专利名称：一种降解秸秆的微生物菌剂的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物菌剂领域，具体地，涉及一种含有地衣芽孢杆菌 JLC38(Bacillus licheniformis)和魏登施泰滕芽孢杆菌 JLC43(Bacillus weihenstephanensis)的高效降解秸秆的微生物菌剂。
背景技术：
我国作物秸秆资源丰富，数量巨大，种类多样，每年的作物秸秆产出量7 8亿吨。 由于秸秆在短期内不易腐解，利用效率低，绝大部分秸秆废弃或被焚烧，在种植业为主的地区，作物秸秆已经成为生产中的障碍。所以，焚烧秸秆遍及广大乡村，由此引起环境污染与有机资源的严重浪费。据统计，全国用作还田和有机肥料的作物秸秆仅占总量的20%左右， 焚烧占17%，尚有50%未被利用。北方地区夏季干旱高温，不利于小麦秸秆的腐解还田；秋冬季节气候冷凉、土壤干旱、营养贫瘠，不利于玉米秸秆木质素、纤维素的降解。所以突破北方地区不良气候的条件下，秸秆大规模、快速腐熟还田技术瓶颈是实现我国北方地区秸秆利用亟待解决的问题。选育和利用作物秸秆高效降解微生物菌株，研发高效降解菌剂，建立作物秸秆田间原位生物转化还田技术，是目前国内外重要发展趋势之一。秸秆的微生物快速腐熟技术近些年受到高度重视，取得了具有一定的研究进展。 我国研究人员在秸杆降解菌、纤维素降解菌、木质素降解菌、纤维素酶等微生物菌株的筛选方面开展了卓有成效的工作。齐云000；3)从堆肥中筛选得到两株分解纤维素的菌株，一株为高温单孢菌Q0，另一株为芽孢杆菌Q3。吴元喜等(1997)从内蒙古盐碱湖分离一株产木质素酶的嗜碱细菌新种F10，属于双芽孢杆菌属并命名为好纪双芽孢杆菌。宋波和羊键 (2005)从南方各种生态的样品中筛选得到木质纤维素分解菌，从食草动物的粪便中筛选一株降解纤维素的放线菌，初步鉴定为Sti^ptomyces spp.；刘金胜等000 在严格厌氧条件下从水牛粪便和胃残渣中筛选出3株纤维素分解能力较强的细菌，其中以301菌株能力最强。贺芸O006)从高温堆肥中分离得到的一株产胞外耐高温纤维素酶的细菌，鉴定为嗜热脂肪芽孢杆菌。李振红和陆贻通从腐木、腐竹等样品中筛选获得4株高效纤维素降解菌，嗜纤维菌属细菌1株，木霉菌属真菌3株；张淑红从青藏高原冰川雪样中筛选出了一株低温纤维素降解菌，初步鉴定为假单胞菌属。纤维素降解真菌的筛选研究已有较多报道，严文岱等000 以玉米秸杆为碳源， 筛选出6株对天然秸秆纤维素有较强降解能力的菌株；郝月等Q006)筛选出一株纤维素酶高产菌株，经鉴定为青霉菌；孙冬梅O004)从不同生态区域土壤中分离纤维素分解菌，获得了 2株木霉T1、T4和2株毛壳菌G2、G3 ；李杰等Q006)从牛粪中分离到一株降解纤维素的木霉真菌Zl ；郝月等000 从各种土壤及饲料中分离到6株对天然秸秆纤维素有较强降解能力的菌株；徐昶等000 从霉变的玉米芯中筛选到一株高产纤维素酶的灰绿曲霉； 张毅民等000 从堆肥、土壤等样品中筛选到1株霉菌FlO表现出最高酶活力，固体发酵酶活力与绿色木霉AS3. 3711相当；孟会生等Q006)以滤纸液化度及纤维素酶活性为指标，
3筛选降解秸秆能力较强的绿色木霉、哈茨木霉和芽孢杆菌，以绿色木酶为最好，菌株混合发酵，可使纤维分解能力明显提高；姚强000 用液体摇瓶法从碱性土壤中筛选到降解纤维素的哈茨木霉；王晓芳O001)分离一株曲霉B6等。以上菌株用于饲料生产菌，但是它对秸杆还田降解菌的研究具有基石和促进的作用。复合菌系的筛选研究也有一些报道，王伟东等0004,2005)以麦秸垛下的土壤和麦秸堆肥为材料，经过多代淘汰及其不同系之间的组配，最终筛选构建了一组木质纤维素分解菌复合系。史玉英等(1996)滤纸平板法结合摇床培养筛选到2个纤维素分解能力较强的混合菌Ml和M2，经初步鉴定，Ml由木霉Fl和芽孢杆菌Ba组成，M2由木霉F2和芽孢杆菌Ba组成，由真菌、细菌组成的混合菌分解纤维素的能力明显强于其中任何一个单一菌株。崔宗钧等0002，2005，2008)筛选出纤维素降解能力较强的复合系MCI、WSC-6、NSC-7 等，对纤维素有较好的降解能力。从已有的报道可以发现，有关秸秆发酵菌剂的产品非常少，尚未形成体系，更没有稳定高效秸秆快速降解菌群的生产使用。发酵菌剂中，以嗜热的纤维素分解菌为数较多，而常温(低温)发酵的分解纤维素、木质素、蜡质的微生物菌株或菌群的研究远远落后于生产需要。秸秆快速腐解技术尚未得到有效地解决，限制了秸秆资源的高效利用。由此可见，目前的研究包括作物秸杆与腐熟剂一起使用翻入土壤，促进秸杆在土壤中的降解；所有秸杆腐熟剂适合秸杆堆置、高温发酵腐熟；田间不堆置、低温、干旱、营养失衡条件下，秸杆快速腐解的微生物菌剂没有研究报道。国外重视机械化为技术支撑的秸秆还田技术，加拿大、美国、澳大利亚推行免耕留茬还田(范丙全等，2005 ；Bruce等，2005)。同时，仍然重视微生物在秸秆降解还田中的作用研究，一些研究表明，微生物对秸秆腐解具有良好的作用效果。俄罗斯较多的利用真菌复合体降解植物残体以及黑麦秸秆木质素(Varanaite 1999，2005)，利用复合菌系强化小麦秸杆的降解效率具有显著的优越性(Bowen等，1990)。俄罗斯研究了产漆酶真菌INBI 246，经过23天的培养，产漆酶真菌对秸秆木质素、纤维素及半纤维素的分解率为四.8%、 51. 4%和72% (Vasil' chenko,2004)。同时非常重视秸杆纤维素降解菌群的研究，日本获得高效分解水稻秸秆的复合菌群，4d内水稻秸秆降解60% (Haruta等，2002)。泰国利用秸秆降解菌和秸秆生产生物有机肥料(Wisitthaphon，1991)，美国科学家利用秸秆和真菌Panus tigrinus.生产生物肥料(Golovleva等，1987)。为了提高菌株腐解秸秆的效果，研究人员在筛选高效降解纤维素和木质素的真菌(Nandi，2000)、小麦秸秆降解高效的白腐菌(Aerts和Hoozee，. 1987)、降解木质素的白腐菌和褐腐菌(Kang等， 1998)的同时，进行了降解纤维素的基因工程菌、降解木质纤维素和秸秆的基因工程菌的研究(Ramachandra，1987 ；Asghari 等，1996 ；Levasseur 等，2005)。研究显示，采用基因突变获取高效降解秸杆纤维素菌株，增强纤维素酶的表达，能够提高秸杆的降解效率(Khattab 等，2004)。目前分离的具有纤维素降解能力的细菌较多，其中属于革兰氏阳性菌属(G+)的有噬纤维菌(Cytophaga)，热杆菌属(Caldikicillus)，芽孢杆菌属(Bacillus)，生孢嗜纤维菌(Sporacytophga)等；属于革兰氏阴性菌属(G_)的有假单孢菌属(I^eudomonas)，欧文氏菌属(Erwinia)，纤维单孢菌属(Cellulomonas)，镰状纤维菌属(Cellfacicula)等 (Schwarz,2001 ；Lynd,2002 ；Kenyon，2005)。
真菌的胞外纤维素酶活较强，尤其以青霉属(Penicillium)，木霉属 (Trichderma)，毛壳霉属(Chaetomium)曲霉属(Aspergillus)禾口根霉属(Rhizopus)，其中以木霉属(Trichderma)、黑曲霉(Aspergillus niger)研究的较多，它们往往被用在工业酶的生产，以提高纤维素类物质的资源转化率(Wood，1994 ； Itavaara, 1999 ；Lynd, 2002)。综上所述，利用秸秆降解微生物进行玉米、小麦、水稻秸秆的降解与原位还田具有巨大的应用潜力。芽孢杆菌属是一类重要的具有较强纤维素降解能力的微生物种群，它们降解秸秆纤维木质素的研究已有报道，而地衣芽孢杆菌作为高效降解秸秆的微生物菌剂及其秸秆降解效果鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效降解秸秆的微生物菌剂。为了实现本发明的目的，本发明的高效降解秸秆的微生物菌剂，其有效成分包括地衣芽孢杆菌JLC38 (Bacillus licheniformis)；魏登施泰滕芽孢杆菌JLC43 (Bacillus weihenst印hanensis)。其中，本发明的地衣芽孢杆菌JLC38菌株，其分类命名为Bacillus licheniformis，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO. 4389，保藏日期2010年12月1日。本发明的魏登施泰滕芽孢杆菌JLC43菌株，其分类命名为Bacillus weihenstephanensis,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC N0. 4391，保藏日期2010年12月 1曰。本发明的高效降解秸秆的微生物菌剂，其包括如下重量份的组分地衣芽孢杆菌JLC381份；魏登施泰滕芽孢杆菌JLC431份；添加剂3-12份。优选的为地衣芽孢杆菌JLC381份；魏登施泰滕芽孢杆菌JLC431份；添加剂6-8份。其中，地衣芽孢杆菌JLC38含量达到2X 108cfu/g以上，魏登施泰滕芽孢杆菌 JLC43含量为2X 108cfu/g以上，所述的添加剂为草炭、硅藻土或轻质碳酸钙，同时可加入适
量的微量元素。上述微量元素中通过添加H3BO3、MnSO4 · 7H20、ZnSO4 · 7H20、CuSO4 · 5H20、 (NH4) 6Mo7024 · 4H20 和 / 或 CO (NO3) · 6H20 来提供。本发明还提供上述微生物菌剂在高效降解秸秆中的应用，其中所述秸秆为农作物秸秆，包括小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆等。 本发明还提供上述微生物菌剂在促进秸秆原位还田中的应用。
本发明还提供上述微生物菌剂在提高土壤腐殖质和作物增产中的应用。
本发明还提供上述微生物菌剂在利用秸秆生产有机肥中的应用。本发明的魏登施泰滕芽孢杆菌JLC43和地衣芽孢杆菌JLC38菌株，是从我国吉林省安图长白山腐殖质层中分离到的高效秸秆降解菌。本发明的地衣芽孢杆菌JLC38的微生物学特性为将地衣芽孢杆菌JLC38菌株接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，30°C培养，菌落白色，无光泽，边缘不整齐。菌体杆状，具有运动性，周生鞭毛，有芽孢，革兰氏阳性；化能异养，需氧，无需光照；在10°C 55°C范围内均能生长，65°C不能生长；在pH5. 7 6. 8内均能生长；在2%、5%、7% NaCl中生长正常；利用柠檬酸盐、丙二酸盐，不利用尿素盐；液体培养生长迅速，明胶穿刺培养阳性；利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇；接触酶阳性。本发明的魏登施泰滕芽孢杆菌几C43的微生物学特性为将魏登施泰滕芽孢杆菌几C43接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，30°C培养，菌落乳白色，有光泽，边缘不整齐；菌体为杆状，具运动性，周生鞭毛，有芽孢，革兰氏阳性；化能异养，需氧，无需光照；在5°C 30°C 范围内均能生长，40°C 65°C不能生长；pH5. 7 6. 8内均能生长；在2%、5%、7% NaCl中生长不固定；利用柠檬酸盐，丙二酸盐不确定，不利用尿素盐；液体培养生长迅速，明胶穿刺培养阳性；利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇；接触酶阳性。本发明提供的地衣芽孢杆菌JLC38 (Bacillus licheniformis)和魏登施泰滕芽孢杆菌JLC43 (Bacillus weihenst印hanensis)，它们在田间条件下具有突出的降解小麦秸秆的能力。田间覆盖秸秆使用菌剂3周后，秸秆外观变灰黑色，发脆易谇断；不施菌对照小区秸秆外观变化不明显，不易折断。秸秆中纤维素降解量提高65%以上，木质素降解量提高 33. 3%，半纤维素降解量提高25. 3%。本发明的微生物菌剂，与秸秆一起使用翻压还田，促进秸秆在土壤中的快速腐解， 与不接种菌剂的对照相比，秸秆纤维素降解量提高33. 9 %，木质素降解量提高40. 2 %，半纤维素降解量提高31.4%。适用于北方的小麦秸秆的原位覆盖降解还田和原位翻压腐解还
田ο另外，使用尿素调控作物秸秆的碳氮比，同时使用适宜种类和数量的保水剂，可以达到延长秸秆降解菌株的存活时间，提高降解菌株的作用效果。本发明的含有地衣芽孢杆菌JLC38 (Bacillus licheniformis)和魏登施泰滕芽孢杆菌JLC43 (Bacillus weihenst印hanensis)的微生物菌剂具有高效降解作物秸秆的能力， 适合南方水稻秸秆，以及北方的小麦秸秆的快速降解，在作物秸秆田间原位还田中具有重要作用。同时，具有能够增加土壤腐殖质、提高土壤肥力的作用。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1高效降解秸秆的微生物菌剂的制备(1)发酵罐培养液配方牛肉汁0.5%，蛋白胨0.5%，NaCl 0. 5%，豆油0. 5%，葡萄糖0.5%，硫酸镁0. 08%,磷酸二氢钾0. 04%,碳酸钙0. 5%，800 μ M的Cu、Zn、Mn、Fe，搅拌。灭菌前PH值7. 6，灭菌后ρΗ值为7.4。(2)培养过程将地衣芽孢杆菌JLC38和魏登施泰滕芽孢杆菌JLC43菌株分别划线接种于牛肉汁蛋白胨培养基上，培养48h，然后分别接入500mL三角瓶，在30°C，180r/min下，培养 18h。然后按接种量接入到15L种子罐中，在180r/min，pH7. 5，通气量0. 5vvm下，培养 24h后，再按5%的接种量装入到100L的发酵罐中，在200r/min，pH7. 5，通气量0. 6vvm下， 培养3d。发酵完成后，将地衣芽孢杆菌JLC38、魏登施泰滕芽孢杆菌JLC43与草炭分别按照1 1 8的重量比将菌液加入灭好菌的草炭或者硅藻土，同时加入0.1%的微量元素(H3BO3 57mg/L, MnSO4 · 7H20 43mg/L, ZnSO4 · 7H20 43mg/L, CuSO4 · 5H20 40mg/L, (NH4)6Mo7O24 ‘ 4H20 37mg/L，Co (NO3) · 6H20 25mg/L)，无菌装袋封口，常温保藏。实验例1小麦秸秆田间原位地表覆盖微生物降解实验秸秆腐解菌剂组合实验包括A1 魏登施泰滕芽孢杆菌C15+魏登施泰滕芽孢杆菌C17 ；A2 魏登施泰滕芽孢杆菌C26+魏登施泰滕芽孢杆菌C29 ；A3 魏登施泰滕芽孢杆 JLC43+地衣芽孢杆菌JLC38 ；CKl (未加尿素)；CK2 (加尿素)。实验在田间条件下进行，每个小区面积20m2。当玉米株高30 40cm，将小麦秸秆 (Mkg/区，折合500kg/亩)均勻铺放在玉米行间，秸秆降解菌剂(粉剂)，均勻撒在秸秆上，然后将1000克尿素溶在水中，加入保水剂1%，均勻喷洒秸秆润湿。实验使用的保水剂为旱露宝1号、旱宝贝MP3005JB、旱宝贝MP3005KM、旱宝贝MP30(^KL、旱宝贝MP3005S、旱宝贝抗蒸腾剂、粘合剂A30、JB777、金元易生粘合剂，均购自北京化工门市部。(1)秸秆降解菌剂对平铺秸秆纤维素的降解效果影响结果如表1所示，结果表明，3周后，菌剂处理的秸秆外观变灰色，发脆易断；不施菌对照小区秸秆外观变化不明显，不易折断。从1周至6周，所有降解菌剂处理的秸秆纤维素含量都显著低于CKl (未加尿素)、CK2 (加尿素)，使用菌剂Al的秸秆纤维素含量比CK2下降8. 4%,7. 1%,36. 6%,8. 8%U2. 和36.6% ；菌剂A2处理的秸秆纤维素下降26.6%、31.8%、46.8%、-2.2%、10. 7%和43. 7% ；菌剂A3处理的秸秆纤维素下降 13. 2%U5. 5%,51. 4%,26. 7%,27. 6%和65. 6%。在3个菌剂组合中，使用A3菌剂处理秸秆纤维素含量最低。秸秆降解菌剂处理3周的秸秆纤维素含量下降最明显，与第2周相比，菌剂A1、A2、 A3处理秸秆的纤维素含量分别降低了 53. 85%、34. 42%和58. 16%。4周至6周，菌剂Al、 A2、A3处理秸秆的纤维素含量呈现缓慢上升趋势，可能是秸秆经过菌剂的作用，秸秆中容易降解的部分已经降解，单位重量秸秆样品中的纤维素含量相对高些。综上所述，菌剂A3处理比不施菌对照秸秆纤维素降解能力提高65%以上，因此， 地表平铺秸秆使用降解菌剂A3 (菌株几C43+菌株几C38)对秸秆纤维素的降解效果很好。表1使用秸秆降解菌剂对地表平铺秸秆纤维素降解效果的影响
权利要求
1.一种降解秸秆的微生物菌剂，其有效成分包括地衣芽孢杆菌 JLC38 (Bacillus licheniformis)，保藏号 CGMCC NO. 4389 ；魏登施泰滕芽孢杆菌 JLC43 (Bacillus weihenst印hanensis)，保藏号 CGMCC NO. 4391。
2.如权利要求1所述的菌剂，其包括如下重量份的组分地衣芽孢杆菌JLC381份； 1份； 魏登施泰滕芽孢杆菌JLC431份 添加剂 3-12 份。
3.如权利要求2所述的菌剂，其包括如下重量份的组分地衣芽孢杆菌JLC38 1份魏登施泰滕芽孢杆菌JLC43 1份添加剂 6-8 份。
4.如权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述的添加剂为草炭、硅藻土或轻质碳酸钙。
5.如权利要求4所述的菌剂，其特征在于，还进一步添加适量的H3B03、MnSO4· 7H20、 ZnSO4 · 7H20、CuSO4 · 5H20、(NH4)6Mo7Om · 4H20 禾口 / 或 Co (NO3) · 6H20。
6.权利要求1-5任一所述的菌剂在降解秸秆中的应用。
7.权利要求1-5任一所述的菌剂在促进秸秆原位还田中的应用。
8.权利要求1-5任一所述的菌剂在提高土壤腐殖质中的应用。
9.权利要求1-5任一所述的菌剂在利用秸秆生产有机肥中的应用。
10.如权利要求6所述的应用，所述秸秆为小麦秸秆、水稻秸秆和玉米秸秆。
全文摘要
本发明提供了一种高效降解作物秸秆的微生物菌剂，其由地衣芽孢杆菌JLC38(Bacillus licheniformis)、魏登施泰滕芽孢杆菌JLC43(Bacillus weihenstephanensis)等2种菌株组成。本发明的菌剂具有在田间原位覆盖还田、翻压还田条件下，高效降解作物秸秆的能力。适合南方水稻秸秆和北方的小麦秸秆的原位快速降解还田，在作物秸秆田间原位还田中具有重要作用。同时，具有增加土壤腐殖质、提高土壤肥力的显著作用。
文档编号C12R1/07GK102174424SQ20101057432
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月6日 优先权日2010年12月6日
发明者任萍, 范丙全 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所