,针对 rrs 基因 G426C 位点的 SEQ ID N0.18 及 SEQ ID N0.19、针对 rrs 基 因 C491T 的 SEQ ID N0.20 及 SEQ ID N0.21、针对 rrs 基因 A513C/T 的 SEQ IDN0.22 及 SEQ ID N0.23 SEQ ID N0.24、禾口 / 或针对 rrs 基因 C516T 位点的 SEQ IDN0.25 及 SEQ ID N0.26 ；(B)有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自 SEQ IDN0.27 SEQ ID N0.39，并能相应地与(A)中所选的微球上tag序列互补配对， 且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增出需要检测的、具有突变位点的目标基因序列的引物。所述引物优选为针对rpsL基因的SEQ ID N0.40 SEQ ID N0.41，禾Π /或针 对 rrs 基因的 SEQID N0.42 SEQ ID N0.43。所述ASPE引物为针对rpsL基因A43G位点的由SEQIDN0.UPSEQIDN0.14 组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID NO. 15组成的序列、针对rpsL基因A88G位点的 由SEQ ID N0.3和SEQ ID NO.16组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID NO. 17组成的 序列、针对rrs基因G426C位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.18组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID N0.19组成的序列、针对rrs基因C491T的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.20组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.21组成的序列、针对rrs基因A513C/ T 的由 SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.22 组成的序列及由 SEQID NO. 10 和 SEQ ID N0.23 组 成的序列，由SEQIDN0.11和SEQIDN0.24组成的序列、和/或针对rrs基因C516T位 点的由 SEQ ID NO.12 和 SEQ ID N0.25 组成的序列及由 SEQ ID N0.13 和 SEQ IDN0.26 组 成的序列。本发明的另一目的是提供一种用于rpsL和rrs基因SNP检测的特异性引物。实现上述目的的技术方案如下一种用于rpsL和rrs基因SNP检测的特异性引物，包括有针对rpsL基因A43G 位点的 SEQID NO. 14 及 SEQ ID N0.15、针对 rpsL 基因 A88G 位点的 SEQ ID NO. 16 及 SEQ ID NO.17、针对 rrs 基因 G426C 位点的 SEQ ID NO.18 及 SEQ ID NO.19、针对 rrs 基 因 C491T 的 SEQ ID N0.20 及 SEQ ID N0.21、针对 rrs 基因 A513C/T 的 SEQ ID N0.22 及 SEQ ID N0.23 SEQ ID N0.24、禾口 / 或针对 rrs 基因 C516T 位点的 SEQ ID N0.25 及 SEQ ID N0.26。本发明的主要优点在于(1)本发明所提供的rpsL和rrs基因SNP检测液相芯片的检测结果与测序法的吻 合率高达100%，而所需要的时间远远低于常用的测序技术。所制备的rpsL和rrs基因 SNP检测液相芯片具有很好的信号_噪声比，并且所涉及的探针以及anti-TAG序列之间 基本上不存在交叉反应，TAG标签序列、anti-TAG标签序列的选取以及TAG标签序列与 具体ASPE引物的结合，均能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检测。
(2)本发明所提供的ASPE引物特异性引物，能够灵敏特异地识别目标检测的 突变位点。在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的 PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，除了能够单独检测rpsL基因或rrs基因突变情 况，也能够同时并行检测rpsL基因和rrs基因多个突变位点的SNP情况，检测效果一致。(3)本发明设计的ASPE特异引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型号的 基因型。(4)本发明的检测方法步骤简单，6种SNPs检测可通过一步PCR即可完成含有 6个SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不 确定因素，因而可大大提高检测的准确率，同时能够定性、定量分析的特征。(5)本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高、检测结果可重复性差的缺陷， 同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备的微球能适用于不同的检测项目，具 有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提 高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例IrpsL和rrs基因SNP检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对rpsL基因的 SNP 位点 A43G 和 A88G、rrs 基因的 SNP 位点 G426C、C491T、 A513C/T、C516T，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序 列”组成。ASPE引物序列如下表所示表IASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种rpsL和rrs基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有(A)针对每种突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物，每种ASPE引物 由5’端的tag序列和3’端的针对突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQ IDN0.1 SEQIDN0.13;所述野生型和突变型的特异性引物选自针对rpsL基因A43G 位点的 SEQ ID NO. 14 及 SEQ ID N0.15、针对 rpsL 基因 A88G 位点的 SEQ ID NO. 16 及 SEQ ID NO. 17,针对 rrs 基因 G426C 位点的 SEQ ID N0.18 及 SEQ ID N0.19、针对 rrs 基 因 C491T 的 SEQ ID N0.20 及 SEQ ID N0.21、针对 rrs 基因 A513C/T 的 SEQ IDN0.22 及 SEQ ID N0.23 SEQ ID N0.24、禾口 / 或针对 rrs 基因 C516T 位点的 SEQ IDN0.25 及 SEQ ID N0.26 ；(B)有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ IDN0.27 SEQ ID N0.39，并能相应地与(A)中所选的微球上tag序列互补配对，且所 述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增出需要检测的、具有突变位点的目标基因序列的引物。
2.根据权利要求1所述的rpsL和rrs基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述引物为 针对rpsL基因的SEQ ID N0.40 SEQ ID N0.41，和/或针对rrs基因的SEQ ID N0.42 SEQ ID N0.43。
3.根据权利要求1所述的rpsL和rrs基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述ASPE 引物为针对rpsL基因A43G位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.14组成的序列及由 SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.15组成的序列、针对rpsL基因A88G位点的由SEQ ID N0.3 禾口 SEQ ID NO. 16组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID NO.17组成的序列、针对rrs基 因G426C位点的由SEQ ID N0.5和SEQ IDN0.18组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.19组成的序列、针对rrs基因C491T的由SEQID N0.7和SEQ ID N0.20组成的序列及 由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.21组成的序列、针对rrs基因A513C/T的由SEQ ID N0.9 和SEQ ID N0.22组成的序列及由SEQ ID NO. 10和SEQ ID N0.23组成的序列，由SEQ ID NO. 11和SEQ ID N0.24组成的序列、禾Π /或针对rrs基因C516T位点的由SEQ IDN0.12 禾口 SEQ ID N0.25组成的序列及由SEQ ID NO. 13和SEQ ID N0.26组成的序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的rpsL和rrs基因SNP检测液相芯片，其特征是，主 要包括(A)ASPE引物由 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID NO. 14 组成的序列及由 SEQ ID N0.2 禾口 SEQ IDN0.15组成的序列、由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.16组成的序列及由SEQ ID N0.4 禾口 SEQ ID N0.17组成的序列、由SEQ ID N0.5和SEQ ID NO. 18组成的序列及由SEQ IDN0.6和SEQ ID NO. 19组成的序列、由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.20组成的序列及由 SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.21 组成的序列、由 SEQ ID NO.9 和 SEQ ID N0.22 组成的序 列及由 SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID N0.23 组成的序列，由 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0.24 组成的序列、和由SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.25组成的序列及由SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.26组成的序列；(B)有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ IDN0.27 SEQ ID N0.39，并能相应地与(A)中所选的微球上tag序列互补配对，且所 述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)扩增引物针对rpsL基因A43G、A88G突变位点的SEQ ID N0.40及SEQ ID N0.41,和针对 rrs 基因 G426C、C491T、A513C/T 和 C516T 的 SEQ ID N0.42 及 SEQID N0.43。
5.根据权利要求1所述的rpsL和rrs基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂 序列为5-10个T。
6.一种用于rpsL和rrs基因SNP检测的特异性引物，其特征是，包括有针对rpsL 基因A43G位点的SEQ ID N0.14及SEQ ID N0.15、针对rpsL基因A88G位点的SEQ ID N0.16 及 SEQIDN0.17、针对 rrs 基因 G426C 位点的 SEQ ID N0.18 及 SEQ ID N0.19、针 对 rrs 基因 C491T 的 SEQID N0.20 及 SEQ ID N0.21、针对 rrs 基因 A513C/T 的 SEQ ID N0.22 及 SEQ ID NO.23 SEQ IDN0.24、和 / 或针对 rrs 基因 C516T 位点的 SEQ ID N0.25 及 SEQ ID N0.26。
全文摘要
本发明公开了一种rpsL和rrs基因SNP检测液相芯片，主要包括有ASPE引物，所述ASPE引物特异性引物选自针对rpsL基因A43G位点的SEQ ID NO.14及SEQ ID NO.15、针对rpsL基因A88G位点的SEQ ID NO.16及SEQ ID NO.17、针对rrs基因G426C位点的SEQ ID NO.18及SEQ ID NO.19、针对rrs基因C491T的SEQ ID NO.20及SEQ ID NO.21、针对rrs基因A513C/T的SEQ ID NO.22及SEQID NO.23～SEQ ID NO.24、和/或针对rrs基因C516T位点的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26；微球；扩增引物。本发明所提供的rpsL和rrs基因SNP检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，而所需要的时间远远低于常用的测序技术。
文档编号C12N15/11GK102010908SQ201010539269
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者石文香, 罗彩英, 许嘉森, 陈家欣 申请人:广州益善生物技术有限公司