专利名称：阿洛酮糖-差向异构酶的固定化以及使用所述阿洛酮糖-差向异构酶制备d-阿洛酮糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过使用来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)且以食品安全形式表达的阿洛酮糖-差向异构酶(psicose-epimerase)而连续地由D-果糖或D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法。
背景技术：
D-阿洛酮糖已广泛用作功能性甜味剂，其具有类似于糖的甜味，但却是超低能量(ultralow-energy)单糖。具体来说，D-阿洛酮糖被称为“稀有糖”，因为其在自然界中很少能找到，并且即使找到，也只有少量。D-阿洛酮糖是D-果糖的差向异构体Gpimer)，并且其甜味强度和种类完全类似于D-果糖。然而，与D-果糖相反，因为吸收到体内时，D-阿洛酮糖很少被代谢，因此其具有 几乎零卡路里。此外，由于其通过抑制关于脂质合成的酶活性而减轻腹部肥胖(abdominalobesity)的作用，因此D-阿洛酮糖可用作减肥食品(diet food)的有效成分。另外，广泛用作糖替代品的糖醇在过量服用时具有引起诸如腹泻等副作用的问题，但D-阿洛酮糖几乎没有副作用(T.松尾(Matsue7T.), Y.巴巴(Y. Baba), M.桥口 (M. Hashiguchi), K.竹下(K. Takeshita), K.伊珠莫里(K. Izumori),以及 H.铃木(H. Suzuki). 2001.膳食 D-阿洛酮糖，即D-果糖的C-3差向异构体,抑制小鼠体内肝脂肪生成酶的活性(Dietary D-psicose,a C-3 epimer of D-fructose,suppresses the activity of hepatic lipogenic enzymesin rats).亚太临床营养学杂志(Asia Pac. J. Clin. Nutr.) 10 :233-237. ；T.松尾，以及K.伊珠莫里.2004. D-阿洛酮糖，一种不提供能量而提供用于临床营养学的其它有益作用的稀有糖(D-psicose, a rare sugar that provides no energy and additionallybeneficial effects for clinical nutrition).亚太临床营养学杂志 13 :S127)。由于这些原因，D-阿洛酮糖作为膳食甜味剂而逐渐在食品工业领域中引起注意，并且因此，越来越需要开发一种有效制备D-阿洛酮糖的方法。通过使用阿洛酮糖-差向异构酶制备D-阿洛酮糖的常规方法，著重于开发一种通过使用在重组大肠杆菌(E.coli)中大规模表达的重组酶或包括所述重组酶的宿主细胞而使D-果糖差向异构化为D-阿洛酮糖的方法。然而，就食品安全性来说，使用所述重组大肠杆菌进行D-阿洛酮糖的生物技术制备并不适合用于制备作为食品材料的D-阿洛酮糖。为了制备适合用作食品材料的D-阿洛酮糖，需要开发一种使用在宿主细胞中表达的阿洛酮糖-差向异构酶或使用包括其的宿主的大规模生产方法，所述宿主细胞为公认安全(Generally RecognizedAs Safe ；GRAS)菌株以及能够在工业上大规模生产的菌株。当物质在经通过科学训练及经验而具有资格的专家通过科学程序在其预期用途的条件下评估其安全性时一般被确认为安全，则授予GRAS。虽然GRAS是仅在美国实施的独特系统，但其重要性以及必要性已在国际上以及在美国得到认可。因此，人们越来越关注GRAS的发展。
同时，对于D-阿洛酮糖的工业生产，需要开发一种由更廉价的底物(substrate)制备D-阿洛酮糖的方法。目前，由于阿洛酮糖-差向异构酶的高底物特异性，因此制备D-阿洛酮糖只能使用昂贵的D-果糖作为底物。
发明内容
技术问题本发明已对大规模生产可用作食品材料的D-阿洛酮糖进行了积极研究，并且发现由D-果糖或D-葡萄糖连续制备D-阿洛酮糖可通过使用固定化(immobilization)来对用于工业上大规模生产D-阿洛酮糖的酶促活化(enzymatic activation)提供稳定的环境，并使用D-葡萄糖异构酶以及阿洛酮糖-差向异构酶来达成。本发明的一目的在于提供一种呈食品安全形式的阿洛酮糖-差向异构酶，用于制备可用作食品材料的D-阿洛酮糖。本发明的另一目的在于提供一种通过使用呈固定的食品安全形式的阿洛酮糖-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶而由D-葡萄糖或D-果糖连续制备D-阿洛酮糖的方法。技术解决方案本发明提供一种通过使用来源于根癌农杆菌且在GRAS菌株中表达的阿洛酮糖-差向异构酶而由D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法。本发明的方法包括以下步骤在GRAS菌株中表达来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶；以及通过使用所表达的阿洛酮糖-差向异构酶而由D-果糖制备D-阿洛酮糖。本发明的方法还可包括以下步骤自能够表达来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶的GRAS菌株的培养物(culture)分离阿洛酮糖_差向异构酶；以及通过使用所分离的阿洛酮糖-差向异构酶而由D-果糖制备D-阿洛酮糖。表达来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶的GRAS菌株可为经过包含编码上述酶的基因的重组表达载体转化(transform)的菌株。根据本发明的用于制备D-阿洛酮糖的阿洛酮糖-差向异构酶可呈包含于GRAS菌株的培养物中或从所述培养物分离的形式，上述GRAS菌株表达来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶。GRAS菌株可为经过包含编码阿洛酮糖-差向异构酶的基因的重组表达载体转化的菌株。GRAS菌株可为棒状杆菌属(Corynebacterium sp.),优选为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum) KCCM 11046P。本发明的方法中使用的来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶优选具有SEQID NO 1的氨基酸序列。根据本发明的制备D-阿洛酮糖的方法可还包括将阿洛酮糖-差向异构酶固定于载体上的步骤。适合于本发明的载体可包含海藻酸盐(alginate)，优选为海藻酸钠，但不限于此。根据本发明的制备D-阿洛酮糖的方法可还包括用其上固定有阿洛酮糖-差向异构酶的载体填充管柱，并向填充床管柱(packed-bed column)供应D-果糖溶液的步骤。本发明还更提供一种由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法，其包括将阿洛酮糖-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶(isomerase)固定于载体上的步骤。适合于本发明的载体可包含海藻酸盐，优选为海藻酸钠，但不限于此。在如上文所述的方法中，阿洛酮糖-差向异构酶可包含于能够表达来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶的GRAS菌株的培养物中或从所述培养物分离。GRAS菌株可为经过包含编码阿洛酮糖-差向异构酶的基因的重组表达载体转化的菌株。此外，GRAS菌株可为棒状杆菌属，优选为谷氨酸棒状杆菌KCCM 11046P。本发明的方法中所用的来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶优选具有SEQID NO 1的氨基酸序列。另外，本发明更提供一种由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法，其包括以下步骤将阿洛酮糖-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶固定于载体上；用其上固定有阿洛酮糖-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶的所述载体填充管柱；以及向填充床管柱供应D-葡萄糖溶液。其上固定有阿洛酮糖-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶的载体可填充于同一管柱中，或分别填充于两个各别管柱中。然而，优选将载体填充于各别管柱中，且在这种情况下，两 个各别管柱互相连接。本发明提供一种适用于由D-果糖或D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的谷氨酸棒状杆菌 KCCM 11046P 菌株。如本文中所使用，术语“食品安全形式”的意思是其安全性足以用作食品材料。因此，如本文中所使用，术语“以食品安全形式表达”的意思是目标基因在被认为安全且尽管用作食品材料却不会引起有害作用的菌株(例如GRAS菌株)中表达。在本发明的一个实施例中，用重组载体转化GRAS菌株的方法可包含电穿孔，但不限于此，并且可使用本发明所属领域的技术人员已知的任何转化方法来进行。在本发明的一个实施例中，包含编码来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶的基因的重组载体可包含阿洛酮糖-差向异构酶编码基因，其为可操作地连接于在棒状杆菌属细菌中具有活性的启动子(promoter)。所述启动子可具有序列SEQ ID NO :2到SEQ IDNO 8中的一个，已证实上述序列表达目标基因的有效性闻于棒状杆菌属细菌中的tac启动子(韩国专利公开案第2006-0068505号)。如本文中所使用，术语“阿洛酮糖-差向异构酶”的意思是具有使D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化活性的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。在本发明的一个实施例中，来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶可具有SEQ ID NO : I的氨基酸序列或其功能性片段(functional fragment)。功能性片段的意思是在氨基酸序列SEQ ID NO :I中包含由一些氨基酸的取代、插入或缺失或其类似情况所产生的突变，但具有使D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化活性的片段。在本发明的一个实施例中，GRAS菌株可为棒状杆菌属菌株。棒状杆菌属菌株是一种制备在动物饲料、药物以及食品领域等中具有各种用途的化学物质的工业用微生物，所述化学物质包含L-赖氨酸、L-苏氨酸以及各种核酸。所述棒状杆菌属菌株是GRAS (公认安全)菌株，并且具有容易进行基因操作以及大规模培养的性质。此外，棒状杆菌属菌株在各种处理条件下具有高稳定性，与其它细菌相比具有相对硬质的细胞壁结构，从而具有甚至在由高糖浓度引起的高渗透压等下也存在呈稳定状态的细胞团(cell mass)的生物性质。
在本发明的一个实施例中，棒状杆菌属菌株可为谷氨酸棒状杆菌。在本发明的一个实施例中，表达来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶的GRAS菌株可为重组菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM 11046P。阿洛酮糖-差向异构酶可容易地通过所属领域的技术人员通常已知的突变诱发(mutagenesis)(诸如定向进化(directed evolution)以及点突变(site-directedmutagenesis)等)来进行修饰。因此,应解释为，与由SEQ ID NO :I表示的阿洛酮糖-差向异构酶的氨基酸序列具有一定程度的序列同源性(sequence homology)(诸如70%或高于70 %、优选80 %或高于80 %、更优选90 %或高于90 %的序列同源性)并且在GRAS菌株中以活性形式(active form)表达的重组酶，以及包括所述重组酶的宿主细胞都在本发明的范围内。表达来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶的GRAS菌株的培养物可通过在 培养基中且在培养条件下培养经过转化的细菌来获得，所述培养条件容易由本发明所属领域的技术人员根据菌株性质加以选择。培养方法可包含所属领域的技术人员已知的任何培养方法，诸如分批培养(batch culture)、连续培养(continuous culture)以及分批补料式培养(fed-batch culture),但不限于此。根据本发明的一个实施例制备D-阿洛酮糖的方法可包括从表达来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶的GRAS菌株的培养物分离阿洛酮糖-差向异构酶的步骤。在本发明的一个实施例中，通过离心、过滤等从表达来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶的菌株的培养物分离的细胞；或通过使分离的细胞均质化(homogenize)并离心所获得的上清液；或通过分级分离(fractionation)、层析(chromatography)等从所述上清液分离并纯化的阿洛酮糖-差向异构酶可用作用于使D-果糖转化为D-阿洛酮糖的酶。在本发明的一个实施例中，阿洛酮糖-差向异构酶可呈在培养物中的细胞团的形式或从所述细胞团分离的阿洛酮糖-差向异构酶的形式。在本发明的一个实施例中，制备D-阿洛酮糖的步骤可还包括将阿洛酮糖-差向异构酶或表达阿洛酮糖-差向异构酶的细胞团固定于载体上的步骤。因为在将酶或细胞团固定于载体上的情况下，可提供用于长时间维持活性的环境，所以所述固定化已用于使用酶或微生物的工业生产方法中。可用于固定化的载体可包含海藻酸盐，诸如海藻酸钠，但不限于此。在本发明的一个实施例中，固定化可通过使用海藻酸钠作为载体来进行。海藻酸钠是一种天然胶态多糖，其在藻类的细胞壁中大量存在，由-D-甘露糖醛酸(-D-mannuronic acid)以及-L-古洛糖醒酸(_L-guluronic acid)组成,并且通过一定含量的随机_1，4连接而形成，因此，对于将细胞团或酶稳定地固定于其上是有利的。在本发明的一个实施例中，固定化可通过使用I. 5%到4. 0%海藻酸钠作为载体来进行。在本发明的一个实施例中，固定化可通过使用2%海藻酸钠作为载体来进行。在本发明的一个实施例中，通过使用海藻酸钠作为用于固定化的载体，所述固定化可通过将I到2倍体积的海藻酸钠水溶液添加到含有酶或细胞团的样品中，使用注射泵以及真空泵将所得混合物滴入0. I摩尔浓度钙离子溶液中，以在珠粒中形成酶或细胞团-海藻酸盐复合物来进行。在本发明的一个实施例中，将阿洛酮糖-差向异构酶固定于载体上的步骤可还包括用固定的酶填充管柱，并向所述填充管柱供应D-果糖溶液的步骤。待用其上固定有酶或细胞团的载体填充的管柱、以及用所述载体填充所述管柱的方法可适当地且容易由本发明所属领域的技术人员根据所用的酶或细胞团、或用于固定化的载体进行选择。在本发明的一个实施例中，有可能通过用固定酶填充管柱来制备填充床管柱。酶促反应(即，D-果糖转化为D-阿洛酮糖)可通过向填充床管柱供应作为其底物的D-果糖溶液来进行。在本发明的一个实施例中，当向填充有包含阿洛酮糖-差向异构酶的细胞团的填充床管柱供应恒定浓度的D-果糖溶液时，差向异构化反应通过固定的细胞团进行，从而导致D-果糖转化为D-阿洛酮糖。通过使用分离管柱进行分离并纯化，然后可以纯D-阿洛酮 糖的形式获得转化的D-阿洛酮糖。如本文中所使用，术语“固定化反应器”的意思是其中通过固定于载体上的细胞团或酶进行制备D-阿洛酮糖的反应的反应器，或填充有固定于载体上的细胞团或酶的管柱。即，固定化的意思是将提供生物活性的物质，在这种情况下是将阿洛酮糖-差向异构酶或D-葡萄糖差向异构酶或包含其的细胞团固定于载体上。如本文中所使用，术语“操作稳定性”的意思是可操作用于连续制备目标产物(诸如D-阿洛酮糖)的生物反应器，同时与其初始活性相比维持合适的生产力水平，且一般由操作期(operation period)表不。在本发明的一个实施例中，在50°C下向填充有其上固定有表达阿洛酮糖-差向异构酶的细胞的载体的管柱以O. I分钟/毫升的流入速率供应300克/升D-果糖，这使得有可能确保25天或25天以上的操作稳定性。本发明更提供一种由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法，其包括将阿洛酮糖-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶固定于载体上的步骤。如上文所述，因为用作阿洛酮糖-差向异构酶的底物的D-果糖较昂贵，所以需要由廉价的底物(诸如D-葡萄糖)制备D-阿洛酮糖以用于D-阿洛酮糖的工业大规模生产。D-葡萄糖异构酶是使D-葡萄糖转化为D-果糖的酶，且因此，可通过使D-葡萄糖转化为D-果糖来提供阿洛酮糖-差向异构酶的底物。因此，有可能通过使用这两种酶由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖。在本发明的一个实施例中，阿洛酮糖-差向异构酶可为表达来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶的GRAS菌株的培养物，或从所述培养物分离的细胞团或阿洛酮糖-差向异构酶。在本发明的一个实施例中，D-葡萄糖异构酶可为表达D-葡萄糖异构酶的GRAS菌株的培养物，或从所述培养物分离的细胞团或D-葡萄糖异构酶。在本发明的一个实施例中，阿洛酮糖-差向异构酶可具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列。在本发明的一个实施例中，D-葡萄糖异构酶可购得。举例来说，可使用购自诺维信公司(Novozymes A/S)(丹麦鲍斯韦(Bagsvaerd, Denmark))的D-葡萄糖异构酶或固定D-葡萄糖异构酶。D-葡萄糖异构酶是一种使D-葡萄糖转化为D-果糖的代表性酶，并且当前用于制备果寡糖(fructo-oligosaccharides)。在当前用于工业生产的酶中，D-葡萄糖异构酶是活性以及机制已得到清楚鉴别的酶之一。
在本发明的一个实施例中，GRAS菌株可为经过包含编码阿洛酮糖-差向异构酶的基因以及编码D-葡萄糖异构酶的基因的重组载体转化的菌株，或经过包含上述基因每一个的重组载体共转化(co-transform)的菌株。在本发明的一个实施例中，GRAS菌株可为棒状杆菌属细菌。在本发明的一个实施例中，表达来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶的GRAS菌株可为重组菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM 11046P。在本发明的一个实施例中，用于固定化的载体可为海藻酸钠。在本发明的一个实施例中，固定化可通过使用I. 5%到4. 0%海藻酸钠作为载体来进行。在本发明的一个实施例中，固定化可通过使用2%海藻酸钠作为载体来进行。在本发明的一个实施例中，通过使用海藻酸钠作为用于固定化的载体，所述固定化可通过将I到2倍体积的海藻酸钠水溶液添加到含有酶或细胞团的样品中，使用注射泵以及真空泵将所得混合物滴入0. I摩尔浓度的钙离子溶液中而以在珠粒中形成酶或细胞团-海藻酸盐复合物来进行。在本发明的一个实施例中，编码阿洛酮糖-差向异构酶的基因以及编码D-葡萄糖异构酶的基因可在相同的GRAS菌株中表达或分别在不同的两种GRAS菌株中表达，并且固定化步骤可通过将所培养GRAS菌株的细胞或从所述细胞分离的两种酶的混合物固定于载体上来进行。在本发明的一个实施例中，可分别将表达阿洛酮糖-差向异构酶的GRAS菌株的培养物或从培养物分离的细胞团块或阿洛酮糖-差向异构酶，以及D-葡萄糖异构酶固定于载体上。在本发明的一个实施例中，本发明的方法可还包括用其上固定有细胞或酶的载体填充管柱的步骤。根据本发明由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法可还包括用固定的阿洛酮糖-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶填充管柱，并向所述填充的管柱供应D-葡萄糖溶液的步骤。
在本发明的一个实施例中，填充床管柱可通过用固定酶填充管柱来制备。酶促反应(即D-葡萄糖转化为D-阿洛酮糖)可通过向填充床管柱供应作为其底物的D-葡萄糖溶液来进行。在本发明的一个实施例中，固定的阿洛酮糖-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶可分别填充于各别管柱中。待用其上固定有酶或细胞的载体填充的管柱以及用所述载体填充所述管柱的方法可适当地且容易地由本发明所属领域的技术人员根据所用的酶或细胞团或用于固定化的载体进行选择。在本发明的一个实施例中，有可能分别用固定阿洛酮糖-差向异构酶的载体以及固定D-葡萄糖异构酶的载体填充两个各别管柱，彼此连通而连接这两个管柱，以将D-果糖作为异构化产物而从填充有D-葡萄糖异构酶的管柱转移到填充有阿洛酮糖-差向异构酶的管柱，并诱导D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化反应。当向由所述两个连通的管柱组成的固定化反应器供应作为底物的D-葡萄糖溶液时，D-葡萄糖在填充有D-葡萄糖异构酶的管柱中转化为D-果糖，并且转移到填充有阿洛酮糖-差向异构酶的管柱的D-果糖转化为D-阿洛酮糖。因此，有可能由D-葡萄糖获得D-阿洛酮糖而作为最终产物。有利作用根据本发明制备D-阿洛酮糖的方法可由D-葡萄糖或D-果糖大规模且连续地制备可用作食品材料的呈食品安全形式的D-阿洛酮糖。
图I示意性说明构筑包含编码来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶的基因的重组表达载体pCJ-1-ATPE的方法。图2说明对于根据本发明的一个实施例的方法，通过HPLC测量来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶的活性的结果，其中图2a显示各糖的参考标准(referencestandard),且图2b显示通过反应进行的转化。图3说明对于根据本发明的一个实施例的方法，通过使用重组菌株在100克/升(3a)、300克/升(3b)或500克/升(3c)的D-果糖与40°C、45°C或50°C反应温度的组合条件下得到的D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化％。图4说明对于根据本发明的一个实施例的方法，取决于作为底物的D-果糖的流入速率的D-阿洛酮糖的生产力。图5说明对于根据本发明的一个实施例的方法，在50°C的反应温度下固定化反应器的操作稳定性。相对活性)的意思是相对于操作起始时的活性的活性。图6说明对于根据本发明的一个实施例的方法，通过使用表达阿洛酮糖-差向异构酶的固定重组菌株以及固定D-葡萄糖异构酶在100克/升(6a)、300克/升(6b)或500克/升(6c) D-葡萄糖与40°C、45°C或50°C反应温度的组合条件下得到的D-葡萄糖转化为D-阿洛酮糖的转化％。图7说明对于根据本发明的一个实施例的方法，取决于D-葡萄糖的流入速率的D-阿洛酮糖的生产力。
具体实施例方式下文通过以下特定实例更详细地说明本发明。然而，这些实例是用于说明并且本发明的范围不限于所述实例。阿洛酮糖-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶活性的测量阿洛酮糖-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶的活性是通过分别使用D-果糖以及D-葡萄糖作为底物进行测量。将酶或含有所述酶的样品添加到含有100克/升底物的50毫摩尔浓度的PIPES(哌嗪-N，N'-双(2-乙烷磺酸))缓冲液(pH 8.0)中，随后在50°C下反应I小时，并接着通过在100°C下加热反应5分钟来终止反应。通过装备有折射率(Refractive Index ；RI)检测器的HPLC测量D-果糖、D-葡萄糖以及D-阿洛酮糖的浓度。通过将样品注射到设定为80°C的Supelcogel Pb (商品名)管柱中，并接着使蒸懼水作为移动相以O. 5毫升/分钟的速率通过所述管柱来进行HPLC分析。在约32分钟的滞留时间分离出D-阿洛酮糖，且基于D-阿洛酮糖参考标准定量的量来计算其转化％以及生产力。对于酶活性的比较分析，将酶的一个单位定义为在PH 8.0以及50°C下每分钟产生I摩尔的D-阿洛酮糖的酶的量。实例I :表达阿洛酮糖-差向异构酶的重组菌株(I)重组菌株的制备通过使用根癌农杆菌ATCC 33970的基因组DNA作为模板并分别引入了 PstI以及XbaI限制酶识别位点的SEQ ID NO 9以及SEQ ID NO 10的寡核苷酸作为引物来进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction ;PCR),以扩增编码阿洛酮糖-差向异构酶的基因。PCR条件如下在95°C下变性30秒后，26个循环由在95°C下30秒、在55°C下30秒以及在68°C下I分钟组成，接着在68°C下延伸10分钟。对于由扩增基因编码的阿洛酮糖-差向异 构酶的大规模表达，用限制酶PstI以及XbaI消化扩增的PCR产物，并插入来源于棒状杆菌属细菌(在2004年11月6日以保藏编号KCCM-10611保藏于韩国菌种保藏中心(KoreanCulture Center of Microorganisms ;KCCM),其为国际保藏机构)的穿梭载体(shuttlevector) pCJ-1中，以构筑重组表达载体pCJ_l_ATPE。图I示意性显示制备包含编码来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶的基因的重组表达载体pCJ-1-ATPE的方法。通过使用电穿孔进行转化将重组表达载体pCJ-1-ATPE引入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中，以制备表达编码来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶的基因的重组菌株。所述重组菌株被定名为谷氨酸棒状杆菌ATPE,且根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)而在2009年10月26日以保藏编号KCCM11046P保藏于韩国菌种保藏中心(KCCM，韩国首尔西大门区弘济 I 洞(Hongje-l-dong, Seodaemum-gu, Seoul, Korea))。(2)阿洛酮糖-差向异构酶的表达在0D600 = 0. I的初始浓度下分别对包含10微克/毫升卡那霉素(kanamycin)的MB培养基(巴克托-胰蛋白胨(Bacto-tryptonUO克/升、巴克托-酵母提取物(Bacto-yeast extract) 5克/升、NaCl 5克/升、大豆胨(Soytone) 5克/升)接种由上述(I)中所获得的重组菌株，随后在30°C下培育24小时，以诱导重组阿洛酮糖-差向异构酶的表达。在0D600 = 0.6下对含有3升改良培养基(D-葡萄糖80克/升、大豆胨20克/升、(NH4)2SO4 10克/升、KH2PO4 I. 2克/升、MgSO4 I. 4克/升)并包含10微克/毫升卡那霉素的5升摇瓶发酵罐接种以由上述获得的培养物，随后在30°C下培育20小时。为了测量所表达的阿洛酮糖-差向异构酶的活性，在8000 X g下对培养物进行离心10分钟以收集细胞。接着将所收集的细胞再悬浮于50毫摩尔浓度EPPS的缓冲液(pH 8.0)中(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))并且对所得悬浮液进行超声波处理，导致细胞裂解(lysis)。对细胞裂解产物进行离心以获得含有阿洛酮糖-差向异构酶的上清液，并且通过使用所述上清液作为酶进行D-果糖的差向异构化反应。在差向异构化反应中使用如上文所述测量阿洛酮糖-差向异构酶的活性。图2b示出差向异构化反应的HPLC分析结果。实例2 :重组菌株的固定化以及D-阿洛酮糖的制备(I)重组菌株的固定化对于D-阿洛酮糖的大规模生产，在这一实例中将表达来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶且在以上实例I中制备的谷氨酸棒状杆菌ATPE(KCCM 11046P)固定于载体上。对于重组菌株的固定化，首先在0D600 = 0.6的初始浓度下对实例I中所用的用于棒状杆菌属的改良培养基接种重组菌株，随后在30°C下培育20小时。培育完成后，对所得培养物进行离心以回收细胞，将其于50毫摩尔浓度的EPPS缓冲液(pH 8.0)中再悬浮至20%。将再悬浮的重组菌株细胞添加到2% (v/v)海藻酸钠水溶液中。通过使用注射泵以及真空泵将所得混合物滴入100毫摩尔浓度的CaCl2溶液中，以形成细胞-海藻酸盐复合物，其中细胞被截留于海藻酸钠珠粒中。(2)通过使用固定重组菌株制备D-阿洛酮糖用上述(I)中的固定于海藻酸钠上的重组菌株来填充XK16填充床管柱(16毫米X 20毫米,安玛西亚公司(Amersham pharmacia)),随后测量D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化包％ (% conversion pack)。为了确定固定化反应器的最佳反应温度以及D-果糖的底物浓度，在40°C、45°C以及50°C的反应温度与100克/升、300克/升以及500克/升D-果糖浓度的组合条件下进行D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化反应。根据图3a到图3c，发现在50°C的温度以及100克/升D-果糖浓度下达成最佳转化，并且300克/升以及500克/升D-果糖浓度也产生高转化率。此外，不同于其它D-葡萄糖转化反应，D-阿洛酮 糖的差向异构化反应对温度显示出低依赖性(low dependency)。(2-1)取决于D-果糖的流入速率的生产力用如上文所述的固定重组菌株来填充XK16填充床管柱，随后测量取决于D-果糖的流入速率的D-阿洛酮糖的生产力。此时，基于上述(2)的结果，分别将D-果糖的浓度以及反应温度设定为300克/升以及50°C。通过将D-果糖(底物)的流入速率调整为O. 4、1、2、4以及8小时―1的空间速度(I/小时)来测量生产力。结果展示于下表I以及图4中。表I[表 I][表]取决于D-果糖的流入速率的生产力以及转化％
I 流入速率 ^D-果糖^ D-阿洛酮糖生产力 ^转化率^I
(毫升/分钟) (克/井) (克/升) (克/升/小时) (％)
3^281.388 — 3.693331.30
2289.215 — 3.309201.13
I^291.268 — 7.579 — 232.54
0.5............................................. 284.639—— 12.055184.06
0.25286.463 — 20.579 — 156.70
1..........................................................................................0.1260.096 38.041I!12.76 I(2-2)操作稳定性在50°C下分别通过使用填充于XK16填充床管柱中的固定重组菌株进行操作直到其比活性(specific activity)变成50%，以测量填充入管柱中的固定重组菌株的操作稳定性。此时，D-果糖的底物浓度是300克/升且其流入速率是O. I分钟/毫升(空间速度是O. 4小时―1)。发现在这些反应条件下可维持25天或长于25天的操作稳定性。图5显示在50°C的反应温度下固定重组菌株的操作稳定性。实例3 :通过使用固定的重组菌株/酶而由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖
(I)取决于反应温度以及D-葡萄糖浓度的生产力分别用以上实例2中固定于海藻酸钠上的重组菌株以及10克固定的D-葡萄糖异构酶(丹麦诺维信公司)来填充XK16填充床管柱(16毫米X 20毫米，安玛西亚公司)，随后测量D-葡萄糖转化为D-阿洛酮糖的转化％。为了确定用于两种混合酶的最佳反应条件，在40°C、45°C或50°C的反应温度与100克/升、300克/升或500克/升的D-葡萄糖浓度的组合条件下进行D-葡萄糖转化为D-阿洛酮糖的转化反应。图6显示D-葡萄糖转化为D-阿洛酮糖的转化％，其取决于反应温度以及底物浓度的变化。根据图6a到图6c，不同于D-阿洛酮糖的差向异构化反应，D-葡萄糖的异构化反应是温度依赖性反应(temperature-dependent reaction)。S卩，反应温度越高,D-葡萄糖转化为D-阿洛酮糖的转化速率越快。发现这最终对D-阿洛酮糖的生产力具有影响。在50°C的温度下达成D-葡萄糖转化为D-果糖的最佳转化率，并且当底物浓度增加到较高时，反应速率不存在显著差异。这些结果证明有可能在较高底物浓度条件下操作固定化反应器，并且增加从D-葡萄糖到D-阿洛酮糖的生产力。
(2)取决于D-葡萄糖的流入速率的生产力分别用包含阿洛酮糖-差向异构酶的固定重组菌株以及固定的D-葡萄糖异构酶填充两个填充床管柱，并且测量取决于D-葡萄糖的流入速率的D-阿洛酮糖的生产力。基于以上实例的结果，分别将D-葡萄糖的浓度以及反应温度设定为300克/升以及50°C。通过将D-果糖(底物)的流入速率调整为0.4、1、2、4以及8小时―1空间速度(I/小时)来测量生产力。结果展示于下表2以及图7中。表2[表2][表]取决于D-葡萄糖的流入速率的生产力以及转化％
I 流入速 D-葡萄糖^D-果糖^ 生产力 ^转化率 II (毫升/分钟) (克/升) (克/升) (克/升/小时) (％) II4281.465 31.1363749,96 I
3278.849 ~40.042360 — 12.56
2^67.061 50.196301 — 15.82
I138.615 78.854237 — 24.84
0.5........................................................................................^Τθ7.168 ^113.081 — 17035.31 |
1............................................0:1172.826 155.85047———47:42■■■■■■——■I
权利要求
1.一种由D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法，其通过使用来源于根癌农杆菌并且在GRAS (公认安全)菌株中表达的阿洛酮糖-差向异构酶，其包括下述步骤 在所述GRAS菌株中表达来源于根癌农杆菌的所述阿洛酮糖-差向异构酶；以及 通过使用所表达的所述阿洛酮糖-差向异构酶而由D-果糖制备D-阿洛酮糖。
2.根据权利要求I所述由D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，用于制备D-阿洛酮糖的所述阿洛酮糖-差向异构酶是包含于所述GRAS菌株的培养物中或是从所述培养物分离。
3.根据权利要求I所述由D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述GRAS菌株是棒状杆菌属。
4.根据权利要求3所述由D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述GRAS菌株是谷氨酸棒状杆菌KCCM 11046P。
5.根据权利要求I到4中任一权利要求所述由D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，来源于根癌农杆菌的所述阿洛酮糖-差向异构酶具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列。
6.根据权利要求I到4中任一权利要求所述由D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，制备D-阿洛酮糖的所述步骤包括将所述阿洛酮糖-差向异构酶固定于载体上的步骤。
7.根据权利要求6所述由D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述载体是海藻酸钠。
8.根据权利要求6所述由D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述方法还包括用其上固定有所述阿洛酮糖-差向异构酶的所述载体来填充管柱，并且向所填充的所述管柱供应D-果糖溶液的步骤。
9.一种由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法，其包括将阿洛酮糖-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶固定于载体上的步骤。
10.根据权利要求9所述由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述阿洛酮糖-差向异构酶是包含于表达来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖-差向异构酶的GRAS菌株的培养物中或是从所述培养物分离。
11.根据权利要求10所述由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述GRAS菌株是经过包含编码阿洛酮糖-差向异构酶的基因的重组载体转化的菌株。
12.根据权利要求10所述由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述GRAS菌株是棒状杆菌属。
13.根据权利要求12所述由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述GRAS菌株是谷氨酸棒状杆菌KCCM 11046P。
14.根据权利要求10到13中任一权利要求所述由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，来源于根癌农杆菌的所述阿洛酮糖-差向异构酶具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列。
15.根据权利要求9所述由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述载体是海藻酸钠。
16.根据权利要求9到13中任一权利要求所述由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述方法还包括用其上固定有所述阿洛酮糖-差向异构酶以及所述D-葡萄糖异构酶的所述载体来填充管柱，并且向经过所述载体填充的所述管柱供应D-果糖溶液的步骤。
17.根据权利要求16所述由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，将其上固定有所述阿洛酮糖-差向异构酶以及所述D-葡萄糖异构酶的所述载体各自分别填充于各别管柱中，并且使所述两个管柱彼此连通连接。
18.一种谷氨酸棒状杆菌KCCM 11046P菌株，其适用于由D-果糖或D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖。
全文摘要
本发明涉及一种通过使用来源于根癌农杆菌且以食品安全形式表达的阿洛酮糖-差向异构酶而连续地由D-果糖或D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法。
文档编号C12R1/15GK102869783SQ201080044027
公开日2013年1月9日 申请日期2010年9月1日 优先权日2009年9月30日
发明者洪暎镐, 金镇夏, 金成俌, 金政勋, 李英美, 朴承源 申请人:Cj第一制糖株式会社