专利名称：琥珀酸的新型微生物生产者和琥珀酸的纯化的制作方法
琥珀酸的新型微生物生产者和琥珀酸的纯化本发明涉及能够利用甘油作为碳源发酵生产琥珀酸的细菌菌株，其中所述菌株是经过遗传修饰的，使其包含下调的内源性丙酮酸-甲酸-裂解酶活性，并涉及利用此类微生物生产有机酸，特别是琥珀酸的方法。发明背景 从生物质发酵生产琥珀酸(SA)已引起了广泛关注，因为所述酸是合成树脂的重要成分，或者是其他有价值的低分子化学化合物的来源，特别是四氢呋喃(THF)、1，4_ 丁二醇(BFO)、Y-丁内酯(GBL)和吡咯烷酮(W0-A-2006/066839)。Lee等(2002a)描述了从牛的瘤胃分离的SA生产菌。所述细菌是不动的、不形成芽孢的、嗜中温和嗜二氧化碳的革兰氏阴性的杆状或球杆菌。基于16S rRNA序列的系统发生学分析和生理学分析表明所述菌株属于曼海姆菌(Marmheimia)属，作为新种，被称为产琥珀酸曼海姆菌(Mannheimia succiniciproducens)MBEL55E。在 100 % CO2 条件下，它在 6.0-7.5的pH范围内生长良好，并以2 1 1的恒定比例生产SA、乙酸和甲酸。当CO2 饱和条件下，用葡萄糖作为碳源，无氧培养产琥珀酸曼海姆菌MBEL55E时，在孵育7. 5h里， 消耗了 19.8g/L的葡萄糖，产生了 13.3g/L的SA。此外，在该微生物中，通过突变/删除代谢基因，改善了 SA的生产。乳酸脱氢酶IdhA、丙酮酸-甲酸-裂解酶pFIB、磷酸转乙酰基酶pta和乙酸激酶ackA基因的组合突变/删除导致菌株将碳转化为SA的产量(YP/S)为 0. 6gSA/g添加的碳源。生产SA的时空产量为1. 8g/升/h(Lee，2006)。Lin等，2005描述了在Idh和pfl基因中都携带突变的大肠杆菌的变体菌株，称为 SB202。然而，该菌株的特征是生长缓慢，且在无氧条件下不能完全发酵糖类。失活的Idh 和PfI导致碳流动被限制于丙酮酸节点，导致丙酮酸作为主要产物积累。在该方面，发现基于碳源的琥珀酸的碳产量(YP/S)低于0. 15g/g SA/碳。Sanchez等，2005描述了在Idh、adhE、ack-pta和icIR基因中携带突变的大肠杆菌菌株。在这些实验中，细胞有氧的生长在复杂培养基上，在有氧条件下收获、浓缩和用碳源孵育。在这些用于将碳水化合物直接转化为SA的特定条件下，发现碳产量YP/S为0. 98 至1. 13g SA/g碳源，时空产量为0.79g/l h SA。在好氧转化阶段前的生物量生产的碳利用明确的不包括在该计算中，且未进行进一步描述。Hong和Lee (2001)描述了在Idh和pfl基因中携带突变的大肠杆菌菌株。这些菌株确能从碳水化合物发酵中生产SA，然而，伴随缓慢的碳水化合物利用和从碳水化合物碳源葡萄糖的低的SA时空和碳产量(YP/S)。此外，产生琥珀酸、乙酸和乳酸的比例为 1 0.034 1.6。在该分析中，与未突变的亲本菌株相比，在Idh和pfl基因中携带突变的菌株的生长是迟缓的。Zhu等，2005描述了在pfl基因中突变的E. coli菌株，其不产生琥珀酸，但产生乳酸，当在以葡萄糖为惟一底物的条件下生长时，表现出低下的生长。然而，生物产琥珀酸曼海姆菌的重要缺陷是它不能代谢甘油，而甘油作为三酰基甘油(TAG)的组分是便于获得的，例如作为生物柴油生产的酯基转移反应中的副产品 (Dharmadi 等，2OO6)。
科学文献中已描述了从甘油发酵生产SA(Lee等，2001 ；Dharmadi等，2006)，并且甘油获得了比普通糖类如葡萄糖更高的产量(生产的SA的质量/消耗的原材料的质量) (Lee等，2001)。然而，用甘油获得的时空产量显著低于葡萄糖(0. 14vs. 1. Og SA/[L h])。仅在少数情况下描述了将甘油无氧代谢成发酵产物。E. COli能够在非常特定的条件下发酵甘油，例如酸性PH，避免积累发酵氢气，以及恰当的培养基组成(Dhamadi等， 20 06，Yazdani和Gonzalez 2007)。许多微生物能够在存在外部电子受体的条件下代谢甘油(呼吸代谢)，极少数能够发酵代谢甘油(即，在缺少电子受体的条件下)。在肠杆菌科的若干个种中，已详细的研究了甘油的发酵代谢，例如弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。这些生物体中的甘油异化作用与它们合成高度还原的产物1，3_丙二醇(1，3-PD0)的能力是严格相关的(Dhamadi等， 2006)。已报道了使用产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)将甘油转化为SA (Lee等，2001)。该研究证实，使用甘油作为碳源可以生产SA并极少形成副产物乙酸，因而有利于SA的纯化。通过间歇性添加甘油和酵母提取物，获得最高产量，该对策获得约19g/L SA的产量。然而应注意，酵母提取物中存在进行甘油发酵所需的未鉴定的营养组分。然而，由于糖类比多元醇甘油更低的还原状态，糖类理论上应该以比甘油显著更低的产量转化为SA。发现在生产SA的厌氧性生物体中，糖类与甘油的组合是有作用的(Lee 等，2001)，但没有达到超过29g/L的SA滴度。此外，发现碳产量YP/S仅为92%，而SA/AA 比为4. 9 1。最多仅4g/L甘油转化为琥珀酸。由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPG)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和丙酮酸羧化酶(PycA)催化的草酰乙酸的羧化反应利用HCO3-作为CO2源(Peters-WendischPG等， 1996，1998)。因此，碳酸氢盐来源例如NaHCO3、KHCO3、NH4HCO3等可用于发酵和培养基质，以改善底物至SA的代谢中HC03_的利用度。迄今为止的现有技术中尚未发现从葡萄糖生产SA 依赖于添加HCO3_。厌氧生物体的生物质生产受从发酵通路生产的ATP量的限制。厌氧生物体中的甘油的生物量产量低于糖类的，例如己糖如葡萄糖、果糖，戊糖如木糖、阿拉伯糖或二糖例如蔗糖或麦芽糖(Lee 等，2001，Dharmadi2007)。早期的专利申请PCT/EP2008/006714公开了这样的细菌菌株，其属于巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的成员，从瘤胃中原始分离，并能够利用甘油作为碳源，来源于它的变体和突变菌株保留了所述能力，特别是以保藏编号DSM 18541 (ID 06-614)保藏在 DSMZ(德意志微生物保藏中心，D-38124不伦瑞克，因霍芬路7B，德国)中的命名为DDl的细菌菌株，具有生产琥珀酸的能力，来源于它的变体和突变菌株至少保留了所述生产琥珀酸的能力，该申请的内容通过引用整合到本文中。根据Kuhner等，2010的分类，DDl菌株属于Basfia succiniciproducens禾中，巴斯德氏菌禾斗0因此，需要新型的细菌菌株，其具有从甘油生产有机酸，特别是SA的能力。特别的是，此类菌株应该以高生产力从甘油生产所述酸类，尤其是可以使用不进行在先纯化、例如来自生物柴油生产的粗制甘油。本发明的目标是提供此类新型菌株和生产方法。发明概述本发明人分离了名为DDl的细菌菌株，令人惊讶的通过突变所述菌株解决了所述目标，使得PFL蛋白质的活性下降，而使得所述菌株具有理想的代谢特征。因而，提供了能够利用甘油作为碳源发酵生产琥珀酸的新型细菌菌株，其中所述菌株是经过遗传修饰的， 使得其包含下调的内源性PFL酶活性。本 发明人令人惊讶的发现此类突变的细菌菌株具有理想的代谢特征，在SA发酵中表现出极大改善的技术表现。
附图简介
图1描述了质粒pSacB(SEQ ID NO 3)的示意图。图2 描述了质粒 pSacB(Apfl) (SEQ ID NO 4)的示意图。图3 描述了质粒 pSacB(AIdh) (SEQ ID NO 5)的示意图。发明详述a)特定术语的一般定义本文使用的术语“细菌细胞”指原核生物体，S卩，细菌。细菌可以基于它们的生物化学、微生物学特性及其形态学来分类。这些分类标准是本领域普遍已知的。术语“酸”(如本文所指的有机单羧酸或二羧酸，即乳酸和SA)理解为最广泛的含义，并且也涵盖了它的盐，例如碱金属盐、如Na和K盐，或碱土金属盐，如Mg和Ca盐，或铝盐；或所述酸的酸酐。两条序列之间的“同一性”或“同源性”意指在所比对序列的完整长度上的残基的同一性，例如在生物信息学软件包EMBOSS (版本5. 0. 0,http://emboss. sourceforRe. net/ what/)中的程序needle的帮助下计算的同一性(对于较相似的序列)，使用默认参数为gapopen(打开1个空位的罚分):10· 0gapextend(延伸空位的罚分)0· 5datafile (软件包中包括的打分矩阵文件):EDNAFUL术语“含有编码具有活性减少的丙酮酸_甲酸-裂解酶的突变基因的细菌菌株” 涵盖了具有减少的活性或者甚至不可检测的PEL活性的修饰的细菌细胞。用于检测和确定 PFL活性的罚分可见于Knappe等，1990和Knappe1993及其中的参考文献中。此外，术语涵盖了当相比表现出生理学丙酮酸_甲酸-裂解酶活性的细菌细胞时，具有显著降低的PFL 活性的细菌细胞。通过本领域技术人员普遍已知的统计学方法，可以确定降低是否是显著的。PFL活性缺陷的细菌细胞可以天然的存在，即由于自发突变。可以通过各种技术来修饰细菌细胞至缺少或具有显著降低的PFL活性。优选的，此类细菌细胞时、是通过化学处理或辐射可获得的。为此目的，通过例如诱变的化学试剂、X射线或UV光处理细菌细胞。在随后的步骤中，选择这些缺少PFL或至少具有降低的PFL活性的细菌细胞。细菌细胞还可通过同源重组技术获得，所述技术的目标是突变、断裂或切除细菌细胞基因组中的PFL，或者导入将导致编码具有减少活性的蛋白质的突变基因的突变。下文描述了重组的优选技术， 特别是用于导入突变或删除序列的。上文的定义还适用于编码本文提及的另一种酶的、待调节的其他基因，特别是所述调节指其活性是减少的、消失的或关闭的。术语“减少的活性”包括例如所述遗传操作的(例如，遗传改造的)微生物的基因产物(例如，丙酮酸-甲酸-裂解酶(PfI)、乳酸脱氢酶(Idh)或其他)的表达处于比操作微生物前的表达更低的水平。遗传操作可以包括但不限于改变或修饰与特定基因表达相关的调控序列或位点(例如，通过去除强启动子、诱导型启动子或多重启动子)、修饰特定基因的染色体位置、改变与特定基因相邻的核酸序列如在启动子区域的序列，包括对启动子活性重要的调控序列、核糖体结合位点或转录终止子、减少特定基因的拷贝数、修饰涉及特定基因转录和/或特定基因产物的翻译的蛋白质(例如，调控蛋白、抑制子、增强子、转录激活子等)，或者任何其他的常规手段，来降低现有技术中常规的特定基因的减少的表达(包括但不限于使用反义核酸分子，或者其他的敲除或阻断表达靶蛋白的方法)。 特别的是，可以操作基因使得从宿主生物体的染色体中删除一个或多个核苷酸。还可以通过导入一个或多个基因突变，来获得活性减少的基因产物，例如丙酮酸-甲酸-裂解酶分子，其中上市突变导致基因产物的活性减少。活性减少可以是将酶活性降低了 > 50%的非突变或未改变的酶活性，或者降低了酶活性> 90%，或者更优选降低酶活性 ^ 95%，或者更优选降低酶活性> 98%，或者甚至更优选降低酶活性> 99%，或者甚至更优选降低酶活性>99.9%。术语“重组”微生物包括经遗传改变的、修饰的或改造的(例如遗传改造的)微生物(例如，细菌、酵母细胞、真菌细胞等)，使其相比来源的天然存在的微生物，表现出改变的、修饰的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)。 术语“启动子”指指导结构基因转录生产mRNA的DNA序列。典型的，启动子位于基因的5’ 区，靠近结构基因的起始密码子。如果启动子是可诱导型启动子，则转录速率响应诱导剂而增加。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂的调控。术语“增强子”指一种启动子元件。增强子可以增加特定基因转录成mRNA的效率， 不论增强子相对于转录的起始位点的距离或方向。术语“克隆载体”指DNA分子，例如质粒、粘粒、噬菌粒或噬菌体，其具有在宿主细胞中自主复制的能力，且用于转化细胞进行基因操作。克隆载体典型的含有一个或少量的限制性核酸内切酶识别位点，其中可以以可确定的方式插入外源DNA序列而不丧失载体的基本生物学功能，以及标志物基因，其适合用于鉴别和选择用克隆载体转化的细胞。标志物基因典型的包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。术语“载体”指包含编码外源蛋白质的克隆的结构基因的DNA分子，其在重组宿主中提供基因。典型的，在用于整合到宿主基因组中的载体的情况下，将克隆的基因置于或可操作的连接于某些与宿主遗传序列同源或相同的上游和下游序列。术语“重组宿主”指可以是任何原核或真核细胞的宿主，其含有克隆载体或表达载体。该术语还意在包括经遗传改造而在宿主细胞的染色体或基因组中含有克隆基因的原核或真核细胞。合适的实例参见Sambrook等，1989。术语“表达”指基因产物(例如，本申请中定义和描述的通路或反应中的基因的生物合成的酶)以这样的水平表达，在所述水平获得的该编码蛋白质的酶活性或其指代的通路或反应允许代谢流通过表达该基因/通路的生物体中的所述通路或反应。表达可以通过遗传改变用作起始生物的微生物来进行。在一些实施方案中，微生物可以经过遗传改变 (例如，遗传改造的)，以增加的水平表达基因产物，所述水平是相对于起始微生物生产的或未经改变的可比较的生物体的。遗传改变包括但不限于改变或修饰与特定基因表达相关的调控序列或位点(例如，通过添加强启动子、诱导型启动子或多重启动子，或者通过去除调控序列使得表达是组成型的)，修饰特定基因的染色体位置，改变与特定基因相邻的核酸序列例如核糖体结合位点或转录终止子，增加特定基因的拷贝数，修饰涉及特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白质(例如，调控蛋白、抑制子、增强子、转录激活子等)，或者本领域常规使用的任何其他解除特定基因表达的常规调节的手段(包括但不限于使用反义核酸分子，例如阻断抑制子蛋白的表达)。可以生理上或环境上“改变”或“修饰”微生物，来以增加的或较低的水平表达基因产物，所述水平是相对于起始微生物的基因产物的表达水平的。例如，微生物可以用(化学或遗传的)试剂处理，或培养在存在试剂的条件下，已知或怀疑所述试剂增加或减少特定基因的转录和/或翻译，和/或特定基因产物的翻译，使得转录和/或翻译是增加的或减少的。可选的，微生物可以在培养选定的温度下，所述温度增加或减少特定基因的转录和/ 或翻译，和/或特定基因产物的翻译，使得转录和/或翻译是增加的或减少的。“遗传修饰的”指通过本领域可获得的遗传工程技术，例如转化、突变、同源重组，按上述意义改变的微生物。术语“失调(deregulate) ”指微生物中至少一个基因的改变或修饰，其中所述改变或修饰导致相对于缺少所述改变或修饰条件下的SD生产，微生物中SA的效率增加。在一些实施方案中，改变或修饰的基因编码生物合成通路中的酶或运输蛋白，使得微生物中的生物合成酶的水平或活性是改变或修饰的，或者运输特异性或效率是改变或修饰的。在一些实施方案中，至少一个编码生物合成通路中的酶的基因是改变或修饰的，使得相对于在未改变或野生型基因的条件下，酶的水平或活性是增强或增加的。失调还包括改变改变一个或多个基因的编码区，产生例如反馈耐受的或具有更高或更低比活的酶。此外，失调进一步涵盖了编码转录因子(例如，激活子、抑制子)的基因的遗传改变，所述转录因子调控编码酶或运输蛋白的基因的表达。更具体的是，失调可以导致“减少的”酶活性，其中所获得的酶活性少于100%酶活性，如在未失调状态“关闭”时观察到的，即可逆的或不可逆的，通过常规的分析工具如酶活性测定，不再存在或至少不再可检测的。术语“能够利用”指本发明的微生物转化底物的能力，例如将甘油转化为至少一种结构上和/或空间结构上不同的化学产品。“涉及或关联甘油发酵转化为琥珀酸的酶活性”意指影响甘油转化为琥珀酸和/或副产品的任何酶的催化活性或调控活性，如可由下文定义的参数集合的任一项确定的。本文描述的不同的产量参数(“产量”或YP/S ；“比产出率”；或时空产量(STY)) 是本领域普遍已知的，并如Song和Lee，2006所述来确定。“产量”或YP/S (分别按所生产的产品质量/所消耗的材料的质量来表述)在本文中用作同义词。比产出率描述了单位h和L的发酵培养液/g干燥生物量所生产的产品、如SA的量。称为DCW的干细胞重量的量描述了生化反应中的生物学活性的微生物的量。给出的值为 g 产物 /g DCff/h(即，g/g DCW-l·1)。术语“发酵生产”或“发酵”指微生物在细胞培养物中利用至少一种添加到孵育中的碳源生产化学化合物的能力(受所述微生物中含有的或产生的酶活性的辅助)。术语“发酵培养液”理解为意指基于发酵过程的且尚未耗尽(work up)或已经耗尽的含水溶液，例如本文所述。b)不同微生物的一般性定义
根据本发明的“细菌细胞”或“细菌菌株”指选自肠杆菌科、巴斯德氏菌科、芽孢杆菌科或放线菌科的。“肠杆菌科”代表了细菌的一大科，包括许多熟悉的细菌，如沙门氏菌 (Salmonella)和大肠杆菌。它们属于变形菌(Proteobacteria)，并形成自己的目(肠杆菌目)。肠杆菌科的成员是杆状的。类似于其他变形菌，它们具有革兰氏阴性菌株，并且是兼性厌氧型生物，发酵糖生产乳酸和多种其他终产物，例如琥珀酸。大部分也还原硝酸盐为亚硝酸盐。与大部分相似的细菌不同，肠杆菌科一般缺少细胞色素C氧化酶。大部分具有许多鞭毛用于移动，但少数属是不动的。它们不形成芽孢，并且大部分情况下是过氧化氢酶阳性的。该科的许多成员是人和其他动物的肠中的肠道菌群的正常部分，同时其他成员可见于水或土壤中，或者是多种不同动物和植物的寄生物。大肠杆菌，更被称为E. coli，是最重要的模式生物之一，它的遗传和生物化学已被严密的研究过。肠杆菌科的大部分成员都具有周生的I型菌毛，参与细菌细胞与其宿主的附着。肠杆菌科的实例是E. coli、变形杆菌、 沙门氏菌、克雷伯氏菌。“巴斯德氏菌科”包括革兰氏阴性变形菌的一个大的且多样的科，成员从细菌如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)至动物和人类粘膜的共生菌。大部分成员作为共生菌生活在鸟类和哺乳动物的粘膜表面，特别是在上呼吸道。巴斯德氏菌科典型的是杆状的，并且是令人注意的一群兼性厌氧生物。可以通过存在氧化酶与相关的肠杆菌科区分开， 并且通过缺少菌毛与其他相似的细菌区分开。巴斯德氏菌科中的细菌基于代谢特性和16S 和23S RNA的序列分类为多个属。巴斯德氏菌科的更精确的定义可见于Dousse等，2008和 Kuhnert，P. 2008及其中的参考文献。许多巴斯德氏菌含有丙酮酸-甲酸-裂解酶，能够将碳源厌氧发酵为有机酸。术语“芽孢杆菌”指细菌的一个分类学类别，包括两个目，芽孢杆菌目和乳杆菌目(Lactobacillales)。芽孢杆菌代表了大型的( 4-8x1. 5im)圆柱状细菌，可以生长在37°C下的好氧条件中。典型的是非致病性的。芽孢杆菌科含有脂环酸芽孢杆菌科(Alicyclobacillaceae)、芽孢杆菌属(Bacillaceae)、显核菌科 (Caryophanaceae)、禾4" (Listeriaceae)、^Ur包If 胃禾4" (Paenibaci 1 laceae)、 动性球菌科(Planococcaceae)、芽孢乳杆菌科(Sporolactobacillaceae)、葡萄球菌科 (Staphylococcaceae)、高温放身寸菌禾斗(Thermoactinomycetaceae)、Turicibacteraceae。许多芽孢杆菌含有丙酮酸_甲酸-裂解酶，能够将碳源厌氧发酵为有机酸。术语“放线菌”或“放线菌类”指一类具有高G+C比例的革兰氏阳性菌。包括一些最常见的土壤生物，在有机材料降解中发挥作用作用。其他的放线菌栖居在植物和动物中， 实例是分支杆菌(Mycobacterium)、棒状杆菌(Corynebacterium)、诺卡氏菌(Nocardia)、 红球菌(Rhodococcus)和链霉菌(Str印tomyces)。一些放线菌形成分支的菌丝，一些类似于不相关的真菌的菌丝体，最初分在名为放射菌(Actinomycetes)的目下。大部分成员是好氧的，但少数生长在厌氧条件下。与另一大类革兰氏阳性菌一硬壁菌(Firmicutes)不同，其具有高GC含量的DNA。优选的细菌菌株是“巴斯德氏菌”属。巴斯德氏菌属的细菌是革兰氏阴性和兼性厌氧的。巴斯德氏菌是不动的、多形的和在大多数情况下过氧化氢酶和氧化酶阳性的 (Kuhnert 和 Christensen，2008，ISBN978-1-904455-34-9)。优选的细菌细胞是巴斯德氏菌细胞，更优选的是巴斯德氏菌菌株DDl细胞。最优选的，巴斯德氏菌菌株DDl是按布达佩斯条约保藏在德国DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZelIkuIturen,GmbH) ^iMMMW, ^UM^j^f OSW 18541。该菌株最初从德国来源的牛的瘤胃中分离。可以从动物，优选哺乳动物的胃肠道中分离巴斯德氏菌。特别是细菌菌株DDl可分离自牛的瘤胃，并能够利用甘油(包括粗制甘油)作为碳源。优选的，所述菌株具有从甘油(包括粗制甘油)生产SA的能力，特别是在厌氧条件下。此外，巴斯德氏菌菌株DDl表现出至少一种下列额外的代谢特征a)从蔗糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；b)从麦芽糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；c)从D-果糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；d)从D-半乳糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；e)从D-甘露糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；f)从D-葡萄糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；g)从D-木糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；h)从L-阿拉伯糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；i)不利用木糖醇、肌醇和山梨糖醇；j)在好氧和厌氧条件下都可生长；k)在75g/l或更高的初始葡萄糖浓度下生长；1)氨耐受性。特别的，所述菌株表现出至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或所有的所述代谢特征。分析菌株DDl共同代谢(co-metabolize)糖类和多元醇甘油的能力(PCT/ EP2008/006714)。发现DDl能够共同代谢麦芽糖和甘油，产生生物量形成、SA形成和同步的麦芽糖和甘油利用。c)优选的实施方案本发明的第一个实施方案涉及能够利用甘油作为碳源发酵生产SA的细菌菌株， 其中所述菌株是经过遗传修饰的，使其包含失调的内源性丙酮酸-甲酸-裂解酶活性。特别的是，所述丙酮酸_甲酸-裂解酶活性是减少或关闭的。所述含有活性减少的丙酮酸_甲酸-裂解酶的突变细菌，可通过遗传学手段以及应用现有技术文献中普遍已知的突变方法导入突变来构建(修饰细菌基因组的实例和描述可见于 Saier，Milton H Jr 2008 ；Foster, Patricia L，2007 ；ffitkin, E M 1969 ； Eisenstark, A 1971 ；Walker, GC 等，1983 和 1984 ；Botstein, D 和 Shortle, D 1985 及其中的参考文献)，所述细菌能够利用不同碳源的混合物如糖类和甘油；或者只利用甘油。分离 pfl基因中具有突变的菌株的方法可见于Varenne S等，1975和Pascal，M等，1981中。优选的所述菌株具有从不同的碳源(包括甘油)生产SA的能力，特别是在厌氧的条件下。在所述菌株的另一个实施方案中，参与或关系到甘油发酵转化为琥珀酸的至少一种其它酶活性是失调的。特别的是，所述菌株源自选自肠杆菌科、巴斯德氏菌科、芽孢杆菌科或放线菌科微生物的微生物。 特别的是，所述菌株源自巴斯德氏菌科的微生物，具有SEQ ID NO :1或表现出与其至少有96、97、98、99或99. 9%的序列同源性的序列的16SrDNA ；禾口 /或具有SEQ ID NO 2 或表现出与其至少有95、96、97、98、99或99. 9%的序列同源性的序列的23S rDNA。在本发明的一个实施方案中，细菌菌株是源自巴斯德氏菌科的微生物，并属于物种产琥珀酸巴斯德氏菌。产琥珀酸巴斯德氏菌是由Kuhnert等，2010定义的，其通过引用整合到本文中。本发明的细菌菌株还表现出至少一种下列额外的代谢特征
a)从蔗糖生产琥珀酸；
b)从麦芽糖生产琥珀酸；
C)从麦芽糊精生产琥珀酸；
d)从D-果糖生产琥珀酸；
e)从D-半乳糖生产琥珀酸；
f)从D-甘露糖生产琥珀酸；
g)从D-葡萄糖生产琥珀酸；
h)从D-木糖生产琥珀酸；
i)从L-阿拉伯糖生产琥珀酸；
j)从乳糖生产琥珀酸；
k)从棉子糖生产琥珀酸；
1)从甘油生产琥珀酸；
m)在75g/l或更高的初始葡萄糖浓度下生长；
η)在70g/l或更高的初始甘油浓度下生长。
作为示例，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或所有所述特征与特征1)(甘油-
SA)组合，其中特征1)作为每种所述组合中强制性的构成要素。在其他实施方案中，本发明的菌株将蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、 L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油转化为琥珀酸，产率系数YP/ S为至少0. 5g/g，优选达1. 28g/g ；作为示例，产率系数YP/S为至少0. 6g/g，至少0. Ig/ g,至少 0. 75g/g,至少 0. 8g/g,至少 0. 85g/g,至少 0. 9g/g,至少 0. 95g/g,至少 1. Og/g,至少 1.05g/g，至少 1.07g/g，至少 1.09g/g，至少 1. 10g/g，至少 1. llg/g，至少 1.22g/g，至少 1. 24g/g。在其他实施方案中，本发明的菌株表现出至少一种下列特征a)将至少25g/L的甘油转化为至少25. lg/L琥珀酸，产率系数YP/S为至少1. Olg/ g ；b)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0. 58g g DCW-1IT1琥珀酸，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、 乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；c)将至少一种碳源转化为琥珀酸，琥珀酸的时空产量为至少2. 2g/(Lh)琥珀酸， 所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、 D-甘露糖和/或甘油；d)将至少25g/L的至少一种碳源转化为琥珀酸，琥珀酸的时空产量为至少2. 2g/(Lh)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖和/或甘油；e)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0.58g g DCW^tT1琥珀酸， 且琥珀酸的时空产量为至少2. 2g/(L h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、D-果糖、 D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油。根据另一个实施方案，本发明的细菌菌株将至少28g/L的甘油转化为至少28. Ig/ L SA,产率系数 YP/S 为至少 1. Og/g,或> 1. Og/g,或> 1. 05g/g,或> 1. lg/g，或> 1. 15g/ g，或〉1.2(^/^，或> 1.22g/g，或〉1.24g/g，多达约 l，28g/g。例如，28g/L 葡萄糖可转化为多达约40或多达约35g/LSA。根据另一个实施方案，本发明的细菌菌株将至少一种碳源转化为SA，其比产出率为至少 0. 6g g DOr1IT1SA,或至少 0. 65，至少 0. 7g g DCW^T1，至少 0. 75g g DCW^T1，或至少0.77g g DCW-1IT1SA,所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-葡萄糖、 D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油。根据另一个实施方案，本发明的细菌菌株将至少一种碳源转化为SA，SA的时空产量为至少2. 2g/ (L h)，或至少2. 5，至少2. 75，至少3，至少3. 25，至少3. 5，或至少3. 7g/ (L h) SA,所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油。根据另一个实施方案，本发明的细菌菌株将至少28g/L的至少一种碳源转化为 SA,SA的时空产量为至少2. 2g/(L h)，或至少2. 5，至少2. 75，至少3，至少3. 25，至少3. 5， 或至少3. 7g/(Lh)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油。根据另一个实施方案，本发明的细菌菌株将至少一种碳源转化为SA，其比产出率为至少 0.6g g DCff^r1，或至少 0.65，或至少 0.7g g DOr1IT1SA,或至少 0. 77g g DCff^h-1SA, 且SA的时空产量为至少2. 2g/ (L h)，或至少2. 5，至少2. 75，至少3，至少3. 25，至少3. 5，或至少3. 7g/(L*h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油。优选的，本发明的所述菌株可源自用保藏编号DSM 18541保藏在DSMZ的菌株DDl， 或者源自具有生产琥珀酸能力的DDl的变体或突变菌株。本发明的特定的菌株生产琥珀酸(SA)和副产品(SSP)，SA/SSP的比值> 10 1、 或>12. 5 1、或> 15 1、或>17. 5 1、或> 20 1、或> 25 1、或> 30 1、或> 33 1，其中SSP代表副产物乳酸(LA)、甲酸(FA)、乙酸(AA)和苹果酸(MA)的总和，每种
量都按g/L表示。其他特定的菌株生产琥珀酸(SA)和副产品乙酸(AA)，SA/AA的比值> 10 1、 或>12. 5 1、或> 15 1、或>17. 5 1、或> 20 1、或> 25 1、或> 30 1、或> 40 1、或>50 1、或>75 1、或>90 1，每种量都按g/L表示。其他特定的菌株生产琥珀酸(SA)和副产品甲酸(FA)，SA/FA的比值> 90 1或 > 100 1，每种量都按g/L表示。本发明的另一个实施方案涉及发酵生产有机酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤
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a)在含有可同化的碳源的培养基中孵育任一项前述权利要求定义的细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株；和b)从培养基中获得所述有机酸，特别是SA，或其盐或衍生物。根据特定的方法，发酵是在存在二氧化碳的条件下，在约10至60°C的温度范围内，例如20至50°C，30至45°C，或25至35°C，和pH 5. 0-9. 0，例如5. 5-8,或6-7下实施的。 可以通过添加 NH4HC03、(NH4) 2C03、NaOH、Na2C03、NaHCO3, KOH、K2CO3, KHCO3, Mg (OH)2, MgCO3, MgH (CO3)2, Ca (OH)2, CaCO3, Ca (HCO3) 2、CaO, CH6N2O2, C2H7N 和 / 或其混合物来控制 pH。特别的是，所述可同化的碳源选自甘油、蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、乳糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、棉籽糖、淀粉的降解产物、纤维素、半纤维素和木质纤维素，及其混合物。特别的是，所述碳源是甘油或甘油与至少一种其它碳源的混合物，所述其它碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖、棉籽糖和L-阿拉伯糖。根据所述方法的特定的实施方案，可同化的碳源的浓度调节至在5-80g/L的范围内的值，例如10至60。本发明还提供了发酵生产琥珀酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤a)在含有至少一种可同化的碳源的培养基中孵育细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株；b)从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；额外的由至少一个下列特征来表征c)将至少25g/L的甘油转化为至少25. lg/L琥珀酸，产率系数YP/S为至少1. Og/ g ；d)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0. 58g g DCW-1IT1琥珀酸，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖、 棉籽糖和/或甘油；e)将至少一种碳源转化为琥珀酸，琥珀酸的时空产量为至少2. 2g/(L h)琥珀酸， 所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、 D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；f)将至少25g/L的至少一种碳源转化为琥珀酸，琥珀酸的时空产量为至少2. 2g/ (L h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、 乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；g)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0.6g g DCW-1IT1琥珀酸，且琥珀酸的时空产量为至少2. 2g/(L h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、 D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；h)生产琥珀酸(SA)和副产品(SSP)，SA/SSP的比值> 10 1、或> 12.5 1、或 >15 1、或>17. 5 1、或>20 1、或>25 1、或> 30 1、或> 33 1，其中 SSP 代表副产物乳酸(LA)、甲酸(FA)、乙酸(AA)和苹果酸(MA)的总和，每种量都表示为g/L ；i)生产琥珀酸(SA)和副产品乙酸(AA)，SA/AA的比值> 10 1、或> 12. 5 1、 或> 15 1、或>17.5 1、或>20 1、或>25 1、或>30 1、或>50 1、或>75 1、或>90 1，每种量都表示为g/L。根据所述方法的特定的实施方案，所述细菌菌株是如上定义的遗传修饰的细菌菌株。本发明的方法可以不连续或连续的实施。可通过常规的手段监控酸生产的过程， 例如HPLC或GC分析。优选的在厌氧条件下生产SA0可以通过常规技术建立厌氧条件，例如将反应培养基的成分脱气(degassing)和通过导入二氧化碳或氮气或其混合物以及任选的氢气来维持厌氧条件，所述导入气体的流速为例如0. 1-1或0. 2-0. 5vvm。可以通过常规技术建立好氧条件，例如通过导入空气或氧气，所述导入气体的流速为例如 0. 1-1 或 0. 2-0. 5vvm。合适时，可以根据本发明应用0. 1-1. 5bar的轻微超压。在另一个实施方案中，本发明提供了生产琥珀酸和/或琥珀酸铵盐的方法，所述方法包括如上定义的发酵生产琥珀酸，和额外的用碱性氨水或其含水溶液、或NH4HCO3、 (NH4) 2C03、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg (OH) 2、MgCO3、MgH (CO3) 2> Ca (OH)2, CaCO3、 Ca (HCO3) 2、CaO, CH6N2O2, C2H7N及其混合物来控制pH。一般而言，碱的物理条件可以是含水溶液、含水悬浮液、气体或固体。在一个实施方案中，通过任一项上下文所述的方法生产有机酸，特别是琥珀酸和/ 或其盐，并通过下列步骤进一步分离和/或纯化过滤和/或离心，阳离子交换层析和/或结晶。优选的，通过下列步骤进一步分离和/或纯化有机酸和/或其盐过滤，然后阳离子交换层析，然后结晶。过滤可用于分离细菌细胞和含琥珀酸的液体。过滤可以是渗滤、错流过滤和/或超滤。用于阳离子交换层析的材料可以是强酸性阳离子交换树脂。强酸性阳离子交换树脂携带例如磺酸基。特别的是，用于阳离子交换层析的材料可以是携带H+形式的磺酸基的苯乙烯-二乙烯苯共聚物。H+形式意指磺酸基是以酸性形式存在。优选的，阳离子交换层析树脂的平均颗粒尺寸是0. 3-1. 5，更优选0. 55-0. 75_，和/或堆积密度是700_800g/l。 阳离子交换层析树脂可以是大孔的。大孔意指阳离子交换树脂的平均孔直径优选从20至 120nm,优选从20至lOOnm，更优选从20至40nm。颗粒分布优选是单分散的。优选的，阳离子交换层析材料的总容量是0. 5-2. 0，更优选0. 8-1. 7，更优选1. 0-1. 5，更优选1. 4-1. 9min eq./l.。χ eq./l.意指IL阳离子交换树脂携带χ mo 1磺酸基。因此，eq./l.是相当于单电荷分子计算的。待纯化的琥珀酸盐可以是Na、K、Ca、Mg和/或铵盐。例如，强酸性阳离子交换树脂可以是 Lanxess 的 Type Lewatit Monoplus SP 112。优选的，在20_60°C，更优选45_60°C下实施阳离子交换层析。其他生产SA的优选方法描述如下
方法1 在另一个实施方案中，本发明提供了发酵生产SA或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤a.在含有至少一种可同化的碳源的培养基中孵育细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株；b.从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；所述方法另外的特征是将至少50g/L的甘油转化为至少50g/L SA，产率系数YP/S 为至少 1. Og/g ;或> 1. Og/g,或> 1. 05g/g,或> 1. lg/g，或> 1. 15g/g，或> 1. 20g/g,或> 1. 22g/g，或> 1. 24g/g，多达约l，28g/g ；例如，产率系数YP/S为至少0. 6g/g ；至少0. Ig/ g,至少 0. 75g/g,至少 0. 8g/g,至少 0. 85g/g,至少 0. 9g/g,至少 0. 95g/g,至少 1. Og/g,至少
1.05g/g，至少 1. lg/g，至少 1. 15g/g，至少 1. 20g/g，至少 1. 22g/g，或至少 1. 24g/g。例如， 50g/L甘油可转化为多达约65或多达约62. 5g/L SA或多达约60g/L SA。方法2 在另一个实施方案中，本发明提供了发酵生产SA或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤a.在含有至少一种可同化的碳源的培养基中孵育细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株，其中所述菌株具有活性减少的丙酮酸_甲酸-裂解酶；b.从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；所述方法另外的特征是将碳源转化为SA，其比产出率为至少0.42g gDCff^h^SA, 或至少0.45，或至少0.47g g DCW-1IT1SA,或至少0. 49gg DOr1IT1SA,所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、棉籽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和 /或甘油。方法3 在另一个实施方案中，本发明提供了发酵生产SA或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤a.在含有至少一种可同化的碳源的培养基中孵育细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株，其中所述菌株具有活性减少的丙酮酸_甲酸-裂解酶；b.从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；所述方法另外的特征是将碳源转化为SA，SA的时空产量为至少2. 22g/(L h)，或至少2. 5，至少2. 75，至少2. 9g/(L*h)SA，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、棉籽糖、 D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油。方法4 在另一个实施方案中，本发明提供了发酵生产SA或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤a.在含有至少一种可同化的碳源的培养基中孵育细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株；b.从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；所述方法额外的特征是将至少50g/L的碳源转化为SA，SA的时空产量为至少
2.2g/ (L h)，或至少2. 5，至少2. 75，至少3，至少3. 25，至少3. 5或至少3. 7g/ (L*h) SA,所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、棉籽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油。方法5 在另一个实施方案中，本发明提供了发酵生产SA或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤a.在含有至少一种可同化的碳源的培养基中孵育细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株；b.从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；所述方法额外的特征是将碳源转化为SA，其比产出率为至少0. 6g gDCWHpSA，或至少 0. 65，或至少 0. 7g g DOr1IT1SA,或至少 0. 75gg DCW^T1SA,或至少 0. 77g g DCW^T1SA, 且SA的时空产量为至少2. 2g/ (L h)，或至少2. 5，至少2. 75，至少3，至少3. 25，至少3. 5 或至少3. 7g/(L*h)SA，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、棉籽糖、D-果糖、D-葡萄糖、 D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油。在上文所述的生产SA的方法1至5的另一个实施方案中，碳源是甘油，或甘油与至少一种其他碳源的混合物，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖。用于生产SA的特别合适的条件是碳源葡萄糖、木糖、麦芽糖或麦芽糊精、棉籽糖和/或甘油(包括粗制甘油)温度30至 45°C;pH :5. 5至7. 0，如上所述由碱控制，优选通过HCOf源，如Na2CO3、NaHCO3、 Mg (HCO3) 2、Ca (HCO3) 2 或 Mg (OH) 2、MgCO3、Ca (OH) 2、CaCO3。供气CO2。可以通过本领域已知方法的常规方式分离所产生的SA和/或SA盐，例如结晶、过滤、电透析、层析。例如，进一步分离和/或纯化有机酸和/和其盐。可以通过在发酵过程中使用氢氧化钙、氧化钙、碳酸钙或碳酸氢钙中和，在发酵罐中沉淀琥珀酸钙产物并过滤所述沉淀进行分离。通过用硫酸酸化琥珀酸，再通过过滤去除硫酸钙(石膏)或沉淀物，从沉淀的琥珀酸钙中回收所需的SA产物。为了去除不需要的残留离子，可通过离子交换层析的手段进一步纯化所获得的溶液。在另一个实施方案中，本发明提供了生产四氢呋喃(THF)和/或1，4_ 丁二醇 (BDO)禾Π /或Y - 丁内酯(GBL)的方法，包括b)如上定义的发酵生产琥珀酸和/或琥珀酸盐，和bl)将获得的游离酸直接催化加氢为THF和/或BDO和/或GBL，或b2)将获得的游离琥珀酸和/或琥珀酸盐化学酯化成其相应的二-低烷基酯，和之后将所述酯催化加氢为THF和/或BDO和/或GBL。在另一个实施方案中，本发明提供了生产吡咯烷酮的方法，包括a)如上定义的发酵生产琥珀酸铵盐，和b)以本身已知的方式将琥珀酸铵盐化学转化成吡咯烷酮。在所述甘油加工的特定实施方案中，所述用作可同化的碳源的甘油是粗制甘油， 特别是通过酯切割三甘油酯(triacylglyceride)获得的。例如，甘油是从生物柴油生产中获得的废弃产品。本发明还涉及如上定义的细菌菌株的用途，用于发酵生产有机精细化学品，例如琥珀酸或其盐或衍生物。d)其他具体实施方案dl)遗传操作根据另一个实施方案，本发明的细菌菌株含有编码丙酮酸-甲酸-裂解酶(pfl) 突变酶的基因，其酶活性是如EC编号EC 2.3. 1.54定义的。例如，pfl酶活性受pfIA基因中的突变的负面影响，或受PflA基因的表达调控的负面影响。PflA基因和pflA基因产物的序列可见于下列登录号GeneID =6268899, YP_001880903。该基因的同源物已知位于登录号=NCBI-GeneID 945514、945444、947623、948454、3075405 ；相应的蛋白质位于登录号 UniProt :Ρ09373、Ρ75793、Ρ42632、Ρ32674、Q65VK2。在本发明范围内的还有编码丙酮酸-甲酸-裂解酶的激活酶的基因，是由EC编号 EC 1. 97. 1. 4定义的，并描述在Knappe等，1990和1993中，具有减少的或失调的活性。可以通过导入突变或通过本发明描述的方法删除基因来实施。该酶的实例是由以下基因编码的，其中所述酶的活性可以减少或者其编码基因可以突变或失调pfl激活酶基因PflA和 yfiD基因、在登录GeneID =947068下已知的E. coli K12基因、具有登录号NCBI-GeneID 945445的基因ybiY和相应的蛋白质NP_415345、在登录GeneID :AAU37008下已知的产琥珀酸曼海姆氏菌(Mannheimia succiniproducens)基因、在登录号 YP_087593、NP_417074 和 YP_087564下的相应的蛋白质及该基因的同源物。描述的是非突变基因序列的登录号，所述序列将进行本发明所述的突变或删除。还落入本发明范围内的是通过携带相应基因的基因突变，表现出降低活性的蛋白质arcA的菌株，例如登录号ECK4393(还已知位于下列描述下cpxC、fexA、sfrA、msp)或 fnr,已知 arcA 是登录号 NCBI-GeneID =948874,而 fnr 是 NCBI-GeneID :945908。相应的蛋白质序列可见于登录号P0A9E5。已知其他生物体相似的基因，例如产琥珀酸曼海姆氏菌。 arcA 是 NCBI-GeneID 3076294 和相应的蛋白质 YP_088696，fnr 是 NCBI-GeneID 3075449 和 UniProt :Q65TM6。还落入本发明范围内的是表现出降低的乳酸脱氢酶活性的菌株，所述乳酸脱氢酶是由EC编号EC 1.1. 1.27和EC 1. 1. 1. 28定义的，编码具有特异性生产D-乳酸或 L-乳酸或两者的特异性的酶。实例是E. coli基因NCBI-GeneID :946315和相应的蛋白质 NP_415898，或M产琥珀酸基因NCBI-GeneID 3075603和相应的蛋白质YP_089271。根据另一个实施方案，本发明的细菌菌株含有(1)编码由EC命名法如EC 2. 3. 1.54定义的丙酮酸-甲酸-裂解酶的突变基因，所述酶具有减少的活性；和/或(2)编码由EC命名法如EC 1. 97. 1. 4定义的编码丙酮酸-甲酸-裂解酶的激活酶的突变基因，所述酶具有减少的活性；和/或(3)编码arcA蛋白的突变基因，和/或(4)编码由EC命名法如ECl. 1. 1.27或ECl. 1. 1.28定义的乳酸脱氢酶的突变基因，具有减少的活性。用于制备遗传修饰的本发明细菌菌株的特定方法是有时在本文中被称为 "Campbel 1 重组”的技术(Leenhout s 等，1989，Appl Env Microbiol 55，394_400)。本文使用的“Campbell in”指制备原始宿主细胞的转化体，其中完整的环状双链DNA分子(例如，质粒)已通过单次同源重组事件(交叉加入事件)整合到染色体中，有效的导致将所述
19环状DNA分子的线性化版本插入到染色体的第一 DNA序列中，所述染色体的第一 DNA序列是与所述环状DNA分子的第一 DNA序列同源的。“被Campbell in的”指整合到“Campbell in”转化体的染色体中的线性化DNA序列。“Campbell in”含有第一同源DNA序列的重复， 每份拷贝都包括并围绕了同源重组交叉点的拷贝。本文使用的“Campbell out”指来自“Campbell in”转化体的细胞，其中第二同源重组事件(交叉去除事件(cross out))发生在两种第二 DNA序列之间，一种第二 DNA序列包含在“被Campbell in的”DNA的线性化的插入DNA中，另一种是染色体来源的第二 DNA 序列，后者与所述线性化插入物的第二 DNA序列是同源的。第二重组事件导致一部分整合的DNA序列的删除(丢弃(jettisoning))，但重要的是，还导致一部分(可以少至单个碱基)整合的“被Campbell in的"DNA保留在染色体中，使得相比原始的宿主细胞，“Campbell out”细胞在染色体中含有一个或多个有目的的改变(例如，DNA序列的删除、单碱基取代、 多碱基取代、异源基因或DNA序列的插入、额外的拷贝的同源基因或修饰的同源基因的插入、或者插入包含一个以上上文列举的上述实例的DNA序列)。"Campbell out”细胞优选的是通过对包含在“被Campbell in的”的DNA序列的一部分(所述部分是需要被丢弃的)中基因进行反选择(counter-selection)而获得的， 例如枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)sacB基因，其在存在约5%至10%的蔗糖的条件下生长的细胞中表达时是致死的。不论有或没有反选择，都可使用任何可筛选的表型，通过筛选理想的细胞获得“Campbell out”细胞，可筛选的表型例如但不限于菌落形态、菌落颜色、存在或缺少抗生素抗性、通过聚合酶链式反应存在或缺少给定的DNA序列、存在或缺少营养缺陷型、存在或缺少某种酶、存在或缺少某种酶活性如丙酮酸_甲酸裂解酶活性或乳酸脱氢酶活性、菌落核酸杂交、抗体筛选等。术语“Campbell in”和“Campbell out”还可用作各种时态的动词，指代上文所述的方法或工艺。可以理解，导致“Campbell in”或“Campbell out”的同源重组事件可以发生在同源DNA序列内的一系列的DNA碱基上，由于在至少一部分该系列中的同源序列是彼此相同的，通常不能确切的说明交换事件发生的位置。换言之，不能准确的说明哪条序列是原始来自插入DNA的，哪条是原始来自染色体DNA的。此外，第一同源DNA序列和第二同源DNA序列通常被部分非同源区分开，该非同源区仍然储存在“Campbell out”细胞的染色体中。优选的，第一和第二同源DNA序列的长度至少是约200碱基对，并且长度可多达数千碱基对。然而，所述程序可作用于更短或更长的序列。例如，第一和第二同源序列的长度范围可从约500至2000个碱基，通过安排第一和第二同源序列为约相同长度，可有利于获得“Campbell out”和“Campbell in”细胞，优选少于200碱基对的差异，最优选两链中较短的链是按碱基对计长度较长链的至少70%。通过应用上述遗传修饰的方法，通过按下列实施例中更详细描述的，删除内源性丙酮酸-甲酸-裂解酶和/或乳酸脱氢酶的基因，来制备特定SA生产菌株(即，DDI)的变体菌株。d2)发酵步骤根据本发明使用的发酵可以在例如搅拌发酵罐、泡罩塔和环流反应器中实施。对可能的方法类型(包括搅拌类型和几何设计)的综合概述可见于“Chmiel Bioprozesstechnik :Einf iihrung in die Bioverfahrenstechnik,Band 1，，中。在本发明的工艺中，可获得的典型的变体是本领域技术人员已知的下列变体或解释在例如“Chmiel， Hammes and Bailey =Biochemical Engineering”中，如在有或没有生物量循环的条件下的分批式、分批补料式(fed-batch)、重复分批补料式或者连续式发酵。根据生产菌株，为了实现良好的产量(YP/S)，可实施空气、氧气、二氧化碳、氢气、氮气或恰当的气体混合物喷射。在根据本发明的方法实施发酵液中预计的化学转化之前，可以预处理发酵液；例如可以去除发酵液的生物量。去除生物量的方法是本领域技术人员已知的，例如过滤、沉降和浮选。随后，可以去除生物量，例如用离心机、分离器、倾析器(decanter)、滤器或浮选装置。为了最大程度回收有价值的产品，洗涤生物量通常是明智的，例如以渗滤的形式。方法的选择取决于发酵液中的生物量含量和生物量的特性，还有生物量与有价值的产物的相互作用。在一个实施方案中，可以将发酵液灭菌或巴氏消毒。在其他实施方案中，浓缩发酵液。根据需求，可以分批或连续的进行所述浓缩。压力和温度范围的选择应使得首先不发生产品损坏，其次只需要最小程度的使用装置和能量。为多级蒸发熟练的有技巧地压力和温度水平尤其能够节省能量。可以在天然的或强制的循环模式下，利用搅拌槽、降膜式蒸发器、薄膜式蒸发器、 强制快速循环蒸发器和其他的蒸发器类型。d3) SA的酯化作用和氢化作用用于实施化学酯化作用，再直接催化氢化的合适实验条件是普遍已知的，例如，描述在欧洲专利申请06007118. O中，通过引用整合到本文中。a)酯化方法包含活性蒸馏(reactive distillation)的酯化方法可使用本身已知的各种设计的装置来实施。例如，可以使用以连续模式操作的酯化设备，其包括整流柱(rectification column)，所述整流柱通过安装塔板(tray)或填料筐(packing)而获得恰当数量的理论级数(theoretical stage) 0 一旦柱内形成了稳态的温度谱，就将包括SA的铵盐在内的含水电荷从储存容器加到柱的顶部，所述温度谱是进料链烷醇的结果，所述链烷醇在附着在柱的贮槽上的蒸发器环路中蒸发。反应形成了下降的、含铵盐的液体与冷凝且上升的、含链烷醇的蒸汽相的逆流。为了催化酯化反应，可以向铵盐初始量中添加均质性催化剂。可选的， 可以在柱内部提供异质性催化剂。在方法条件下形成的羧酸酯是液体，并通过柱的较低端进入蒸馏柱的贮槽中，并从贮槽中持续取出。气态组分，例如包含链烷醇_水和/或氨的共沸混合物，被从反应柱中去除，因而从柱顶部的反应平衡中去除。本领域技术人员可以在不付出不可接受的努力的条件下，执行上述具体实施方案的其他修饰。根据所使用的装置的结构，例如使用的柱内部的类型、反应物的类型和量、和恰当时使用的催化剂的类型和量，本领域技术人员可以容易的确定为根据本发明的酯化过程安排的合适的过程参数。例如，在不限于此的条件下，各个参数可设定在下列参数范围内柱温度0-300°C，特别是40_250°C，或 70_200°C ；压力从0. 1至6bar，特别是标准压力；停留时间若干秒(例如1-60秒)至数天(例如1-5天)，特别是从若干分钟(例如1-60分钟)至若干小时(例如1-15小时)，更优选从若干分钟(例如5-20分钟)至2h。
b)氢化过程以本身已知的方式，氢化根据本发明本身制备的SA或SA酯，使用本领域技术人员熟知的方法、装置和助剂，例如催化剂。特别的是，在存在适合酯类氢化的异质性催化剂的条件下进行连续或分批的气相氢化。本领域技术人员可以在不进行不可接受的努力的条件下，为特定的酯确立优化的过程参数。例如，反应温度在从约100至约300°C的范围内，优选在从约200至280°C的范围内，压力是从约5至约lOObar，例如从约10至约50bar。反应物与氢的摩尔比设定在从约 1 100至约1 2000的范围内，例如从约1 800至约1 1500。可用于氢化反应的催化剂是本领域技术人员已知的。例如，可使用各种铜催化剂。现有技术描述了例如使用还原的亚铬酸铜催化剂，其可从Davy Process Technology Ltd.，England以商品名85/1获得。然而，特别适合本发明的催化剂是负载型氧化铜(supported copper oxide)催化剂，氧化铜覆于铝或硅支持材料上。用铜催化剂将琥珀酸酯氢化为BD0(1，4-丁二醇)/GBL(y-丁内酯)/THF的实例也描述在下列论文中:Schlander, Jan. , Feb. 2000, University of Karlsruhe, ‘‘Gasphasenhydrierung von Maleinsauredimethylester zul，4-Butandiol，gamma-Butyrolacton und Tetrahydrofuran an Kupfer—Katalysatoren’，。通过下列实施例可更详细的描述本发明。下列实施例是用于示例的目的，并非意在限制本发明的范围。 实施例一遗传修饰和培养实施例1 :DD1转化的一般方法表1 实施例中提及的DDl野生型和变体的命名。
权利要求
1.能够利用甘油作为碳源发酵生产琥珀酸的细菌菌株，其中所述菌株是经过遗传修饰的，使其包含失调的内源性丙酮酸-甲酸-裂解酶活性。
2.权利要求1的菌株，其中所述丙酮酸-甲酸-裂解酶活性是减少或关闭的。
3.任一项前述权利要求的菌株，其中参与或关系到甘油发酵转化为琥珀酸的至少一种其它酶活性是失调的。
4.任一项前述权利要求的菌株，其源自选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)或放线菌科(Actinobacteria)微生物的微生物。
5.任一项前述权利要求的菌株，其源自巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的微生物， 具有序列为SEQ ID N0:1的16S rDNA ；或与其表现出至少96、97、98、99或99. 9%的序列同源性的序列。
6.权利要求5的菌株，具有序列为SEQID N0:2的23S rDNA ；或与其表现出至少95、 96、97、98、99或99. 9%的序列同源性的序列。
7.任一项前述权利要求的菌株，其源自肠杆菌科的微生物。
8.任一项前述权利要求的菌株，其源自巴斯德氏菌科的微生物。
9.任一项前述权利要求的菌株，其源自芽孢杆菌科(Bacilli)的微生物。
10.任一项前述权利要求的菌株，其源自放线菌科的微生物。
11.任一项前述权利要求的菌株，其表现出至少一种下列额外的代谢特征a)从蔗糖生产琥珀酸；b)从麦芽糖生产琥珀酸；c)从麦芽糊精生产琥珀酸；d)从D-果糖生产琥珀酸；e)从D-半乳糖生产琥珀酸；f)从D-甘露糖生产琥珀酸；g)从D-葡萄糖生产琥珀酸；h)从D-木糖生产琥珀酸；i)从L-阿拉伯糖生产琥珀酸；j)从乳糖生产琥珀酸；k)从棉子糖生产琥珀酸；1)从甘油生产琥珀酸；m)在75g/l或更高的初始葡萄糖浓度下生长；η)在70g/l或更高的初始甘油浓度下生长。
12.任一项前述权利要求的菌株，其将蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油转化为琥珀酸，产率系数YP/S为至少 0. 5g/g。
13.任一项前述权利要求的菌株，具有至少一种下列特征a)将至少25g/L的甘油转化为至少25.lg/L琥珀酸，产率系数YP/S为至少1. 01g/g ；b)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0.58gg DCW-1IT1琥珀酸，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、 D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；C)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其时空产量为至少2. 2g/(L h)琥珀酸，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖和/ 或甘油；d)将至少25g/L的至少一种碳源转化为琥珀酸，琥珀酸的时空产量为至少2.2g/(L h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、 D-甘 露糖和/或甘油；e)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0.58gg DCW-1IT1琥珀酸，且琥珀酸的时空产量为至少2. 2g/ (L h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油。
14.任一项前述权利要求的菌株，其源自用保藏编号DSM18541保藏在DSMZ的菌株 DDl，或者源自具有生产琥珀酸能力的DDl的变体或突变菌株。
15.任一项前述权利要求的菌株，其生产琥珀酸(SA)和副产品(SSP)，SA/SSP的比值> 10 1、或>12. 5 1、或>15 1、或>17. 5 1、或>20 1、或>25 1、或>30 1、 或> 33 1，其中SSP代表副产物乳酸(LA)、甲酸(FA)、乙酸(AA)和苹果酸(MA)的总和， 每种量都按g/L表示。
16.任一项前述权利要求的菌株，其生产琥珀酸(SA)和副产品乙酸(AA)，SA/AA的比值> 10 1、或>12. 5 1、或> 15 1、或>17. 5 1、或> 20 1、或> 25 1、或> 30 1、或>40 1、或>50 1、或>75 1、或> 90 1，每种量都按g/L表示。
17.任一项前述权利要求的菌株，其生产琥珀酸(SA)和副产品甲酸(FA)，SA/FA的比值>90 1或>100 1，每种量都按g/L表示。
18.发酵生产有机酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤a)在含有可同化的碳源的培养基中孵育任一项前述权利要求定义的细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株；和b)从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物。
19.权利要求18的方法，其中发酵是在存在二氧化碳的条件下，在约10至60°C的温度范围内和PH 5.0-9.0实施的。
20.权利要求18或19的方法，其中所述有机酸是琥珀酸。
21.权利要求18至20的任一项的方法，其中可同化的碳源选自甘油、蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、乳糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、棉籽糖、淀粉的降解产物、纤维素、半纤维素和木质纤维素，及其混合物。
22.权利要求21的方法，其中碳源是甘油或甘油与至少一种其它碳源的混合物，所述其它碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖、棉籽糖和L-阿拉伯糖。
23.权利要求18至22的任一项的方法，其中可同化的碳源的浓度调节至5-80g/L的范围内的值。
24.发酵生产琥珀酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤a)在含有至少一种可同化的碳源的培养基中孵育细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株；b)从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；另外具有至少一种下述特征；C)将至少25g/L的甘油转化为至少25. lg/L琥珀酸，产率系数YP/S为至少1. Olg/g ；d)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0.58gg DCW-1IT1琥珀酸，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；e)将至少一种碳源转化为琥珀酸，琥珀酸的时空产量为至少2.2g/(L h)琥珀酸，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；f)将至少25g/L的至少一种碳源转化为琥珀酸，琥珀酸的时空产量为至少2.2g/(L h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、 D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；g)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0.6gg DCW—l·1琥珀酸，且琥珀酸的时空产量为至少2. 2g/(L h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、 L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；h)生产琥珀酸(SA)和副产品(SSP)，SA/SSP的比值>10 1、或> 12.5 1、或> 15 1、或>17. 5 1、或>20 1、或>25 1、或> 30 1、或> 33 1，其中 SSP 代表副产物乳酸(LA)、甲酸(FA)、乙酸(AA)和苹果酸(MA)的总和，每种量都按g/L表示；i)生产琥珀酸(SA)和副产品乙酸(AA)，SA/AA的比值>10 1、或> 12.5 1、或> 15 1、或>17. 5 1、或>20 1、或>25 1、或> 30 1、或> 50 1、或> 75 1、 或>90 1，每种量都按g/L表示。
25.权利要求24的方法，其中所述细菌菌株是权利要求1-17的任一项定义的菌株。
26.权利要求18至25的任一项的方法，不连续或连续的实施。
27.生产琥珀酸和/或琥珀酸铵盐的方法，所述方法包括根据权利要求18-26的任一项发酵生产琥珀酸，和用氨水或其含水溶液、或NH4HCO3、(NH4) 2C03、NaOH, Na2CO3^ NaHC03、KOH、 K2CO3、KHCO3、Mg (OH) 2、MgCO3、MgH (CO3) 2、Ca (OH) 2、CaCO3、Ca (HCO3) 2、CaO、CH6N2O2、C2H7N 及其混合物来控制pH。
28.权利要求18至27的任一项的方法，其中通过过滤、结晶、电透析和/或阳离子交换层析进一步分离和/或纯化有机酸和/和其盐。
29.权利要求18至28的任一项的方法，通过下列步骤进一步分离和/或纯化有机酸和 /和其盐过滤，然后阳离子交换层析，然后结晶。
30.权利要求28和29的任一项的方法，其中用于阳离子交换层析的材料是以H+形式携带磺酸基的阳离子交换树脂，总容量为0. 5-2. 0当量/1阳离子交换树脂。
31.权利要求28-30的任一项的方法，其中在从45至60°C的温度下实施阳离子交换层析。
32.生产四氢呋喃(THF)和/或1，4-丁二醇(BDO)和/或γ-丁内酯(GBL)的方法， 包括a.如权利要求27定义的发酵生产琥珀酸和/或琥珀酸盐，和 bl.将获得的游离酸直接催化加氢为THF和/或BDO和/或GBL，或 b2.将获得的琥珀酸和/或琥珀酸盐化学酯化成其相应的二-低烷基酯，和之后将所述酯催化加氢为THF和/或BDO和/或GBL。
33.生产吡咯烷酮的 方法，包括a)如权利要求27定义的发酵生产琥珀酸铵盐的，和b)以本身已知的方式将琥珀酸铵盐化学转化成吡咯烷酮。
34.权利要求21-33的任一项的方法，其中所述用作可同化的碳源的甘油是通过酯切割三甘油酯(triacylglyceride)获得的。
35.权利要求34的方法，其中甘油是从生物柴油生产中获得的废弃产品。
36.权利要求1-17的任一项定义的细菌菌株的用途，用于发酵生产有机精细化学品。
37.权利要求36的用途，其中有机精细化学品是琥珀酸或其盐或衍生物。
全文摘要
本发明涉及能够利用甘油作为碳源发酵生产琥珀酸的细菌菌株，其中所述菌株是经过遗传修饰的，使其包含失调的内源性丙酮酸-甲酸-裂解酶活性，并涉及利用此类微生物生产有机酸，特别是琥珀酸的方法。本发明还涉及通过阳离子交换层析对所生产的有机酸的下游加工。
文档编号C12R1/01GK102317438SQ201080007963
公开日2012年1月11日 申请日期2010年2月12日 优先权日2009年2月16日
发明者A·拉达茨, 阿本德罗特 G·冯, H·古尔斯基, H·恩斯特, H·施罗德, R·霍尔曼, S·哈夫纳 申请人:巴斯夫欧洲公司