专利名称：全细胞生物催化剂的制作方法
全细胞生物催化剂
发明内容
本发明涉及一种制备腈水解酶催化反应产物的方法，包括步骤(i)提供表面含所述腈水解酶的微生物和/或所述微生物的膜制剂；和(ii)在与腈水解酶活性相容的条件下使所述微生物和/或其膜制剂接触一种或多种腈水解酶的底物。具体而言，本发明涉及一种制备羧酸的方法，包括步骤(i)提供表面含腈水解酶的微生物和/或其膜制剂；(ii)使该微生物和/或其膜制剂接触腈，如此腈水解酶可催化腈转变为羧酸。本发明还涉及采用展示腈水解酶的全细胞生物催化剂或其膜制剂处理外消旋扁桃腈制备光学纯(R)-扁桃酸的方法。腈是制备羧酸、酰胺等多种产物的重要前体分子(Banerjee等人，2002年)。然而，由于腈非常稳定，必须在强碱或强酸及高温下才能使腈发生化学转变(Banerjee等人，2002年；Nagasawa等人，1990年)。而且，提纯各自反应混合物中的这些产物非常令人厌烦。 腈水解酶(如EC 3. 5. 5. I)是能在一步反应中将腈转变为相应羧酸和氨的酶(Thimann和Mahadevan，1964年)。因为一方面，羧酸产物常用作各种化学生产过程的中间体，采用腈水解酶的工业效益具有实质性吸引力；另一方面，可利用腈水解酶给废物解毒(Banerjee等人,2002年；Thuku等人,2009年)。此外,腈水解酶的选择性高,能在温和条件下产生光学纯羧酸，而不需要常规化学过程中所需的高成本封闭和去封闭步骤和催化剂(Banerjee等人,2002年)。所述高度选择性使采用常规方法不能或很难实现的产物合成成为可能。腈水解酶与量化有关的最重要工业应用是将外消旋扁桃腈转变为光学纯(R)-扁桃酸(Rey等人，2004年)。利用(R)-扁桃酸可分离用非对映异构体盐(产生的)外消旋物中的对映体。此外，(R)-扁桃酸是化学合成新型活性制剂中的一种重要手性中间体产物。从文献中可熟知，粪产碱杆菌(A. faecalis)的腈水解酶能以高对映选择性将扁桃腈转变为扁桃酸。手性羧酸，如扁桃酸提供了有机化学所需的化合物，因为其可作为多种药物制剂或植物保护剂的基础产物。因此，例如，(R)-或(S)-扁桃酸可用于外消旋胺的外消旋体拆分。此外，可利用(R)-扁桃酸作为化学合成的中间体。然而，已特征鉴定了腈水解酶是公认的不稳定酶(Buchholz、Kasche和Bornscheuer, 2005年)，因此在工业中罕见采用其纯化酶或采用其全细胞制剂。腈水解酶的活性中心含三个氨基酸残基(催化三联体)的催化序列，其所含的保守性活性位点半胱氨酸残基(Kobayashi等人，1992年)对自身氧化敏感，易与许多化学物质如含巯基试剂反应(Kobayashi 等人，1992 年)。只要位于细胞内，腈水解酶就受到细菌细胞质氧化还原环境的保护，处于还原状态(Choi和Lee，2004年)而防止其巯基氧化。然而，已证明腈水解酶接触氧时即丧失活性，此观察归因于其活性中心氧化还原敏感三联体中的半胱氨酸的易感性(Mateo等人，2006年)。已采用了几种方法来克服腈水解酶活性和/或稳定性不足的缺点。
一种方法是采用表达腈水解酶的全细胞而不是纯化的酶制剂，提供菌株特异性或重组形式的胞内腈水解酶(Kaul等人，2007年)。例如，研究人员采用了表达腈水解酶的粪产碱杆菌(Kaul, A. Banerjee和U. C. Banerjee, 2006年)作为含腈水解酶的全细胞催化齐U。对映体过量达到了 97%。此法的原理是将该酶保持在其自然环境细菌的细胞质中，通过其内源性折叠机制和连续转换及蛋白质生物合成，保持该蛋白质稳定性和活性水平的恒定。然而，这必须采用费时费力的加工过程制备全细胞催化剂，并将其附着于合适的基质系统(藻酸盐)。另外，待转换的底物需要穿越所选细菌的细胞膜和表面，进入胞质后，将遭遇一系列具有替代活性的酶和竞争性底物。最后，全细胞催化剂将会污染制备的所需产品，因此对于敏感的应用，例如制药、化妆品、卫生用品及饮料和食物制品，不能采用这种产物。另一种制备可工业应用的高水平功能性腈水解酶的方法涉及采用伴侣蛋白。GroEL家族伴侣蛋白是位于胞质中的必需蛋白质，为细胞通过多轮底物蛋白的ATP依赖性结合、包裹及释放、产生正确折叠的蛋白质所必需(Hartl, F. U.和Hayer-Hartl, M. , 2002年)。删除GroEL最终不仅导致功能性底物蛋白水平降低，而且由于大量未折叠蛋白的积聚，可导致细菌细胞死亡。已实现了伴侣蛋白，更具体说是GroEL系统的多种特异性组分与 重组的腈水解酶在大肠杆菌胞质中共表达(5，629，190号美国专利，图9)。此方法产生的可溶性蛋白质水平高于细胞的内源性伴侣蛋白水平。然而，这种方法的前提条件是采用全细胞以提供折叠机制，或增加分离纯化的伴侣蛋白及其辅因子，和增加腈水解酶制剂的底物。美国专利No. 5，629，190说明了重组表达腈水解酶的大肠杆菌全细胞的使用方法。然而，由于大肠杆菌细胞含有特定的胞内酶装置，所产生的反应很复杂，其结果无法预计，即使是重组表达的蛋白制剂，如GroEL，能否有助于微生物合成的多肽(例如重组表达的腈水解酶)折叠也无法预计。如美国专利No. 5，629，190所揭示的那样，腈水解酶催化腈转变为羧酸(的反应)与腈水合酶催化反应(导致酰胺的形成)相竞争，致使产率降低，并产生很难去除的不良副产物。细胞中还存在可能修饰腈的腈基或其他部分的其他酶。另一种方法涉及交联酶聚集体的制备和应用，即制备可溶性重组酶和采用反应活性双功能化学试剂，如戊二醛或聚(乙烯亚胺)，作后续交联。然而，Kaul等人(2007)证明，这种固定可导致显著降低反应速率和专一性常数。此外，化学交联可导致对底物的特异性改变，观察到这与产生的蛋白质分子被“锁定”于特定构象的交联过程相关。而且，不能直接分离得到所需反应产物中的各批固定酶及其降解产物和碎片。Yamamoto等人(1991年)测试了各种分离物(野生型菌株)转化扁桃腈成为(R) - (_)-扁桃酸的能力。发现粪产碱杆菌ATCC 8750菌株从外消旋扁桃腈产生(R) _ _扁桃酸的活性和对映选择性水平最高(Yamamoto等人，1991年)。具体而言，静息细胞使扁桃腈产生(R)-(-)-扁桃酸的对映体过量达100%。粪产碱杆菌ATCC 8750含有R型对映选择性腈水解酶和酰胺酶，分别用于加工扁桃腈和扁桃酰胺。由于从外消旋扁桃腈产生(R)_ _扁桃酸的广率为91 ,而未留下(S)-扁桃臆，因此反应中剩余的(S)-(-)-扁桃腈自发性外消旋，一方面是因为扁桃腈的(R)-和(S)-异构体达到了化学平衡，另一方面是因为苯甲醛/氢氰酸(HCN)的作用。因此，几乎所有的扁桃腈被消耗和转变成(R)-(-)_扁桃酸。需要注意的是，按照Yamamoto等人(1991年)所述，用于制备(R)-扁桃酸的粪产碱杆菌细胞需要专门优化的培养条件。有人克隆了细菌来源的不同腈水解酶，并在大肠杆菌中重组表达(Kiziak等人，2005年；Luo等人，2008年；Rustler等人，2008年；6，180, 359号美国专利；Ress-L6schke等人，1998年)。业已对腈水解酶进行了生化特征鉴定(Kiziak等人,2005年)。也能在大肠杆菌中重组表达粪产碱杆菌ATCC8750的腈水解酶基因，纯化后在固定实验中用作“交联酶聚集体”(Rey等人，2004年)。此法必须分离宿主生物(即大肠杆菌)中的腈水解酶并进行纯化。此法相当冗长使人厌烦，而且在加工过程中腈水解酶可能失活。已将粪产碱杆菌亚组ATCC 8750的腈水解酶描述为由大约14个亚基(每个亚基分子量为32kD)组成的同质寡聚酶，因此该天然蛋白质的总合并分子量大约为460kD (Yamamoto等人，1992年)。腈水解酶一般是无活性的二聚体,通过自身缔合形成活性寡聚体。然而，腈水解酶与腈水解酶之间活性所需要的亚基数目不相同(Thuku等人，2009年)。总之，腈水解酶具有以下几个缺点，阻碍了其在制备有机化合物中的应用 腈水解酶对氧化敏感，导致其活性随时间推移而降低。
以全细胞生物催化剂形式应用时，细胞中存在的其他酶(如腈水合酶)催化的不良副反应可能干扰腈水解酶催化的反应。 不能回收反应混合物中的腈水解酶。自身展示(技术)为在细菌表面展示重组蛋白质提供了一种巧妙的工具，这种表达系统依据于属于V型分泌系统的自身转运蛋白质家族的分泌机制。在革兰阴性菌中，自身转运蛋白通路已演变为蛋白转运到细胞表面和蛋白分泌到胞外微环境中两种通路(Jose和Meyer, 2007年)。合成的自身转运蛋白是前体蛋白质,含有转运到细胞表面所需的所有结构(JOSe，2006年)。合成的该前体蛋白的N-末端为信号肽(一般用于分泌途径)能穿越内膜。一旦进入周质中信号肽被截断后，该前体蛋白的C-末端部分就折叠入外膜中形成膜孔样蛋白结构(即所谓的￠-桶结构)。附着于N-末端的乘客结构域可通过这种膜孔转位至表面(JOSe，2002年)，经蛋白酶自身水解作用或其他蛋白酶的水解作用被切断，或者通过其转运结构域维持锚定于细胞被膜上。用重组蛋白取代该天然乘客蛋白可导致重组蛋白的正确表面转位。为此目的，必须用遗传工程构建含有信号肽、重组乘客蛋白、￠-桶结构和之间连接区的人工前体蛋白，这是实现完全的表面接近所需。已经以此方式成功利用AIDA-I自身转运蛋白有效地表面展示了各种乘客蛋白结构域(Henderson 等人，2004 年)。在这种自身展示系统中已观察到，例如二聚体酶一山梨醇脱氢酶的二个亚基可自身缔合形成活性酶(Jose, 2002年;Jose和von Schwichow, 2004年)。具体而言，这种自身展示技术是在大肠杆菌和其他革兰阴性菌外膜表面表达预定蛋白质的一种方法，其中这种自身展示系统依据于自身转运蛋白的天然分泌机制(Jose和Meyer, 2007年)。在此方法中，可采用基因工程的标准方法简单地在信号肽与自身展示载体转位结构域之间，框内引入重组乘客蛋白的编码序列，就可转运该重组乘客蛋白。可获得霍乱毒素B亚基(CTB)的信号肽将其与人工启动子组合。因此，可将需要转位通过外膜的乘客蛋白表达为与称为大肠杆菌外膜自身转运蛋白的另一蛋白的重组融合蛋白质(AIDA-I) (Jose, 2006年)。该自身转运蛋白的C-末端部分可在大肠杆菌外膜内形成膜孔蛋白样(￠-桶)结构。这种膜孔蛋白样结构促进了重组乘客蛋白转位到大肠杆菌的外膜表面(Jose, 1995 年、2006 年、2007 年)。
本发明要解决的问题是提供产生和制备易于接近底物分子处于活化状态的腈水解酶的方法。而且，为防止不良副反应，应避免存在其他酶。本发明要解决的另一个问题是提供用重组腈水解酶制备腈水解酶催化反应产物(如羧酸)的方法，其中至少部分解决了酶活性随时间推移而降低的问题。本发明的另一个要解决的问题是提供易于回收腈水解酶催化反应产物(如羧酸)的方法。本发明人令人意外地发现，能在宿主细胞(如微生物)表面表达腈水解酶，这种腈水解酶功能完备，即能催化腈转变形成羧酸。本发明的第一方面是制备腈水解酶催化反应产物的方法，包括以下步骤(i)提供表面含有所述腈水解酶的微生物和/或所述微生物的膜制剂，(ii)在与腈水解酶活性相容的条件下使所述微生物和/或其膜制剂接触一种或 多种腈水解酶的底物。本发明的方法中，可采用腈水解酶的任何已知底物。所述产物可以是腈水解酶催化反应产生的任何化合物。本说明书所用的“与腈水解酶活性相容的条件”包括使腈水解酶处于活化状态，即腈水解酶能够将一种或多种底物转变为产物的条件。可以采用使腈水解酶保持活性的任何已知条件。本发明方法所采用的一种或一种以上腈水解酶的底物优选腈。也优选本发明方法所获得的产物为羧酸。“与腈水解酶活性相容的条件”是腈水解酶催化腈转变形成羧酸的条件。本发明的一个优选实施方式是产生羧酸的方法，该方法包括以下步骤(i)提供表面含有腈水解酶的微生物和/或其膜制剂；(ii)使所述微生物和/或其膜制剂接触腈，从而使腈水解酶催化腈转变形成羧酸。本发明方法任选地还包括步骤(iii):回收步骤(ii)所用的微生物。本说明书所用的“步骤⑴”、“步骤(ii) ”或“步骤(iii) ”指制备腈水解酶催化反应产物方法的相应步骤，以及如本说明书所述制备羧酸的优选方法的相应步骤。本发明的根据是意外地发现以重组方式将细菌的腈水解酶融合于合适的自身转运蛋白系统时，该酶可转位到细菌细胞的表面，并以活性折叠构象整合入细菌的细胞膜中，如此能保持其催化活性好几天，从而可用于催化相关的工业反应。这特别令人感到惊讶，因为细菌细胞的外膜缺乏适合胞质蛋白的蛋白折叠机制。而且，最令人感到惊讶的是，本发明人发现这种氧化还原敏感的酶从还原性细菌胞质转移到含氧水平高因而产生高度氧化环境的外膜后或在转移期间，该酶并未失活。不想受任何理论的束缚，本发明人设想腈水解酶通过自身展示固定在细菌细胞的表面后，形成的聚集体或三维结构能保护其催化反应活性氨基酸残基避免失活，甚至当接触作为大量培养细菌细胞常规方法组成部分的高水平氧和伴有剧烈振动的强机械作用力时也能避免这些氨基酸残基失活。本说明书所述的全细胞生物催化剂第一次使得在革兰阴性细胞如大肠杆菌表面提供活性腈水解酶成为可能，可利用这种细胞转化腈产生相应的羧酸。具体说，本说明书所述的展示腈水解酶的全细胞生物催化剂可用于腈的生物技术转化。至关重要的是，所述反应是在温和条件下完成的，产率良好，不会产生毒性副产物。具体而言，在微生物表面重组表达的腈水解酶能在温和条件下(如约PH 7.0)催化腈转变。本说明书所用的“全细胞生物催化剂”指包含天然催化剂，如蛋白酶(具体为腈水解酶)、能对有机化合物(具体为腈)进行化学转化的全细胞，具体为微生物细胞，其中所述天然催化剂优选位于细胞表面。本发明的催化剂可以是重组表达的催化剂。细菌细胞包含很多由疏水膜互相分隔的小室。革兰阳性菌细胞所含的胞浆膜将胞质限制在细胞内。一层肽聚糖围绕在胞浆膜周围。相反，除胞浆膜外，革兰阴性菌还有另一层称为外膜的膜。本说明书所用的术语“表面”宜指微生物与环境例如液体培养基接触的那层膜。在本发明的一个优选实施方式中，所述表面是革兰阴性菌细胞与液体培养基接触的侧面。本说明书所用的措词“表面展示”与“表面表达”可互换使用，指腈水解酶位于细胞表面。本说明书所用的“微生物”指宿主细胞。本发明的宿主细胞可以是原核微生物或真核微生物，优选原核微生物，更优选细菌细胞，还要优选革兰阴性菌细胞，最优选的微生 物是大肠杆菌细胞。术语“微生物”与“宿主细胞”在本说明书中可互换使用。本说明书所用的“腈水解酶”指能催化腈转变为羧酸和氨的腈水解酶、其催化活性部分、其衍生物或类似物。应注意，本说明书所用的某分子的“衍生物”或“类似物”指该分子的衍生部分或者修饰版本。在本发明中，腈水解酶可以是任何一种腈水解酶，例如，能够催化腈转变形成羧酸的腈水解酶。优选的腈水解酶是EC 3. 5.5.1(也称为“腈的氨基水解酶”)的酶。所述腈水解酶可以仅显示腈水解酶活性。所述腈水解酶也可以是多功能酶，除其他活性外，显示有腈水解酶活性。技术人员知道可提供腈水解酶的一些菌种，包括原核生物和真核生物。例如，本发明所用的腈水解酶可获自包特菌属、克雷伯菌属、曲霉菌属、产碱杆菌属、酵母菌属、伯克菌属、链孢霉菌属、芽殖酵母菌属、德巴利酵母菌属、耶罗威亚酵母菌属、假丝酵母菌属、克鲁维酵母菌属、红球菌属、诺卡菌属和/或根瘤菌属。可提供本发明所用腈水解酶的示范性菌种有支气管炎伯德特菌、肺炎克雷伯菌、黑曲霉菌、粪产碱杆菌、酿酒酵母菌、伯克霍尔德菌、烟曲霉菌、粗糙脉孢菌、耐热芽殖酵母菌、汉逊德巴利酵母菌、耶罗威亚酵母菌、光滑假丝酵母菌、乳酸克鲁维酵母菌、紫红红球菌、诺卡菌、豆科根瘤菌和/或皮诺卡菌。本发明的腈水解酶优选获自产碱杆菌属、克雷伯菌属和/或酵母菌属。更优选的腈水解酶选自粪产碱杆菌、肺炎克雷伯菌及酿酒酵母菌的腈水解酶。粪产碱杆菌可以是粪产碱杆菌的粪亚种。肺炎克雷伯菌可以是肺炎克雷伯菌的肺炎亚种。甚至更优选的腈水解酶是粪产碱杆菌的腈水解酶。本发明的腈水解酶可选自以下一组菌，包括P_887662[GI :33600102,2009/05/01,支气管炎博德特菌 RB50]、AAA25057 [GI : 149175，1993/04/26，肺炎克雷伯菌]、NP_943299 [GI :38639530, 2009/04/30，肺炎克雷伯菌]、P10045[GI :115192,2009/01/20，肺炎克雷伯菌的肺炎亚种]、XP_001389617[GI :145230706, 2008/02/28，黑曲霉菌]、ACS13754[GI :239738518, 2009/06/15，产碱杆菌属 ECU0401]、BAA02684[GI 216203,2008/02/16,粪产碱杆菌]、CAK46957 [GI : 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%相同性的任何腈水解酶。技术人员知道测定氨基酸序列水平相同性程度的适当方法，例如BLAST或PBLAST算法。如上所述，活性腈水解酶可以是由大约14个亚基组成的同质寡聚酶。腈水解酶一般是无活性的二聚体。在本发明中，宿主细胞表面展示的腈水解酶可以是由三个或更多个相同亚基组成的同质多聚体。具体而言,这种同质多聚体包含7-16个相同的亚基，例如7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个相同的亚基。优选大约14个亚基，S卩11个、12个、13个、14个、15个或16个亚基。可由在宿主细胞膜上展示的几个相同的多肽亚基自发缔结形成同质多聚体(也称为“同质寡聚体”)。本说明书所用的“腈”指至少包含一个-CN官能团(腈基)的任何化合物。腈也可以包含I个、2个、3个、4个或更多个腈基。可使腈基与芳基分子,例如含6-14个碳原子,优选6-10个碳原子的芳基稱合。芳基可包含I个、2个或3个缩合的芳环。更优选芳基为苯基。芳基可被一个或多个取代基，例如I个、2个、3个、4个、5个或更多个取代基取代。可使腈基与脂族分子例如包含1-8个碳原子、1-6个碳原子、1-4个碳原子或1-3个碳原子的烷基耦合。这种烷基可以是直链或支链烷基。这种烷基可包含环状部分。这种烷基可被一个或多个取代基例如I个、2个、3个、4个、5个或更多个取代基取代。所述腈可包含烷基芳基，其中烷基和芳基的含义如本说明书所述。可使至少一个腈基耦合于烷基和/或芳基。烷基和/或芳基部分可被一个或多个取代基例如I个、2个、3个、4个、5个或更多个取代基取代。这里所用的一个或多个取代基可独立地选自_0H、碘代、溴代、氯代、氟代、芳基、烧基、烧氧基等，其中烧基和芳基的含义如本说明书所述，烧氧基含1_8个碳原子、1-6个碳原子、1-4个碳原子或1-3个碳原子。优选的烷氧基是甲氧基。烷氧基可以是直链或支链烷氧基。烷氧基可包含环状部分。烷基、芳香基和/或烷氧基可独立地包含至少一个杂原子，例如I个、2个、3个、4个或更多个杂原子，如此至少一个杂原子取代了碳原子。所述杂原子可独立地选自氮、氧和硫。可用作本发明腈水解酶底物的示范性腈是芳香腈，例如扁桃腈、苄腈(benzonitrile)、苯基丙腈(phenylpropionitrile)、苯基甘油腈、溴草腈、碘苯腈(ioxynile)、氯二甲腈(chloroxynile)、茴香腈、3_溴_4_轻基节腈、3_氟-4-轻基节腈 、4-羟基_3，5- 二甲氧基苄腈和野黑樱苷；以及脂簇腈，如正丁腈、正戊腈、异丁腈及琥珀腈。本发明特别优选的底物是扁桃腈。根据本发明，粪产碱杆菌腈水解酶的优选底物是扁桃腈和野黑樱苷。肺炎克雷伯菌腈水解酶的优选底物是溴草腈(bromoxynile)、碘苯腈、氯二甲腈、茴香腈、3-溴-4-轻基苄腈、3-氟-4-羟基苄腈和4-羟基-3，5- 二甲氧基苄腈。酿酒酵母菌腈水解酶的优选底物是节腈、苯基丙二腈(phenylprobionitrile)、扁桃腈、苯基甘油腈、正丁腈、正戍腈、异丁腈及琥拍腈。本发明的一个方面，已用聚合酶链反应(PCR)扩增粪产碱杆菌全DNA中腈水解酶的编码基因并克隆。通过附着于PCR引物的合适限制性位点，将该基因与自身转运蛋白基因的阅读框正确融合。可用标准的实验方法显示融合蛋白的表达。该酶在表面表达并固定，能在胞外转变加入的底物(此例为外消旋扁桃腈)。在目前采用的培养和表达条件下，5天后的转化率可达到约50%，优选约60%，更优选约70%，甚至还要更优选约80%。本发明方法可制备对映体过量的含不对称碳原子的化合物。产物(具体为羧酸)的对映体过量ee)至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，优选至少约99%或更高。如手性HPLC所示，5天后(R)-扁桃酸的转化率约为80%，对映体过量ee)高于99%。本说明书所用的底物对映体过量(ee)是对底物光学纯度的一种衡量。可测定待分析化合物溶液中的对映体过量。合适的溶剂(如疏水性溶剂和亲水性溶剂)和其混合液是已知的。可采用以下公式计算对映体过量 ee%= 100* ([R] _ [S]) / ([R] + [S])式中[R]、[S]指菌种浓度；R和S分别指(R)-和⑶-异构体。如此，在外消旋混合物中，即[R] = [S]中，ee%= 100*0/([R]+ [S]) = 0%,即R过量不超过S,或反之也然。因此，外消旋混合物的对映体过量为0%，而光学纯化合物的对映体过量为100%。可用该领域已知的测定含不对称碳原子化合物的任何方法来测定(R)-和(S)-异构体的浓度，例如但不限于，测定该混合物的比旋光度，手性柱色谱(如手性HPLC)和核磁共振(NMR)光谱测定。本说明书所述的本发明优点是腈水解反应条件温和与产物纯化方法简易相结合，因为为此目的只需离心分离各批反应的细胞。可在微生物中重组表达腈水解酶并将其转运至细胞表面。微生物本身可独立增殖并本身能产生该酶，不再需要费力地纯化这种生物催化剂。这类微生物的一个例子是本说明书实施例I中所述的大肠杆菌菌株。本说明书所用的术语“重组”指将天然状态互相不连接的至少两条核酸序列操作性彼此相连而制备的核酸序列。所述的至少两条核酸序列可获自同一微生物。例如，重组构建物可包含产碱杆菌属菌种的信号序列和同一产碱杆菌属菌种的腈水解酶编码序列，而此腈水解酶编码序列通常不与所述信号序列相连。所述的至少两条序列可获自至少两种不同的生物体。例如，可将大肠杆菌的信号肽、产碱杆菌的腈水解酶基因、大肠杆菌的跨膜接头和大肠杆菌的自身转运蛋白结构域操作性相连。另一个例子是信号肽源自霍乱毒素3亚基(CTB)，自身转运结构域和跨膜接头源自大肠杆菌，而腈水解酶源自产碱杆菌的重组多肽。在本发明一个优选实施方式中，术语“重组表达”也可与本说明书所用的术语“以 重组方式表达”等同义使用，指重组核酸序列的表达。例如，在大肠杆菌或任何微生物中表达的核酸序列包含大肠杆菌的信号肽和产碱杆菌的腈水解酶序列，构成了重组表达。优选将腈水解酶融合于自身转运蛋白的转运结构域。本发明的自身转运蛋白的转运结构域可以是自身转运蛋白的任何转运结构域，优选能形成￠-桶结构。￠-桶结构和￠-桶自身转运蛋白优选实施例的详细说明可参见为了引用而纳入本说明书的专利TO97/35022中所述。Henderson等人(2004年)描述了含有合适的自身转运结构域的自身转运蛋白(概述参见Henderson等人(2004年)的表I)。Henderson等人(2004年)公开的内容以引用方式纳入本说明书。例如，自身转运蛋白的转运结构域可选自Ssp (P09489,黏质沙雷菌)、Ssp-hl (BAA33455,黏质沙雷菌)、Ssp_h2 (BAA11383,黏质沙雷菌)、PspA(BAA36466，荧光假单胞菌)、PspB (BAA36467，荧光假单胞菌)、Ssal (AAA80490,溶血多斯德菌)、SphBl (CAC44081，百日咳杆菌)、AspA/NalP (AAN71715,脑膜炎奈瑟菌)、VacA(Q48247，幽门螺杆菌)、AIDA-I (Q03155，大肠杆菌)、IcsA (AAA26547，福氏志贺菌)、MisL(AAD16954，肠道沙门菌)、TibA(AAD41751，大肠杆菌)、Ag43(P39180,大肠杆菌)、ShdA(AAD25110,肠道沙门菌)、AutA(CAB89117，脑膜炎奈瑟菌)、Tsh(154632，大肠杆菌)、S印A(CAC05786，福氏志贺菌)、EspC(AAC44731，大肠杆菌)、EspP (CAA66144，大肠杆菌)、Pet ((AAC26634,大肠杆菌)、Pic (AAD23953,大肠杆菌)、SigA (AAF67320,福氏志贺菌)、Sat (AAG30168,大肠杆菌)、Vat (AA021903,大肠杆菌)、EpeA (AAL18821，大肠杆菌)、EatA(AA017297,大肠杆菌)、EspI (CAC39286,大肠杆菌)、EaaA(AAF63237,大肠杆菌)、EaaC((AAF63038,大肠杆菌)、百日咳杆菌粘附素(Pertactin) (P14283，，百日咳杆菌)、BrkA(AAA51646,，百日咳杆菌)、Tef (AAQ82668,百日咳杆菌)、Vag8 (AAC31247,百日咳杆菌)、PmpD (084818，砂眼披衣菌)、Pmp20 (Q9Z812，肺炎披衣菌)、Pmp21 (Q9Z6U5，肺炎披衣菌)、IgAl蛋白酶(NP_283693，脑膜炎奈瑟菌)、App(CAC14670，脑膜炎奈瑟菌)、IgAl蛋白酶(P45386，流感嗜血杆菌)、Hap(P45387，流感嗜血杆菌)、r0mpA(P15921，立氏立克次体)、rOmpB (Q53047，立氏立克次体)、ApeE (AAC38796，肠道沙门菌)、EstA (AAB61674,绿脓杆菌)、Lip-I (P40601，发光致病杆菌)、McaP (AAP97134,卡他莫拉菌)、BabA (AAC38081，幽门螺杆菌)、SabA (AAD06240,幽门螺杆菌)、AlpA (CAB05386,幽门螺杆菌)、Aae (AAP21063,伴放线放线杆菌)、NanB(AAG35309，溶血巴德斯菌)以及这些自身转运蛋白的变体。括号中给出的各示范性自身转运蛋白是相应基因库登录号和获得该自身转运蛋白的菌种的示范例。自身转运蛋白的转运结构域优选为大肠杆菌AIDA-I蛋白或其变体,例如Niewert U.、Frey A. >Voss T. >Le Bouguen C. >Baljer G. >Franke S. >Schmidt MA 所述的。AIDA 自身转运蛋白系统可与分离自诊断为水肿病和断奶仔猪腹泻患猪的大肠杆菌中的F18和Stx2e相结合。Clin Diagn Lab Immunol, 2001 年 I 月，8 (I) :143-149 ;9。例如，可通过改变P -桶的环结构(不是其跨膜结构的组成部分)中的氨基酸序列获得上述自身转运蛋白序列的变体。可任选地完全删除该表面环的编码核酸部分。而且，可在两亲性3 -折叠中进行保守氨基酸交换，即将一个亲水氨基酸换成另一个亲水氨基酸和/或将一个疏水氨基酸换成另一个疏水氨基酸。优选在氨基酸水平上，变体序列与该自身转运蛋白结构域各自的天然序列，具体在￠-折叠范围内，至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%相同。本发明方法的步骤(I)优选包括以下步骤 (a)提供含有操作性连接于表达调控序列的核酸序列的微生物，所述核酸序列包含(I)信号肽的编码部分；(2)要展示的重组腈水解酶的编码部分；(3)任选的蛋白酶识别位点的编码部分；(4)跨膜接头的编码部分；和(5)自身转运蛋白转运结构域的编码部分；(b)培养该微生物,培养条件应能表达(a)所述的核酸序列，并在微生物表面展不该核酸序列的表达产物。本领域技术人员能设计出表达这种核酸序列的条件，只涉及常规实验，例如，可测试各种温度、培养基、细胞密度和/或诱导表达的化学试剂的浓度。可通过用操作性相连于表达调控序列的核酸序列转化，而获得步骤(a)所提供的微生物，其中所述核酸包含(I)信号肽的编码部分；(2)要展示的重组腈水解酶的编码部分；(3)任选的蛋白酶识别位点的编码部分；(4)跨膜接头的编码部分；和(5)自身转运蛋白转运结构域的编码部分；其中，组分(1)-(5)是下文所述的核酸序列。可采用任何已知的转化方法。本说明书所用的术语“转化”宜指在细胞中，优选在细菌细胞中引入外源构建物，下面称为细胞被转化。本领域技术人员知道关于转化的方案和步骤，例如，感受态细胞的电转化或化学转化。在另一个实施方式中，本发明方法还包括步骤(C):制备(b)所述微生物的膜制剂。本发明所用的膜制剂包含催化活性腈水解酶。本说明书所用的术语“膜制剂”优选指富含膜组分的产品。本领域技术人员熟知可用于获得膜制剂的方案和步骤。例如，收获培养的细菌细胞，通过反复冻融、超声，重悬浮于裂解缓冲液中使之裂解，然后差速离心，分离得到细胞的膜组分。在本发明一个优选实施方式中，所述膜制剂是外膜制剂，即所含的外膜组分比其他膜组分和腔室，例如胞液、内膜和周质更丰富的制剂。本领域技术人员熟知可用于分离得到外膜的方案和步骤，例如，用溶菌酶处理细菌细胞，然后离心的步骤。在本发明一个优选实施方式中，所述膜制剂是包含催化活性腈水解酶的外膜制剂，该膜制剂由在胞液中合成所述腈水解酶，然后将其转运到外膜的细胞制备。在另一个实施方式中，例如，将膜蛋白，如腈水解酶融合蛋白掺入到人工囊泡中，以适当处理所述膜制剂。本属领域技术人员有办法在囊中泡重建功能性膜蛋白，例如，采用合适的洗涤剂。本发明方法的步骤(a)指提供微生物。所述微生物可以是本说明书所述的任何微生物。在步骤(a)中，提供一种宿主细胞，具体为宿主细菌，其含有与表达调控序列(即，启动子)操作性相连的核酸序列，和任选还包含在相应宿主细胞中表达基因所需的序列。本说明书所用的“与表达调控序列操作性相连的核酸序列”指核酸序列与表达调控序列在功能上相关连。技术人员知道合适的启动子和表达调控序列。启动子和/或表达调控序列可以与宿主细胞同源或异源。 优选所述核酸序列位于重组载体，如质粒载体上。步骤(a)所述的核酸序列包含(I)信号肽的编码部分，优选革兰阴性菌信号肽的编码部分，而能通过细胞内膜转运至周质中。信号肽可以是宿主细胞的同源信号肽。信号肽也可以是宿主细胞的异源信号肽。所述核酸序列还包含(2)要展示的腈水解酶(“乘客多肽”或“乘客”)的编码部分。可采用编码本说明书所述任何腈水解酶的核酸。所述核酸序列任选包含(3)蛋白酶识别位点的编码部分。本说明书所用的术语“蛋白酶识别位点”指特异性蛋白酶识别的特异性氨基酸序列，蛋白酶随后通过水解蛋白酶识别位点标记的酰胺键切断该多肽。蛋白酶识别位点可以是内源性蛋白酶(即宿主细胞天然产生的蛋白酶)的识别位点，或是外源加入的蛋白酶的识别位点。例如，外源加入的蛋白酶可以是IgA蛋白酶(参见EP-A-O 254 090)、凝血酶或因子X。内源性蛋白酶可以是，例如选自OmpT、OmpK或蛋白酶X。蛋白酶识别位点可以与宿主细胞同源，蛋白酶识别位点也可以与宿主细胞异源。此外，所述核酸序列还包含(4)递呈乘客多肽，即宿主细胞外膜外表面上的重组腈水解酶(2)所需的跨膜接头的编码部分。可采用与自身转运蛋白同源的跨膜接头结构域，即直接融合于自身转运蛋白结构域编码核酸序列5’端的核酸部分编码的跨膜接头结构域。也可采用与自身转运蛋白异源的跨膜接头结构域。跨膜接头的长度优选30-160个氨基酸。此外，所述核酸序列包含(5)自身转运蛋白转运结构域的编码部分。在本发明中，自身展示可以是通过革兰阴性菌的自身转运蛋白实现的蛋白或多肽的重组表面展示。转运结构域可以是本说明书所述的任何转运结构域。本发明核酸序列中的(1)-(5)组分的取向优选从5’到3’。在步骤(b)得到的表达产物中，核酸序列(1)-(5)编码的氨基酸序列排列优选从N末端到C末端。本发明方法的步骤(b)指培养微生物，培养条件应能表达步骤(a)所述的核酸序列，在微生物表面展示的表达产物含重组腈水解酶。本领域技术人员知道合适的培养条件。本发明方法采用液体培养基可在微生物，具体为大肠杆菌或其他革兰阴性菌细胞表面有效表达乘客蛋白质，每个细胞可表达10万或更多个分子，液体培养基包含以下组分5-20g/1，优选约10g/l胰化酪蛋白胨；2-10g/l，优选约5g/l酵母提取物；5-20g/l，具体约10g/l的NaCl ;其余为水。此培养基应含有尽可能低含量的二价阳离子，因此优选采用双蒸水或高纯水，如Millipore水。此液体培养基还优选含浓度2-20 u M，具体为10 y M的乙二胺四乙酸(EDTA)。另外，优选含有还原剂，如优选浓度为2-20mM的2-巯基乙醇或二硫苏糖醇或二硫赤藓糖醇。这种还原剂有利于多肽以非折叠结构转运。该液体培养基还可含有含量10g/l的其他碳源，优选葡萄糖，以有利于分泌，即把乘客蛋白转移至周围培养基。对于表面展示，宜不加入其他碳源。革兰阴性菌细胞(如大肠杆菌)的优选培养条件在“实施例”中有所描述。可在有氧和/或氧化条件下执行步骤(i 1)。在一个优选实施方式中，术语“有氧条件”指特征为存在氧的条件。在另一个优选实施方式中，术语“有氧条件”指存在的氧水平比给定温度和液体时的通常水平高。在另一个优选实施方式中，术语“有氧条件”指液体 (例如培养液)与周围含氧环境(例如空气)之间气体交换水平提高为特征的条件。本领域技术人员有能力通过采用(例如)合适的氧敏感电极测量氧水平。而且，本领域技术人员有能力创造有氧条件，例如用空气或氧气给缓冲液或培养基充气，加入能释放氧的化学试剂，或在氧气或空气存在下强力振摇缓冲液或培养液。相反，本领域技术人员也能创造厌氧条件，例如，用氩气或氮气给培养基或缓冲液彻底充气，或密封培养器皿以最大程度减少气体交换。在一个优选实施方式中，本说明书所用的术语“氧化条件”指在培养基或缓冲液中加入氧化剂或存在氧化剂，即能引起其他化学物质释放电子的化学试剂，而使酶易被氧化。例如，已还原的氧化还原酶在氧存在下易被氧化。相反，本说明书所用的术语“还原”或“还原条件”指在培养基或缓冲液中加入还原剂或存在还原剂，即能引起其他化学物质吸收电子的化学试剂。本领域技术人员有能力创造所选择的氧化还原环境，例如，通过加入氧化齐U，如氧气；和加入还原剂，例如含巯基的试剂，如巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)。此外，本领域通技术人员有能力测量溶液的氧化还原电势，例如通过采用氧化还原电极。在革兰阴性菌宿主细胞，如大肠杆菌中，重组乘客蛋白转位后，乘客蛋白通过￠-桶结构(其作用为锚定于外膜中)维持附着于外膜表面。由于￠-桶结构控制整合入外膜中，￠-桶结构的C-末端部分朝向外膜的内侧，而与重组乘客蛋白共价结合的接头的N-末端部分朝向外膜的外表面，即朝向环境。任选的步骤(C)指制备步骤(b)所述的微生物膜制剂。本领域技术人员熟知获得膜制剂的合适方法。本说明书所用的膜制剂优选外膜制剂。本发明方法的步骤(ii)指在与腈水解酶活性相容的条件下，使微生物和/或其膜制剂接触一种或多种腈水解酶的底物。如上所述，在一个优选实施方式中，步骤(ii)指在腈水解酶催化腈转化形成羧酸的条件下，使微生物和/或其膜制剂接触腈。可采用本领域已知的任何合适条件。具体而言，在液体介质中进行反应。在液体介质中微生物可形成悬浮液。也可固定微生物。如果采用膜制剂，可将膜制剂分散在液体介质中形成颗粒。在PH约5. 0-9. 0范围内，优选约6. 0-8. 0，更优选约6. 5-7. 5时进行该反应。本发明方法的步骤(iii)指回收步骤(ii)所用的微生物。如本发明实施例所示，经24小时反应循环后，细菌细胞仍然显示有显著的(酶)活性。因此，该细胞可用于下一步反应循环。可通过离心反应混合物进行回收。如需要可洗涤细胞。本发明另一方面涉及利用表面表达腈水解酶的微生物和/或其膜制剂来制备腈水解酶催化反应产物，具体是制备羧酸。制备的羧酸优选为扁桃酸，特别是(R)-扁桃酸。本发明另一方面涉及表面展示重组腈水解酶的微生物，该微生物是本说明书所述的微生物，腈水解酶是本说明书所述的腈水解酶。具体而言，该微生物表面展示有一种融合多肽，其包含信号肽、重组腈水解酶、任选的蛋白酶识别位点、跨膜接头和自身转运蛋白的转运结构域，其中该融合蛋白的诸组分如本说明书所述。本发明另一方面涉及包含腈水解酶的膜制剂。可从本说明书所述微生物，例如本发明方法步骤(C)所述的微生物获得这种膜制剂。所述腈水解酶可以是本说明书所述的任何腈水解酶。本发明还有一方面是制备表面展示有重组腈水解酶的微生物的方法，包括在所述 微生物中弓I入一种核酸序列，所述核酸序列包含(I)信号肽的编码部分；(2)要展示的重组腈水解酶的编码部分；(3)任选的蛋白酶识别位点的编码部分；(4)跨膜接头的编码部分；和(5)自身转运蛋白转运结构域的编码部分。其中，所述核酸操作性连接于表达调控序列。组分(1)-(5)是本说明书上述的核酸序列。所述微生物可以是本说明书所述的任何微生物，例如细菌，更具体说是革兰阴性菌，甚至更具体说是大肠杆菌。所述腈水解酶可以是本说明书所述的任何腈水解酶。“将核酸引入所述微生物”包括本说明书所述的转化。现通过以下附图和实施例对本发明作进一步说明，不应认为是对本发明范围的限制图I :pAT_NitAf编码的自身转运融合蛋白示意图。给出了融合位点周围的序列。黑体斜字表示通过克隆方法在N-端加入的两个氨基酸。标出了信号肽酶的切割位点。SP为信号肽。图2 :大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NitAf外膜组分的SDS-PAGE电泳图，包括泳道(I)过表达的自身转运融合蛋白AFP，泳道(2):用蛋白酶K消化的全细胞过表达自身转运蛋白，和泳道(M):标志物。图3 :腈水解酶活性的证明从(R，S)_扁桃腈产生(R)-扁桃酸。反应混合物(总体积Iml)包含磷酸钠缓冲液(50mM、pH 7. 5)、(R，S)-扁桃腈(IOmM)和与0D578 = 10相对应的大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NitAf细胞。数据点是三次实验的平均值；表示标准差的条棒太小无法看见。实心符表示在0D578 = I时诱导，空心符表示在0D578 = 0. 5时诱导。Tris-HCl 缓冲液 pH 7 ( ▼ / ▽)、磷酸盐缓冲液 pH 7. 5 ( ■ / □)。图4 :(R)_扁桃酸的手性HPLC检测。溶于甲醇中的纯(R)-扁桃酸(IOmM)(前)，用大肠杆菌BL2IpAT-NitAf转化外消旋扁桃腈提取的扁桃酸(后)。图5 : (R，S)-扁桃腈转化为R-扁桃酸的pH依赖速率。在50mM醋酸盐缓冲液(空心条)或50mM Tris-HCl缓冲液(实心条)中进行反应。37°C反应时间48小时。
图6 :_18°C储存时全细胞生物催化剂的稳定性。用含20%甘油的介质冻存细胞，37°C融化后开始用大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NitAf在50mM磷酸盐缓冲液(pH7. 5)中转化IOmM扁桃腈120小时产生扁桃酸。图7 :在不同缓冲液和温度条件下大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NitAf的重复使用性。每轮循环对应的转化时间为24小时。然后离心(60秒，13000转/分)去除生物催化剂，重悬于新鲜的缓冲液中，与新鲜的底物液混和(终浓度IOmM)再培养24小时。实心符表示Tris-HCl缓冲液(50mM,pH 7)，空心符表示磷酸钠缓冲液(50mM,pH 7. 5)。45°C ( /〇)、42 0C ( □ / ■ ) >37 0C ( ▲ / A ) >30 0C ( ▼ / ▽)。图8 :用Kpn Xhol限制性酶消化的质粒DNA0泳道I) lkb标志物；泳道2-12):用KpnI/XhoI消化转化菌的质粒DNA ;泳道13) lkb标志物。图9 :胰蛋白酶消化克隆的大肠杆菌UT 5600(DE3)pAT-NitAf和pAT-NitSc后分 离得到的外膜。泳道1)胰蛋白酶消化的pAT-NitSc，2)未消化的pAT-NitSc，3)蛋白酶K消化的pAT-NitAf，4)未消化的pAT-NitAf，5)分子量标准(kDa)。
图10 :大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NitAf转化扁桃腈后的HPLC分析。A)阴性对照大肠杆菌 BL21 (DE3)，0D578 = 10，培养时间 120h/30°C。1)HPLC的溶剂前沿2)扁桃腈3)苯甲醛B)用大肠杆菌 BL21 (DE3)pAT-NitAf 转化，0D578 = 10，培养时间 120h/30°C。1)HPLC的溶剂前沿2)扁桃腈，3)苯甲醛图11 :用重组全蛋白生物催化剂大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NitAfu产生的扁桃酸。图12 :在磷酸盐缓冲液(pH 7. 5)中，分别在30。。和37°C用大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NitAf产生的扁桃酸。当0D578 = I时，30°C用ImM IPTG诱导细胞I小时。时间t =0时，底物扁桃腈的浓度为10mM。图13 :37°C用不同浓度的底物，大肠杆菌BL21(DE3)pAT-NitAf在磷酸盐缓冲液(pH 7. 5)中所产生的扁桃酸。0D578 = I时，30°C用ImM IPTG诱导细胞I小时，转化120小时。图14 :37°C大肠杆菌BL21(DE3)pAT-NitAf在不同的缓冲液系统中所产生的扁桃酸(图中标示的除外)。0D578 = I时，30°C用ImM IPTG诱导细胞I小时。时间t = O时，底物扁桃腈的浓度为10mM，转化120小时。图15 :检测和鉴定用大肠杆菌BL21(DE3)pAT-NitAf处理5天后产生的(R)-扁桃酸。采用手性-OM柱(CS-色谱服务公司)与己烷2-丙醇TFA (90 10 0.1)，流速
0.5ml/min。检测2IOnm(吸光度)。A)用乙酸乙酯提取的大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NitAf细胞上清液的分析。B)外消旋扁桃酸与A)的转化物混和。图16 :在6°C储存不同时间后产生的扁桃酸(图16)。在50mM磷酸盐缓冲液(pH7. 5)中，371用大肠杆菌此21(0￡3441'-祖七4€转化IOmM扁桃腈120小时。图17 :在转速IOOOrpm的恒温混合仪中，在不同缓冲液中和不同温度下各24小时，大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NitAf转化IOmM扁桃腈所产生的扁桃酸。图18:检测大肠杆菌1321 么1'-祖认？所产生的3，5-二溴-4-羟基-苯甲酸。培养时间120小时，0D578 = 10，底物为2. 5mM溴草腈。
实施例以下实施例可证明本发明人能鉴定三种不同生物体的腈水解酶基因，并能将所述基因克隆到自身展示系统中。实施例I :粪产碱杆菌的腈水解酶全细胞生物催化剂是用于制备大量和稀有化学物质的有吸引力的技术工具，特别是当需要合成区域选择性或对映体选择性化学物质时。在本项研究中，构建了以扁桃腈作为底物的可合成(R)-扁桃酸的全细胞生物催化剂。为此目的，用自身展示法在大肠杆菌表面表达粪产碱杆菌粪亚种ATCC 8750的腈水解酶。此自身展示系统是革兰阴性菌的强大表 面展示系统，其基础是自身转运蛋白通路。用这种技术，有可能在大肠杆菌表面表达活性形式的多个同质聚合腈水解酶，而产生对映体过量超过99%的光学纯(R)-扁桃酸。SDS-PAGE监测到腈水解酶-自身转运蛋白的融合蛋白已整合入到外膜中，并用蛋白酶可接近试验证实了该酶暴露于表面。在优化条件下能够用0D578 = 10的细菌悬浮液在24小时内小规模生物转化(Iml)产生2. 6mM(R)-扁桃酸。作为多个同质聚合酶的模型，采用了粪产碱杆菌粪亚种ATCC 8750的腈水解酶。在全细胞消化过程中该腈水解酶能接近蛋白酶切割(位点)，对苯甲醛显示出与游离酶相同的底物抑制作用。结果融合蛋白的构建采用从公布的序列数据(参见“实验”章节)推断出的寡核苷酸(作为引物)，以聚合酶链反应(PCR)扩增粪产碱杆菌粪亚种ATCC 8750基因组DNA中的腈水解酶基因。该PCR引物在腈水解酶编码区的5’端添加一个Xhol位点，在3’端添加一个KpnI位点，此为腈水解酶与自身展示需要的自身转运蛋白结构域框内融合所需。按前人(JOSe，2001年)所述，采用PET-Adx作为编码自身转运蛋白框架的载体骨架。将得到的PCR产物连接入用XhoI/KpnI切割的pET-Adx中，取代先前的Adx乘客，产生pAT-NitAf。得到的自身转运蛋白融合蛋白显示了典型结构，包含信号肽、作为乘客的腈水解酶、跨膜接头和￠-桶结构(图I)。利用霍乱毒素P亚基(CTB)的信号肽转运通过内膜。源自AIDA-I的￠-桶结构(自身转运蛋白的转运结构域)将乘客蛋白转运通过外膜和连接区域(跨膜接头)，从而实现完全的表面可接近(Jose，2001年)。经信号肽酶处理后，得到pAT-NitAf编码的成熟融合蛋白具有预计的约90kDa分子量。将pAT-NitAf转化入OmpT阴性突变株一大肠杆菌BL21 (DE3)中，防止了对展示的腈水解酶的切割。该菌株称为大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NitAf。表达腈水解酶与自身转运蛋白的融合蛋白按实验章节所述通过加入ImM IPTG起动人工融合蛋白的蛋白生物合成。为了研究腈水解酶是否完全暴露在周质表面，进行了大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NitAf完整细胞的全细胞消化。因为蛋白酶，如蛋白酶K、胰蛋白酶，不能渗透大肠杆菌的外膜，所以外加蛋白酶导致的蛋白降解必然是由于其表面暴露之故。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)监控表达和全细胞消化。然后考马斯亮蓝染色表明加入蛋白酶K导致极大地减少了融合蛋白条带(图2)。Omp F/C和OmpA蛋白条带的强度是被分析细胞是否完整的敏感标志。消化和未消化样品中这两种Omp条带的比例应无变化。如果OmpA条带消失,表明外膜有渗漏,和OmpA的周质部分被蛋白酶K降解。在我们的实验中，经蛋白酶处理和未处理的细胞中OmpA的大小和含量相同。小结我们的结论是几乎所有的乘客酶都暴露在细菌表面。表面展示的腈水解酶的酶活性为了检验含有pAT-NitAf质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)细胞，将用50mM磷酸钠(pH7. 5)缓冲液配的总体积Iml的细胞悬液的578nm(0D578)光密度调整为10。因为已描述该酶对羟基腈具有底物特异性，故采用最终浓度IOmM的外消旋扁桃腈作为底物。用HPLC分 析生物转化，计算出产生的扁桃酸。在0D578 = 0. 5时用IPTG诱导细胞进行第一次生物转化。生物转化72h后导致产生2. ImM扁桃酸。再培养至120小时不进一步增加扁桃酸的产生。在0D578 = I时用IPTG诱导使生物转化显著提高了两个数量级。含这种修饰的细胞，其生物转化到72小时时趋于平稳，但到120小时观察期反而升高使扁桃酸总量达到6. 6mM(图3)。由于扁桃腈降解自发形成的游离苯甲醛可导致酶抑制，因此限制了加入的底物量(Yamamoto 等人，1992)。扁桃腈转变为扁桃酸已建立的HPLC方法可使底物(扁桃腈)与产物(扁桃酸)分离并去除底物。证实了采用大肠杆菌BL21(DE3)pAT-NitAf可将扁桃腈转变为扁桃酸(图10)。HPLC分析揭示，如预期的那样水系统中的扁桃腈与苯甲醛(+HCN)存在平衡(图10)。当采用0D578 =10的细胞悬浮液时，从底物浓度5mM开始反应120小时后，采纳的几种反应参数导致产生浓度2. 4mM的产物，对应于每毫升样品可产生0. 36mg质量的产物(图11)。对映体过量下一步是验证产生的扁桃酸是否对映体过量。为此目的，用乙酸乙酯作溶剂提取水性缓冲液中的扁桃酸。将提取得到的扁桃酸溶于甲醇，直接用于手性HPLC分析。测得的37°C生物转化对映体过量(ee)超过99% (图4和图15A)。这表明，粪产碱杆菌表面展示的腈水解酶能够产生光学高纯度的(R)-扁桃酸。图15A证明，几乎唯一可检测到的是扁桃酸(R)-对映体的保留时间特征峰。计算出的光学纯度超过99%。图15B显示纯(R)-和
(S)-对映体加强了图15A转化的(R)-扁桃酸身份的确定。pH值的优化虽然先前已公布了粪产碱杆菌腈水解酶的最佳pH为7. 5，但我们研究了表面暴露是否会导致最佳pH漂移。将细胞重悬于醋酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液(浓度均为50mM)中，使最终0D578 = 10。37°C培养120小时后，用HPLC分析上清液，计算出转化的扁桃酸量。在最佳pH值=pH7时，我们测得转化产生了 5. 5mM扁桃酸。在pH7与pH8之间检测到活性强烈损失。附加研究表明在相同条件下PH7. 5的磷酸盐缓冲液导致只转化产生了 4. 4mM扁桃酸(数据未显示)(图5)。采用最佳反应温度和pH值，可在24小时内转化产生2. 6mM扁桃酸。任何时间都检测不到扁桃酰胺。动力学在一系列实验中，分析了几种参数对实验室规模制备扁桃酸的影响。图12表示不同温度时扁桃酸产生的动力学。37°C转化测得的产物浓度比30°C转化提高约20%。30°C和37°C的转化进程还表明经约144小时转化后产生的扁桃酸浓度只缓慢增加。底物浓度另外分析了底物浓度对扁桃酸产生的影响。在水溶液中，底物扁桃腈与苯甲醛和HCN处于平衡。但是，如图13所示，过量浓度的苯甲醛对细胞显示有毒性作用，从而限制了底物浓度的增加。进一步将腈的浓度降至IOmM以下不导致产率进一步下降，提示采用IOmM的扁桃腈是最佳的底物浓度。
不同的缓冲液系统还利用全细胞催化剂大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NitAf,采用不同的缓冲液系统进行了扁桃酸产生的比较性研究。图14表明，与所用的任何其他缓冲液相比，采用pH6.5Tris-缓冲液所达到的效果最佳。储存稳定性为测定构建的全细胞生物催化剂的储存稳定性，将悬浮于含20% (v/v)甘油50mM磷酸钠缓冲液(PH7. 5)中的经IPTG诱导的大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NitAf细胞调整至0D578 = 50，储存在-18°C。在_18°C保存的样品中加入防冻剂甘油可防止细胞裂解。在不同的时间间隔后，用磷酸钠缓冲液洗涤样品一次，调整到0D578 = 10。或者，在IPTG诱导后，将细胞分成等分存放在6°C冰箱内，存放不同时间后作腈水解酶试验。加入IOmM扁桃腈启动反应，37°C培育样品120小时。在-18°C储存35天后细胞仍然保留了最初活性的72%(图6)。在+6°C—周后，全细胞催化剂的活性仅为最初活性的约50% (图16)。还有在这些实验中，这与观察到的细胞裂解相关。再次证明，随测量时间的推移一部分细胞显示的残余活性相对稳定。全细胞催化剂的温度依赖性已描述纯化的粪产碱杆菌腈水解酶的最佳温度是40_45°C。图17所述的测试温度范围30°C 45°C证实了这些发现。反应混合物中所用的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液看来无特殊影响。全细胞催化剂的可重复使用性(图7)为研究全细胞生物催化剂的可重复使用性和稳定性，在不同的缓冲液和温度条件下进行了 5轮24小时循环转化反应。一轮“循环”为24小时转化反应，然后离心得到大肠杆菌细胞，加入新鲜底物进行下一轮循环。在磷酸钠缓冲液(pH 7.5，45°C)中大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-Ni tAf反应在24小时内达到了最高产量，产生了 2. 62mM扁桃酸，但5轮循环使用后，酶活性快速下降到最低，仅为最初活性的10%。采用Tris-HCl缓冲液(pH 7，45°C )，在24小时内转化产生了 2. 53mM扁桃酸，5轮循环使用后，可获得超过33%的初始转化率。在Tris-HCl (370C )缓冲液中细胞酶活性从第一轮循环的2. 24mM下降至5轮循环使用后的I. 25禮，表明有55%以上的残余活性。在第一轮循环中，重悬于磷酸钠缓冲液或Tris-HCl缓冲液中的细胞之间产率只有较小差异，但相反，采用Tris-HCl缓冲液的测试样品始终表现出较好的整体性能。
实验章节细菌菌株和质粒为了亚克隆，采用了英杰(Invitrogen)公司(美国加州卡尔斯巴德)的大肠杆菌 TOPlO[F-mcrAA (mrr-hsd RMS-mcrBC)O 80/acZ A Ml5 AlacX74 recAl araD139A (ara-leu) 7697ga/U ga/K rpsL(StrR) endAl nupG]。自身转运蛋白融合蛋白的表达采用大肠杆菌 BL21 (DE3) [B, F-, dcm, ompT, Ion, hsdS (rB- mB_)，gal,入(DE3)]。37 0C在强烈震荡(200rpm)下，在含氨苄青霉素(100 y g/mL)的Luria-Bertani (LB)培养基中常规培养大肠杆菌菌株。在该培养基中加入琼脂(1.5%，w/v)制备固体培养基。采用英杰公司(美国加州卡尔斯巴德)的质粒pCR 4-T0P0 亚克隆腈水解酶基因。如前文(Rustler等人，2008 ;6，180，359号美国专利)所述构建AIDA-I自身转运蛋 白框架编码质粒pET-Adx04。图8显示从11个转化株中分离得到的质粒,其中用Kpnl和Xhol消化后，在7个克隆的正确自身转运蛋白质拉(约7kb)中检测到与PCR片段对应的约Ikb的正确DNA片段。重组DNA技术扩增粪产碱杆菌粪亚种ATCC 8750(德国韦塞尔LGC Standards GmbH)基因组DNA中的腈水解酶编码基因。扩增腈水解酶基因用的引物得自已公布的粪产碱杆菌腈水解酶基因序列的信息(Kaul 等人，2007 年)。用正向引物 Nit-Xhol (5 ' -CCGCTCGAGCAGACAAGAAAAATCGTCC)和反向引物Nit-Kpnl (3 ' -GGGGTACCGGACGGTTCTTGCACC)扩增含腈水解酶基因的1073bp片段。为了方便PCR产物的克隆，加入XhoI和KpnI限制性位点(引物序列中加下划线部分表示相应酶的限制性位点)。PCR反应的10 ii L体积中含IOng基因组DNA、Eppendorf公司(德国汉堡)的适量Eppendorf PCR Mastermix、正向引物和反向引物(美国密尔沃基Sigma-Aldrich化学公司)各I ii L (10 ii M原液)。在Eppendorf公司(德国汉堡)的Eppendorf Mastercycler梯度仪中进行PCR反应。PCR方法包括先95°C变性5分钟,然后94°C 30秒、64°C I分钟、72° I分钟30轮循环，最后72°C延伸6分钟。按照产商使用说明书直接将PCR产物亚克隆到pCR 4_T0P0 载体中。按本说明书他处所述方法制备质粒DNA。用Xhol/Kpnl消化得到的质粒，用琼脂糖凝胶电泳和Qiagen凝胶抽提试剂盒(德国希尔登Qiagen公司)纯化。将得到的片段插入用Xhol/Kpnl切割的pET_AdX04载体中，取代Adx04编码基因得到 pAT-Ni tA o外膜制剂和SDS-PAGE培养大肠杆菌细胞过夜，取合适量的培养菌接种含2-巯基乙醇(IOmM)和氨苄青霉素(lOOiig/mL)的LB培养基。37°C (200rpm)培养细胞直至光密度(0D578)达到0. 5或
I。为诱导表达，加入购自Roth公司(德国卡尔斯鲁厄)的IPTG(终浓度ImM)。30°C培养60分钟后，收获细胞用Tris-HCl (0. 2M，pH 8. 2)液洗涤。对于蛋白酶可接近试验，将细胞重悬于含25 ii L蛋白酶K溶液(2%)的2ml Tris-HCl (0. 2M,pH 6.8)液中，37°C水浴培养60分钟。按照改良的Hantke (Hantke, 1981年)方法进行差速细胞分级分离。对于SDS-PAGE 电泳，用含Tris-HCl (100mM,pH 6. 8)、十二烷基硫酸钠(4% )、溴酚蓝(O. 2% )、2_巯基乙醇(2% )、二硫苏糖醇(O. 2M)和甘油(20% )的样品缓冲液以I : 2比例稀释分离的外膜，煮沸5分钟，在10 %聚丙烯酰胺凝胶上作电泳分析。用考马斯亮蓝染色蛋白质，用购自Fermentas公司(德国St. Leon-Rot)的Pageruler未染色梯度蛋白(作标准)测定其大小。实施标准的转化按以下步骤实施标准实验用预先培养的重组大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NitAf菌株，以I : 100比率，接种主培养物，37°C在200rpm转速摇床中培养。0D578达到I时，加入终浓度ImM的IPTG进行诱导。30°C 200rpm诱导I小时。用50mM磷酸盐缓冲液(pH 7. 5)洗涤细胞一次后，用同一缓冲液将0D578调整为10。然后，取Iml等份的所述细胞悬浮液与20 μ I扁桃腈(O. 5Μ)混和，在转速IOOOrpm或200rpm的恒温混合仪中不同温度(特别是37°C )下培养。提取不同时间间隔的样品，离心(6000x g，5min)分离，用购自VWR公司(德国达姆施塔特)的O. 2 μ m聚醚砜膜过滤除菌。用HPLC直接分析上清液。除菌过滤后未检测到进一步的生物转化。 分析方法采用配备二极管阵列检测器996和Waters公司(美国马萨诸塞州)的2695分离模块的HPLC(Millenium Chromatography Manager 3. 2)分析腈转化。对于手性分析，采用惠普公司(德国布林根)的反相柱[100mm X 4. 6mm (内径)，填充Hypersil ODS 5μηι直径颗粒]以分光光度法检测210nm处转化产物的身份。用甲醇(40% v/v)和磷酸(O. I % )水溶液作为HPLC分离的流动相。扁桃酸对映体的分离采用CS-色谱服务公司(德国Langerwehe)的手相柱[150mm x 4. 6mm (内径)，填充 Reprosil 手性-OM 5μηι 直径颗粒]。移动相由己烧(90% v/v)、异丙醇(10% v/v)和三氟乙酸(O. I % v/v)组成。按其他文献所述作轻微修改用乙酸乙酯代替二氯甲烷(Yamamoto，1991年)，提取生物转化样品中的扁桃酸。实施例2 :肺炎克雷伯菌的腈水解酶按实施例I所述，在中间克隆入大肠杆菌标准载体中和序列分析后，用PCR扩增肺炎克雷伯菌腈水解酶基因，将其插入相应的自身展示载体中。该自身展示构建物编码的融合蛋白包含肺炎克雷伯菌腈水解酶、自身转运结构域、跨膜接头和信号肽，如实施例I的pAT-NitAf所述,将其称为pAT-NitKp。表面展示该融合多肽的相应大肠杆菌菌株称为大肠杆菌 BL21 (DE3)pAT-NitKp。对肺炎克雷伯菌腈水解酶的表达和表面定位进行检测，方法与粪产碱杆菌腈水解酶类似(参见实施例I)。从文献可熟知，所述腈水解酶对于底物溴草腈显示有很高的特异性。所述毒性化合物(溴草腈)广泛用作农业除草剂，在德国每年都以工业规模施用。而其对应的羧酸毒性较低，在自然环境中稳定。图18显示大肠杆菌JK321 pAT-NitKp通过溴草腈产生的3，5_ 二溴_4_羟基-苯甲酸。该图表明，在大肠杆菌细胞表面表达的肺炎克雷伯菌腈水解酶能把腈转变成其相应的羧酸。实施例3 :酿酒酵母菌的腈水解酶如实施例I所述，用PCR扩增酿酒酵母菌的腈水解酶基因并克隆。序列分析揭示，其与获自数据库的酿酒酵母菌腈水解酶序列100%相同。如实施例I所述，将该腈水解酶克隆到大肠杆菌中，产生的融合蛋白包含自身转运蛋白结构域、跨膜接头和信号肽。序列分析还揭示与数据库的序列100%相同。用实施例I所述类似方法检测表达。对编码包含酿酒酵母菌腈水解酶、自身转运蛋白结构域、跨膜接头和信号肽的融合蛋白的自身展示构建物，如实施例I的PAT-NitAf所述，将其称为pAT-NitSc。表面展示该融合多肽的相应大肠杆菌菌株称为大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NitSc。发现经IPTG诱导后，包含酿酒酵母菌腈水解酶的该融合蛋白位于酵母菌细胞表面。采用如实施例I所述经胰蛋白酶消化的全细胞。结果小结于图9中。参考文献I. Jose J、Meyer TF(2007年)；《自身展示的介绍，从发现到生物技术和生物医学的应用》；Microbiol Mol Biol Rev(微生物学与分子生物学评论)；71(4) :600-19 2. Nagasawa T、Mauger J、Yamada H(1990 年)；《一种新型腈水解酶，粪产碱杆菌JM3芳基乙腈水解酶，提纯和特征鉴定》；Eur J Biochem(欧洲生物化学杂志)194(3)765-723. Yamamoto K、Oishi K、Fujimatsu I、Komatsu K(1991 年);《用幾产喊菌 ATCC8750从扁桃腈产生R-(-)_扁桃酸》；Appl Environ Microbiol (应用环境微生物学)； 57(10) =3028-324. Rey P、Rossi JC、Taillades J、Gros G、Nore 0(2004 年)；《用固定的臆水解酶水解腈在甲硫氨酸轻基类似衍生物合成中的应用》J Agric Food Chem(农业食品化学杂志)52(26) :8155-625. Kiziak C、Conradt D、Stolz A、Mattes R、Klein J(2005 年);《突光假单胞菌EBC191的腈水解酶基因的克隆和异源表达以及重组酶的生化特征分析》，Microbiology (微生物学)151 (Pt 11) :3639-486. Kaul P、Stolz A>Baner jee UC(2007年)；《用于对映体选择性腈水解的交联无定形腈水解酶聚集体》；Adv Synth Catal, 349 =2167-21767. Banerjee A、Dubey S、Kaul P、Barse B、Piotrowski M> Banerjee UC (2008年)；《恶臭假单胞菌的对映体选择性腈水解酶克隆、异源表达与生物反应器研究》；MolBiotechnol (分子生物技术)[印刷前电子发布]8. Luo H、Fan L、Chang Y、Ma J、Yu H、Shen Z (2008 年)；《玫瑰红红球菌 tgl_A6腈水解酶基因在大肠杆菌中的克隆、过表达及特征分析》；ApplBiochem Biotechnol (应用生物化学与生物技术》[印刷前电子发布]oxynitrilase9. Rustler S、Motejadded H、Altenbuchner J、Stolz A(2008 年)；《用于(S)-扁桃酸合成的荧光假单胞菌芳基乙腈水解酶与木薯(S)-醇腈醛化酶在巴氏毕赤酵母菌中的同时表达》；Appl Microbiol Biotechnol (应用微生物学生物技术)80 (I) :87-9710.采用腈水解酶制备2-羟基-4-甲基丁酸的工业规模方法，美国专利618035911. Ress- Loschke M. Friedrich T、Hauer B、Mattes R(1998 年)；Verfahrenzur Herstellung chiraler Carbonsauren aus Nitrilen mit Hilfe einer Nitrilaseoder Mikroorganismen, dieein Gen f iir eine Nilrilase enthalten.德国专利申请号DE 19848129A1
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权利要求
1.一种制备腈水解酶催化反应产物的方法，包括以下步骤 (i)提供表面含有所述腈水解酶的微生物和/或所述微生物的膜制剂； (ii)在与腈水解酶活性相容的条件下，使所述微生物和/或其膜制剂接触一种或多种腈水解酶的底物。
2.如权利要求I所述的方法，其中腈水解酶催化反应产物是羧酸，至少一种腈水解酶的底物是臆。
3.如权利要求I或2所述的方法，其中腈水解酶在微生物中重组表达，并转运至微生物表面。
4.如权利要求1-3任何一项所述的方法，其中腈水解酶融合于自身转运蛋白的转运结构域。
5.如权利要求1-4任何一项所述的方法，其中步骤(i)包括 (a)提供含有操作性连接于表达调控序列的核酸序列的微生物，所述核酸序列包含 (1)信号肽的编码部分； (2)要展示的重组腈水解酶的编码部分； (3)任选的蛋白酶识别位点的编码部分； (4)跨膜接头的编码部分；和 (5)自身转运蛋白转运结构域的编码部分； (b)培养该微生物,培养条件为能表达(a)所述的核酸序列，并在微生物表面展不该核酸序列的表达产物。
6.如权利要求5所述的方法，还包括步骤(c):制备(b)所述微生物的膜制剂。
7.如权利要求4-6任何一项所述的方法，其中自身转运蛋白的转运结构域选自下面的组，包括Ssp、Ssp-hl、Ssp_h2、PspA、PspB、Ssal、SphBl、AspA/NalP、VacA、AIDA-I> IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA、AutA、Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、Vat、EpeA、EatA、EspI、EaaA、EaaC、Pertactin、BrkA、Tef、Vag8、PmpD、Pmp20、Pmp21、IgAl 蛋白酶、App、Hap、rOmpA、rOmpB、ApeE> EstA、Lip-1、McaP、BabA> SabA> AlpA、Aae> NanB 及它们的变体。
8.如前述权利要求任何一项所述的方法，其中腈水解酶选自产碱杆菌属的腈水解酶、克雷伯菌属和酵母菌属的腈水解酶。
9.如前述权利要求任何一项所述的方法，其中微生物是革兰阴性细菌，特别是大肠杆菌。
10.如前述权利要求任何一项所述的方法，其中在pH约6.5-7. 5的范围内实施步骤(ii)。
11.如前述权利要求任何一项所述的方法，其中在有氧和/或氧化条件下实施步骤(ii)。
12.如权利要求2-11任何一项所述的方法，其中腈选自下组，包括扁桃腈、野黑樱苷、溴草臆、碘苯臆、氯二甲臆、茴香臆、3-溴-4-轻基节臆、3-氟-4-轻基节臆、4-轻基-3, 5- 二甲氧基节臆、节臆、苯基丙臆、苯基甘油臆、正丁臆、正戍臆、异丁臆和玻拍臆。
13.如前述权利要求任何一项所述的方法，其中腈水解酶催化反应产物是羧酸，产生的所述羧酸的对映体过量至少约为70%。
14.如前述权利要求任何一项所述的方法，还包括步骤(iii):回收步骤(ii)中所用的微生物。
15.一种在其表面展示重组腈水解酶的微生物。
16.一种包含获自权利要求15所述微生物的重组腈水解酶的膜制剂。
17.权利要求15所述微生物和/或权利要求16所述膜制剂在产生腈水解酶催化反应产物中的应用。
18.—种制备表面展示重组腈水解酶的微生物的方法，包括在所述微生物中引入核酸序列，所述核酸序列包含 (1)信号肽的编码部分； (2)要展示的重组腈水解酶的编码部分； (3)任选的蛋白酶识别位点的编码部分； (4)跨膜接头的编码部分；和 (5)自身转运蛋白转运结构域的编码部分，其中，所述核酸序列与表达调控序列操作性相连。
全文摘要
本发明涉及一种制备腈水解酶催化反应产物的方法，包括步骤(i)提供表面含所述腈水解酶的微生物和/或所述微生物的膜制剂；和(ii)在与腈水解酶活性相容的条件下使所述微生物和/或微生物膜制剂接触一种或多种腈水解酶的底物。本发明还涉及采用展示腈水解酶的全细胞生物催化剂或其膜制剂转化外消旋扁桃腈制备光学纯(R)-扁桃酸的方法。
文档编号C12N9/78GK102791855SQ201080061731
公开日2012年11月21日 申请日期2010年11月16日 优先权日2009年11月16日
发明者乔基姆·何塞, 克里斯蒂安·德策尔, 露丝·马斯 申请人:希鲁士股份有限公司与帕滕特有限合资公司