专利名称：一种降解秸秆的地衣芽孢杆菌ch15及其菌剂的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物菌剂领域，具体地，涉及一种含有地衣芽孢杆菌(Bacillus 1 icheniformis) CHl5的高效降解秸秆的微生物菌剂。
背景技术：
我国作物秸秆资源丰富，数量巨大，种类多样，每年的作物秸秆产出量7 8亿吨。 由于秸秆在短期内不易腐解，利用效率低，绝大部分秸秆废弃或被焚烧，在种植业为主的地区，作物秸秆已经成为生产中的障碍。所以，焚烧秸秆遍及广大乡村，由此引起环境污染与有机资源的严重浪费。据统计，全国用作还田和有机肥料的作物秸秆仅占总量的20%左右， 焚烧占17%，尚有50%未被利用。北方地区夏季干旱高温，不利于小麦秸秆的腐解还田；秋冬季节气候冷凉、土壤干旱、营养贫瘠，不利于玉米秸秆木质素、纤维素的降解。所以，突破北方地区不良气候的条件下，秸秆大规模、快速腐熟还田技术瓶颈是实现我国北方地区秸秆利用亟待解决的问题。选育和利用作物秸秆高效降解微生物菌株，研发高效降解菌剂，建立作物秸秆田间原位生物转化还田技术，是目前国内外重要发展趋势之一。秸秆的微生物快速腐熟技术近些年受到高度重视，取得了一定的研究进展。我国研究人员在秸杆降解菌、纤维素降解菌、木质素降解菌、纤维素酶等微生物菌株的筛选方面开展了卓有成效的工作。齐云000；3)从堆肥中筛选得到两株分解纤维素的菌株，一株为高温单孢菌Q0，另一株为芽孢杆菌Q3。吴元喜等(1997)从内蒙古盐碱湖分离一株产木质素酶的嗜碱细菌新种F10，属于双芽孢杆菌属并命名为好纪双芽孢杆菌。宋波和羊键Q005)从南方各种生态的样品中筛选得到木质纤维素分解菌，从食草动物的粪便中筛选一株降解纤维素的放线菌，初步鉴定为Sti^ptomyces spp.；刘金胜等000 在严格厌氧条件下从水牛粪便和胃残渣中筛选出3株纤维素分解能力较强的细菌，其中以301菌株能力最强。贺芸 (2006)从高温堆肥中分离得到的一株产胞外耐高温纤维素酶的细菌，鉴定为嗜热脂肪芽孢杆菌。李振红和陆贻通从腐木、腐竹等样品中筛选获得4株高效纤维素降解菌，嗜纤维菌属细菌1株，木霉菌属真菌3株；张淑红从青藏高原冰川雪样中筛选出了一株低温纤维素降解菌，初步鉴定为假单胞菌属。纤维素降解真菌的筛选研究已有较多报道，严文岱等000 以玉米秸杆为碳源， 筛选出6株对天然秸秆纤维素有较强降解能力的菌株；郝月等Q006)筛选出一株纤维素酶高产菌株，经鉴定为青霉菌；孙冬梅O004)从不同生态区域土壤中分离纤维素分解菌，获得了 2株木霉T1、T4和2株毛壳菌G2、G3 ；李杰等Q006)从牛粪中分离到一株降解纤维素的木霉真菌Zl ；郝月等000 从各种土壤及饲料中分离到6株对天然秸秆纤维素有较强降解能力的菌株；徐昶等000 从霉变的玉米芯中筛选到一株高产纤维素酶的灰绿曲霉； 张毅民等000 从堆肥、土壤等样品中筛选到1株霉菌FlO表现出最高酶活力，固体发酵酶活力与绿色木霉AS3. 3711相当；孟会生等Q006)以滤纸液化度及纤维素酶活性为指标， 筛选降解秸秆能力较强的绿色木霉、哈茨木霉和芽孢杆菌，以绿色木酶为最好，菌株混合发酵，可使纤维分解能力明显提高；姚强000 用液体摇瓶法从碱性土壤中筛选到降解纤维素的哈茨木霉；王晓芳O001)分离一株曲霉B6等。以上菌株用于饲料生产菌，但是它对秸杆还田降解菌的研究具有基石和促进的作用。近几年来，我国在秸秆田间原位降解微生物菌种筛选方面，获得了降解秸秆的扩张青霉W4 (王洪媛，范丙全，2010)、赭绿青霉TO (殷中伟，范丙全，2010)。菌株W4具有非常强的秸秆纤维素降解能力，IOd内对秸秆的降解率可达56. 3%。而在15°C低温条件下，赭绿青霉TO降解秸秆率为13.2%。复合菌系的筛选研究也有一些报道，王伟东等0004,2005)以麦秸垛下的土壤和麦秸堆肥为材料，经过多代淘汰及其不同系之间的组配，最终筛选构建了一组木质纤维素分解菌复合系。史玉英等(1996)滤纸平板法结合摇床培养筛选到2个纤维素分解能力较强的混合菌Ml和M2，经初步鉴定，Ml由木霉Fl和芽孢杆菌Ba组成，M2由木霉F2和芽孢杆菌Ba组成，由真菌、细菌组成的混合菌分解纤维素的能力明显强于其中任何一个单一菌株。崔宗钧等0002，2005，2008)筛选出纤维素降解能力较强的复合系MCI、WSC-6、NSC-7 等，对纤维素有较好的降解能力。从已有的报道可以发现，有关秸秆发酵菌剂的产品非常少，尚未形成体系，更没有稳定高效秸秆快速降解菌群的生产使用。发酵菌剂中，以嗜热的纤维素分解菌为数较多，而常温(低温)发酵的分解纤维素、木质素、蜡质的微生物菌株或菌群的研究远远落后于生产需要。秸秆快速腐解微生物技术尚未得到有效地解决，限制了秸秆资源的高效利用。由此可见，目前的研究包括作物秸杆与腐熟剂一起使用翻入土壤，促进秸杆在土壤中的降解；所有秸杆腐熟剂适合秸杆堆置、高温发酵腐熟；田间不堆置、低温、干旱、营养失衡条件下，秸杆快速腐解的微生物菌剂没有研究报道。国外重视机械化为技术支撑的秸秆还田技术，加拿大、美国、澳大利亚推行免耕留茬还田(范丙全等，2005 ；Bruce等，2005)。同时，仍然重视微生物在秸秆降解还田中的作用研究，一些研究表明，微生物对秸秆腐解具有良好的作用效果。俄罗斯较多的利用真菌复合体降解植物残体以及黑麦秸秆木质素(Varanaite 1999，2005)，利用复合菌系强化小麦秸杆的降解效率具有显著的优越性(Bowen等，1990)。俄罗斯研究了产漆酶真菌INBI 216，经过23天的培养，产漆酶真菌对秸秆木质素、纤维素及半纤维素的分解率为29. 8%, 51. 4%和72% (Vasil' chenko,2004)。同时非常重视秸杆纤维素降解菌群的研究，日本获得高效分解水稻秸秆的复合菌群，4d内水稻秸秆降解60% (Haruta等，2002)。泰国利用秸秆降解菌和秸秆生产生物有机肥料(Wisitthaphon，1991)，美国科学家利用秸秆和真菌Panus tigrinus.生产生物肥料(Golovleva等，1987)。为了提高菌株腐解秸秆的效果，研究人员在筛选高效降解纤维素和木质素的真菌(Nandi，2000)、小麦秸秆降解高效的白腐菌(Aerts和Hoozee，. 1987)、降解木质素的白腐菌和褐腐菌(Kang等， 1998)的同时，进行了降解纤维素的基因工程菌、降解木质纤维素和秸秆的基因工程菌的研究(Ramachandra，1987 ；Asghari 等，1996 ；Levasseur 等，2005)。研究显示，采用基因突变获取高效降解秸杆纤维素菌株，增强纤维素酶的表达，能够提高秸杆的降解效率(Khattab 等，2004)。目前分离的具有纤维素降解能力的细菌较多，其中属于革兰氏阳性菌属(G+)的有噬纤维菌(Cytophaga)，热杆菌属(Caldikicillus)，芽孢杆菌属(Bacillus)，生孢嗜纤维菌(Sporacytophga)等；属于革兰氏阴性菌属(G_)的有假单孢菌属(I^eudomonas)，欧文氏菌属(Erwinia)，纤维单孢菌属(Cellulomonas)，镰状纤维菌属(Cellfacicula)等 (Schwarz,2001 ；Lynd,2002 ；Kenyon，2005)。真菌的胞外纤维素酶活较强，尤其以青霉属(Penicillium)，木霉属 (Trichderma)，毛壳霉属(Chaetomium)曲霉属(Aspergillus)禾口根霉属(Rhizopus)，其中以木霉属(Trichderma)、黑曲霉(Aspergillus niger)研究的较多，它们往往被用在工业酶的生产，以提高纤维素类物质的资源转化率(Wood，1994 ；Itavaara, 1999 ；Lynd, 2002)。由此可见，利用秸秆纤维素降解微生物进行玉米、小麦、水稻秸秆的降解与原位还田具有巨大的应用潜力。芽孢杆菌属是一类重要的具有较强纤维素降解能力的微生物种群，其降解秸秆纤维木质素的研究已有报道。地衣芽孢杆菌CH15是新分离到的降解纤维木质素的菌株，未发现有关地衣芽孢杆菌作为高效降解秸秆的微生物菌剂的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) CH15，保藏号为 CGMCC N0. 4392。本发明的另一目的是提供一种含有地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) CH15的高效降解秸秆的微生物菌剂。为了实现本发明的目的，本发明的一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) CH15，是从我国吉林省公主岭黑土中筛选到的高效稳定秸秆降解菌，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所， 保藏编号CGMCC N0. 4392，保藏日期2010年12月1日。本发明的一种高效降解秸秆的微生物菌剂，其包括如下重量份的组分地衣芽孢杆菌CH151份；添加剂3-12份。优选的为地衣芽孢杆菌CHl51份；添加剂4份。其中，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)CH15 含量达到 2X IO8Cfu/ g以上，所述的添加剂为草炭、硅藻土或轻质碳酸钙，同时可加入加入0. 的微量元素(H3BO3 57mg/L, MnSO4 · 7H20 43mg/L, ZnSO4 · 7H20 43mg/L, CuSO4 · 5H20 40mg/L, (NH4)6Mo7O24 · 4H2037mg/L, Co (NO3) · 6H20 25mg/L)。本发明还提供上述地衣芽孢杆菌CH15及其微生物菌剂在高效降解秸秆中的应用，其中所述秸秆为农作物秸秆，包括小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆等。本发明还提供上述地衣芽孢杆菌CH15及其微生物菌剂在秸秆原位降解还田中的应用。本发明还提供上述地衣芽孢杆菌CH15及其微生物菌剂在秸秆发酵腐熟生产有机肥中的应用。本发明还提供上述地衣芽孢杆菌CH15及其微生物菌剂在秸秆还田提高土壤有机质和腐殖质中的应用。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CH15的微生物学特性为将地衣芽孢杆菌CH15菌株30°C培养2d，菌落白色，无光泽，边缘不整齐。菌体杆状，具有运动性，周生鞭毛，有芽孢，革兰氏阳性；化能异养，需氧，无需光照；在10°C 55°C范围内均能生长，65°C 不能生长；在PH5. 7 6. 8内均能生长；在2^^5^^7% NaCl中生长正常；利用柠檬酸盐、 丙二酸盐，不利用尿素盐；液体培养生长迅速，明胶穿刺培养阳性；利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇；接触酶阳性。本发明的地衣芽孢杆菌CH15具有显著的降解玉米、小麦、水稻秸秆纤维素、木质素和半纤维素的能力。与对照相比，CH15菌剂对小麦秸秆纤维素的降解效果提高49.7%， 玉米秸秆纤维素的降解效果提高71. 2%，水稻纤维素降解效果提高66. 7% ；地衣芽孢杆菌CH15对小麦秸秆半纤维素的降解效果提高23. 03%，玉米秸秆半纤维素的降解效果提高 66. 7%，水稻半纤维素降解效果提高73. 6% ；地衣芽孢杆菌CH15对小麦秸秆木质素的降解效果提高41.2%，玉米秸秆木质素的降解效果提高104.9%，水稻木质素降解效果提高 104. 3%。将小麦、玉米、水稻秸秆配合使用地衣芽孢杆菌CH15菌剂，显著提高了土壤有机质和腐殖质水平。小麦秸秆接种CH15菌剂，土壤有机质和腐殖质比对照分别增加了 7. 79% 和10. 54% ；玉米秸秆接种CH15菌剂，土壤有机质和腐殖质比对照分别增加了 11.52% 和10. 54% ；水稻秸秆接种CH15菌剂，土壤有机质和腐殖质比对照分别增加了 7. 89%和 13.48%。因此，本发明提供的地衣芽孢杆菌CH15秸秆降解菌剂适合北方小麦、玉米秸秆和南方水稻秸秆的快速降解，显著提升土壤有机质和腐殖质水平。地衣芽孢杆菌CH15为新分离到的降解纤维素的芽孢杆菌，本发明首次提供了地衣芽孢杆菌CH15作为高效降解秸秆的微生物菌剂及其降解秸秆的效果，为秸秆降解和还田提供了高效菌种资源。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实验例1-6中所用供试菌株AS2为魏登施泰腾芽孢杆菌(Bacillus. Weihenst印hanensis)以及菌株 G22 为醋酸 丐不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus), 为两株高效降解作物秸秆的菌株，由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所微生物资源与利用研究室提供。实施例1含有地衣芽孢杆菌CH15的秸秆降解微生物菌剂的制备(1)发酵罐培养液配方可溶性淀粉1%，黄豆饼粉1%，玉米粉0.5%，葡萄糖0. 1%，蔗糖1%，酵母粉 0. 5%, (NH4)2SO4 0. 3%, K2HPO4 0. 02%, NaCl 2. 5%, MgSO4 ‘ 7H20 0. 01%, CaCO3 0. 05%, FeSO4 0. 0001%, pH 7.0，搅拌。(2)培养过程将地衣芽孢杆菌CH15接种于牛肉汁蛋白胨培养基上，28-30°C培养48h，然后接入 500mL三角瓶液体培养基中，30°C，180r/min下培养36h。然后按接种量接入到15L种子罐中，在220r/min，pH7. 0，通气量0. 6vvm下，培养24h后，再按5%的接种量装入到100L 的发酵罐中，在220r/min，pH7. 0，通气量0. 7vvm下，培养3d。发酵完成后，将地衣芽孢杆菌CH15发酵液按照1 4 5的重量比加入灭好菌的草炭或者硅藻土，同时加入0.1V/V%的微量元素(H3BO3 57mg/L, MnSO4 · 7H20 43mg/L, ZnSO4 · 7H20 43mg/L, Cu SO4 · 5H20 40mg/L, (NH4)6Mo7O24 · 4H20 37mg/L, Co (NO3) · 6H20 25mg/L)，混勻，包装。实验例1本发明的秸秆降解微生物菌剂对地表覆盖小麦秸秆中半纤维素、纤维素和木质素降解效果的影响采用盆钵试验对地表覆盖秸秆使用降解菌剂的效果进行了研究。供试菌株①魏登施泰腾芽孢杆菌AS2 ；②醋酸钙不动杆菌G22 ；③本发明的地衣芽孢杆菌CH15，实验使用小麦秸秆，为期6周。含有菌株AS2的菌剂、含有菌株G22的菌剂的制备方法与含有菌株CH15的菌剂的制备方法相同，具体参照实施例1。小麦秸秆使用分别含有菌株AS2、G22和CH15的菌剂2周时，秸秆木质素含量分别比不使用菌剂对照降低了 66. 6%,67. 9%和21. 9% ；使用菌剂AS2、G22处理的秸秆纤维素、半纤维素的含量变化比较小，而菌株CH15处理的秸秆纤维素、半纤维素含量显著下降， 比对照分别降低了 23. 03%和44. 17% (表1)。小麦秸秆分别使用AS2、G22和CH15菌剂3周时，秸秆纤维素比对照分别下降 16. 6%U5. 0%和49. 7%，木质素分别下降41. 48%,27. 69%和37. 95%，只有CHl5菌剂处理的秸秆半纤维素含量比对照降低11. 18%。小麦秸秆使用分别含有菌株AS2、G22和CH15菌剂4周时，纤维素、木质素和半纤维素含量基本上与第3周时维持同一水平。使用CH15菌剂降解秸秆的效果最好，秸秆纤维素、木质素含量分别比对照降低了 13. 7%和26. 6 %，半纤维素仅下降2. 8%。小麦秸秆使用分别含有菌株AS2、G22和CH15菌株的菌剂5周时，对秸秆的纤维素、半纤维素降解影响较小，仅有菌剂CH15处理的秸秆纤维素下降至31. 7%，比对照降低13. 1% ；秸秆木质素降解至最低，分别达到9. 30%,8. 37%和7. 93%,比对照分别降低 20. 4%,33. 8%和 41. 2%。小麦秸秆使用分别含有菌株AS2、G22和CH15的菌剂6周时，秸秆纤维素、木质素和半纤维素含量呈增加趋势，可能是秸秆经过菌剂的降解作用，秸秆中容易降解的部分已经降解，单位重量秸秆样品中的纤维素、木质素和半纤维素含量相对高些。尽管如此，使用菌剂处理的秸秆纤维素含量比对照降低2.6%、2.9%和6.6%，木质素比对照降低3.0%、 2. 0%和 4. 7%。表1小麦秸秆地表覆盖生物腐解过程中半纤维素、纤维素和木质素的变化
菌剂第2周第3周第4周第5周第6周半纤维素 (%)纤维素 (°/o)木质素 (%)半纤维素 (%)纤维素 (%)木质素 (%)半纤维素 (%)纤维素 (%)木质素 (%)半纤维素 (%)纤维素 (%)木质素 (%)半纤维素 (%)纤维素 (%)木质素 (%)CK33.50a32.77a26.70a34.30a37.27a24.90a38.40a34.27a21.40a33.87a35.86a11.20a36.30a35.90a16.93bAS232.70a32.47a16.03b36.60a31.97a17.60b38.23a32.90a18.17ab32.87a36.00a9.30b37.97a35.00a16.43bG2233.97a35.13a15.90b37.20a32.40a19.50b40.50a31.30a19.05ab33.70a36.47a8.37b35.23b34.90a16.60bCH1527.23b22.73b21.90b30.85b24.90b18.05b37.37a30.13a16.90b34.77a31.70b7.93b33.77b33.67a16.17b 注a、b表示处理组之间差异显著，ab表示该处理组与a、b处理组间差异不显著。
由此可见，不同秸秆降解菌剂对小麦秸秆不同组分的降解效果差异显著，尤以菌株CH15降解秸秆纤维素、木质素、半纤维素的能力为强，从2周至6周，含有菌株CH15的菌剂在小麦秸秆的降解中都表现良好的作用效果。实验例2秸秆降解微生物菌剂对地表覆盖玉米秸秆中半纤维素、纤维素和木质素降解效果的影响采用盆钵试验对地表覆盖秸秆使用降解菌剂的效果进行了研究。供试菌株①魏登施泰腾芽孢杆菌AS2 ；②醋酸钙不动杆菌G22 ；③本发明的地衣芽孢杆菌CH15，实验使用玉米秸秆，为期6周。含有菌株AS2的菌剂、含有菌株G22的菌剂的制备方法与含有菌株CH15的菌剂的制备方法相同，具体参照实施例1。玉米秸秆使用AS2、G22和CH15的菌剂2周时，3种秸秆降解菌剂对纤维素的降解效果不同，CH15菌剂降解效果显著高于AS2菌剂和G22菌剂，比对照降低了 19. 7% ；AS2菌剂和CH15菌剂处理秸秆的半纤维素含量低于对照，分别降低了 30. 4和16. 3%；3种菌剂的木质素比对照分别下降了 97. 5%,42. 1%和23.8% (表2)。玉米秸秆使用AS2、G22和CH15的菌剂3周时，AS2菌剂和G22菌剂对秸秆的纤维素、半纤维素、木质素的降解影响较小，而使用CH15菌剂秸秆的纤维素、半纤维素、木质素显著低于不使用菌剂处理，比对照分别降低35. 7%,66. 7%和104. 9%。玉米秸秆使用AS2、G22和CH15菌剂4周时，所有菌剂处理秸秆的纤维素、木质素和半纤维素含量都低于第3周，以CH15菌剂降解效果最好。使用CH15菌剂的秸秆纤维素、 木质素含量比对照分别降低23. 6%和67. 5%，半纤维素含量没有变化。玉米秸秆使用AS2、G22和CH15菌剂的处理5周时，3种菌剂对秸秆纤维素的降解效果显著，比对照分别降低10. 3%,47. 9%和71. 2%，含有CHl5的菌剂效果最好。CHl5菌剂处理秸秆的木质素降解效果大于AS2菌剂和G22菌剂，比对照降低9. 9%。玉米秸秆使用AS2、G22和CH15菌剂6周时，菌剂降解秸秆纤维素、木质素和半纤维素的能力大于对照，纤维素下降18. 6%、57. 8%和61. 9%，木质素下降7. 8%, -0. 8%和 16. 8%，半纤维素下降5. 7%、16. 5%和21. 9%，CHl5菌剂的降解效果最好。玉米秸秆纤维素、木质素和半纤维素含量第6周比第3周呈现增加趋势，可能是秸秆经过菌剂的作用，秸秆中容易降解的部分已经降解，单位重量秸秆样品中的纤维素含量相对增加。表2玉米秸秆地表覆盖生物腐解过程中半纤维素、纤维素和木质素的变化
权利要求
1.地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)CH15，其保藏号为 CGMCC NO. 4392。
2.含有权利要求1所述地衣芽孢杆菌CH15的菌剂。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征包括如下重量份的组分 地衣芽孢杆菌CH151份；添加剂3-12份。
4.如权利要求3所述的菌剂，其特征包括如下重量份的组分 地衣芽孢杆菌CH151份；添加剂4份。
5.如权利要求3或4所述的菌剂，其特征在于，所述的添加剂为草炭、硅藻土或轻质碳酸钙。
6.如权利要求5所述的菌剂，其特征在于，还进一步添加适量的MnSO4· 7H20、 ZnSO4 · 7H20、Cu SO4 · 5H20、(NH4)6Mo7Om · 4H20、H3BO3 禾口 / 或 Co (NO3) · 6H20。
7.权利要求1所述地衣芽孢杆菌CH15、权利要求2-6任一所述的菌剂在降解秸秆中的应用。
8.权利要求1所述地衣芽孢杆菌CH15、权利要求2-6任一所述的菌剂在秸秆原位降解还田中的应用。
9.权利要求1所述地衣芽孢杆菌CH15、权利要求2-6任一所述的菌剂在秸秆发酵腐熟生产有机肥中的应用。
10.权利要求1所述地衣芽孢杆菌CH15、权利要求2-6任一所述的菌剂在秸秆还田提高土壤有机质和腐殖质中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种高效降解作物秸秆的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CH15及其菌剂，地衣芽孢杆菌CH15。能够高效降解秸秆纤维素、木质素和半纤维素，具有降解多种作物秸秆的能力，适合南方的水稻秸秆，北方的小麦秸秆和玉米秸秆的快速降解，具有促进作物秸秆田间原位降解还田、提高土壤有机质和腐殖质的作用，为秸秆降解菌剂的生产与应用提供了高效菌种。
文档编号C12N1/20GK102174423SQ20101057430
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月6日 优先权日2010年12月6日
发明者任萍, 范丙全 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所