专利名称：一种利用离子液体预处理提高纤维素酶解产糖率的方法
技术领域：
本发明属于纤维素应用领域，具体涉及一种利用离子液体预处理提高纤维素酶解产糖率的方法。
背景技术：
随着不可再生能源资源石油、天然气、煤矿、金属矿藏等的急剧耗竭，能源和资源的供给与需求矛盾日益突出，新材料的开发与利用业已引起世人的关注。在自然界中存在着大量的可用的自然资源，纤维素就是一个例子。纤维素是自然界中最为丰富的可再生资源，可广泛应用于造纸、涂料等工业领域。借助生物技术将天然木质纤维素转化为具有高经济价值及社会价值的乙醇、乳酸等生物化工产品，是目前科学界和产业界研究的热点。天然纤维素的化学结构是由D-吡喃葡萄糖环彼此以β-1，4-糖苷键连接而成的螺旋状聚合物，分子中大量的羟基基团形成了数目庞大的氢键，这些氢键和分子间范德华力使纤维素形成致密的晶体结构，严重阻碍了化学试剂或生物酶与纤维素表面的有效接触和作用，使其具有在水和普通有机溶剂中都不溶解的性质，难以直接利用，这是纤维素开发应用的一大障碍。而对天然木质素进行预处理，打破其致密的结晶结构，可以实现纤维素的再生和功能化，促使晶态纤维素向无定形态纤维素转化，提高纤维素与酶的有效作用面积， 最终提高其产糖率，是有效利用天然纤维素材料的一条重要途径。离子液体(ionic liquids, ILs)是在室温或稍高于室温的温度下呈液态的离子体系，是一种熔点接近或低于100 °c的有机盐类，由于其独特的物理和化学性能如空气和水稳定性、低蒸汽压、与水易溶及高导电性等而在许多领域得到广泛的应用，被认为是能在许多领域代替易挥发的有机溶剂的绿色溶剂。2002年，有研究者首先发现了氯化1-丁基-3-甲基-咪唑([C^iim]Cl)离子液体是一种纤维素的优良溶剂，引发了利用离子液体预处理纤维素的研究。有文献选用一系列氯基和乙酸基的离子液体对木质纤维进行预处理，结果表明所有经过处理的纤维结晶度下降，更易和酶发生反应。但需注意的是，预处理后在底物中残留的离子液体会对纤维素酶活力有一定影响，还需用较系统的方法将其去除。纤维素酶是指能够水解纤维素β -1，4葡萄糖苷键，生成葡萄糖和纤维二糖的所有酶的总称。纤维素酶不是单一的一种酶，而是多组分的复合酶系，现今确定的纤维素酶主要含有三种组分内切型β-1，4葡聚糖酶也称Cx酶、CMC酶。它能以随机的形式在纤维素聚合物内部的非结晶区进行切割，对末端键的敏感性比中间键小。外切型β_1，4葡聚糖酶也称Cl酶、纤维二糖水解酶或微晶纤维素酶。它能从纤维素链的非还原性末端切割，生成可溶的纤维二糖。纤维二糖酶也称葡萄糖苷酶，它能水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下降， 这种酶的专一性比较差。目前，工业用纤维素酶的来源主要是好氧的丝状真菌产生的纤维素酶，如木霉 (Trichoderma)、曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)等。不同来源的纤维素酶系组成含量不同，对不同来源的天然纤维素酶解效率也不同，其中以里氏木霉、康宁木霉产生的纤维素酶应用最广，其优点是产量大、酶活高，易于提取和使用；缺点则是木霉属的纤维素酶系组成不理想，萄萄糖苷酶比较缺乏。这将导致纤维素酶解液中纤维二糖的积累，是酶解过程效率低的重要原因之一，可以通过添加外源的葡萄糖苷酶或多菌混合培养产酶可改善酶系的组成。纤维素酶与底物的相互作用是一个比较复杂的过程。酶的催化作用是酶与底物、 产物相互作用的过程，纤维素酶解糖化的速度和转化率与酶的活力、底物的性质以及产物的浓度等多个因素密切相关。温度对酶作用过程的影响非常显著，是酶解过程要考虑的重要参数。工业纤维素酶作用的最适宜温度一般在40°C 60°C，随酶的来源不同而异。但酶的最适温度不是酶的特征常数，对具体工艺中特定的酶来说，选择最佳温度需要实验确定。 另一个重要的参数是PH，酸性纤维素酶的最适pH在4. 8左右，中性纤维素酶在6. 8左右，根据选用的纤维素酶种类而定。而其它酶解条件，如酶载量及固液比等，也同样会影响酶解的效率及糖产率，进而影响工艺成本。近年来的相关报道主要集中在纤维素的预处理方法及酶解过程的条件优化方面， 寻求更加有效的预处理手段及提高酶活的方法，离子液体是近年来兴起的一种新型绿色纤维素溶剂，对于纤维素的开发研究有着重要的作用，而适应其处理过的纤维素底物的纤维素酶的研究会进一步促进纤维素的应用，其产物葡萄糖可应用于降解材料乳酸、生物燃料乙醇等领域，具有重要的价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用离子液体预处理提高纤维素酶解产糖率的方法。本发明提出的利用离子液体预处理提高纤维素酶解产糖率的方法，首先选用不同种类的离子液体分别对不同来源的天然木质素进行预处理，得到再生纤维素，然后在一定的酶解条件下进行酶解，并每隔一段时间进行取样测试，观察纤维素底物在整个酶解过程中的还原糖产率的变化情况及最终的糖产率，并与未经预处理的天然木质素产糖率相比， 研究离子液体预处理对木质素产糖率的影响。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案
为打破天然木质素的结晶结构，提高纤维素酶的接触面积及可反应性，首先对天然木质素进行离子液体预处理，具体步骤为
(1)将天然木质素粉末进行干燥处理，且其粒径控制在SOMffl 120Mffl;
(2)以离子液体为溶剂，在100 150°C、天然木质素粉末与离子液体的质量百分比为 5 20 %的条件下，将木质素粉末加入到离子液体内，施以搅拌，1 5小时内纤维素完全溶解于离子液体中，形成天然木质素的离子液体溶液；
(3)在木质素的离子液体中加入去离子水进行纤维素的再生，所加入的去离子水的体积相当于木质素离子液体溶液体积的5 20倍，然后过滤沉淀物，将该沉淀物反复清洗 1 5次后进行冷冻干燥，得到再生纤维素；
(4)然后称取一定量的再生纤维素，加入缓冲液，再生纤维素与缓冲液的重量比为1 5 1 :40，再按照5 30FPU/g底物的比例加入纤维素酶，进行20 80h酶解；在酶解过程中，每隔3 1 提取糖解液，并测定此时的糖产率，直至酶解反应完成，并测定最终糖产率。本发明中，预处理过程中所使用的天然木质纤维素为自然界中常见的固体废弃物，包括包括玉米秸杆木质素，稻草秸杆木质素、玉米芯木质素、木薯杆、稻壳或甘蔗渣等中任一种。本发明中，所使用的离子液体为1-丙烯基-3-甲基咪唑氯盐[AMIM]C1、3_甲基-N-丁基-吡啶溴盐[BMPy]Br、l-丁基-3-甲基咪唑氯盐[BMIM]C1、1_乙基-3-甲基咪唑四氟硼盐[EMIM]BF4或1- 丁基-3-甲基咪唑三氟甲基磺酸盐[BMIM]0TF等中任一种。本发明中，在酶解过程中，所使用的缓冲液PH值与所选用的纤维素酶的适用范围一致，以保证最大程度发挥酶活。所选用的纤维素酶为绿色木霉、里氏木霉、黑曲霉、康宁木霉或海枣曲霉等来源的纤维素酶系。本发明中，酶解过程中，搅拌速度为150 190r/min，在40 60°C内某一恒定温度下进行。本发明的有益效果在于本发明能够明显提高木质素的产糖率，有效提高纤维素酶的可及性及反应效率，使反应终期糖液达到可发酵水平，简化了整个工艺过程。
具体实施例方式下面通过实施例进一步说明本发明。实施例1
离子液体[AMIM]C1预处理过的稻草秸杆纤维素的产糖率。(1)离子液体[AMIM]C1预处理稻草秸杆纤维素
a)将稻草秸杆纤维素在100°C下干燥处理Mh，将其粒径公布控制在SOMffl 120Mm。b)准确称量5 g稻草秸杆和45 g离子液体[AMIM]C1，共同放入IOOml圆底烧瓶中，于130 °c密封，强烈机械搅拌池至纤维素完全溶解，此时溶液呈深棕色粘稠状。c)停止搅拌，并将所得的纤维素离子液体溶液用5倍于其体积的去离子水反复冲洗三次，最后得到白色沉降物，即再生纤维素，过滤后将产物冷冻干燥48 h研磨成粉末待用，并利用减压旋蒸回收离子液体。(2)利用里氏木酶对再生纤维素进行酶解
a)准确称量3 g再生稻草杆纤维素，置于250ml三角烧瓶中待用。再加入pH=4.8缓冲液60g，搅拌均勻后，按照15FPU/g底物的比例加入总酶活为45FPU的里氏木酶，密封后放入50°C，转速为170转/分的恒温振荡器中进行酶解。b)每隔3h，取ImL酶解液于离心管中，以5000rpm的转速离心5min，取上清液 0. 5mL，加入0. 5mL缓冲溶液和3mL DNS溶液(自配)，在沸水中进行共热反应lOmin，迅速冷却后定容至25ml盖塞混勻。以未加入纤维素酶的同条件溶液为空白样将分光光度计清零， 用10 mm比色杯，在分光光度计波长MOnm处测量吸光度，代入葡萄糖标准曲线中即可得葡萄糖含量。在反应后期，由于糖产率增长变缓，取样间隔时间延长到6 h、12 h、18 h。c) 72h后酶解反应完成，停止反应，并测定最终产糖率，其结果数据如下表所示。
时间/h3691224365472产糖率/%12. 8615. 4716. 0317. 0217. 3518. 1418. 5218. 98 实施例2
离子液体[BMPy]Br预处理过的稻草秸杆纤维素的产糖率
5(1)离子液体[BMPy] Br预处理稻草秸杆纤维素
a)将稻草秸杆纤维素在100°C下干燥处理Mh，将其粒径公布控制在80um 120Mm。b)准确称量5 g稻草秸杆和45 g离子液体[BMPy]Br，共同放入1OOml圆底烧瓶中，于130 °c密封，强烈机械搅拌池至纤维素完全溶解，此时溶液呈深棕色粘稠状。c)停止搅拌，并将所得的纤维素离子液体溶液用5倍于其体积的去离子水反复冲洗三次，最后得到白色沉降物，即再生纤维素，过滤后将产物冷冻干燥48 h研磨成粉末待用，并利用减压旋蒸回收离子液体。(2)利用里氏木酶对再生纤维素进行酶解
a)准确称量3 g再生稻草杆纤维素，置于250ml三角烧瓶中待用。再加入pH=4.8缓冲液60g，搅拌均勻后，按照15FPU/g底物的比例加入总酶活为45FPU的里氏木酶，密封后放入50°C，转速为170转/分的恒温振荡器中进行酶解。b)每隔汕，取ImL酶解液于离心管中，以5000rpm的转速离心5min，取上清液 0. 5mL，加入0. 5mL缓冲溶液和3mL DNS溶液(自配)，在沸水中进行共热反应lOmin，迅速冷却后定容至25ml盖塞混勻。以未加入纤维素酶的同条件溶液为空白样将分光光度计清零， 用10 mm比色杯，在分光光度计波长MOnm处测量吸光度，代入葡萄糖标准曲线中即可得葡萄糖含量。在反应后期，由于糖产率增长变缓，取样间隔时间延长到6 h、12 h、18 h。c) 72h后酶解反应完成，停止反应，并测定最终产糖率，其结果数据如下表所示。
权利要求
1.一种利用离子液体预处理提高纤维素酶产糖率的方法，其特征在于具体步骤如下(1)将天然木质素粉末进行干燥处理，且其粒径控制在SOMffl 120Mffl;(2)以离子液体为溶剂，在100 150°C、天然木质素粉末与离子液体的质量百分比为 5 20 %的条件下，将木质素粉末加入到离子液体内，搅拌，1 5小时内纤维素完全溶解于离子液体中，形成天然木质素的离子液体溶液；(3)在木质素的离子液体中加入去离子水进行纤维素的再生，所加入的去离子水的体积相当于木质素离子液体溶液体积的5 20倍，然后过滤沉淀物，将该沉淀物反复清洗 1 5次后进行冷冻干燥，得到再生纤维素，研磨成粉末待用；(4)称取一定量的再生纤维素，加入缓冲液，再生纤维素与缓冲液的重量比为1:5 1 40，再按照5 30FPU/g底物的比例加入纤维素酶，进行20 80h酶解；(5)在酶解过程中，每隔3 1 提取糖解液，并测定此时的糖产率，直至酶解反应完成，并测定最终糖产率。
2.根据权利要求1所述的利用离子液体预处理提高纤维素酶产糖率的方法，其特征在于步骤(1)中所述天然木质纤维素为玉米秸杆木质素，稻草秸杆木质素、玉米芯木质素、 木薯杆、稻壳或甘蔗渣中任一种。
3.根据权利要求1所述的利用离子液体预处理提高纤维素酶产糖率的方法，其特征在于步骤(2)中所述离子液体为1-丙烯基-3-甲基咪唑氯盐、3-甲基-N- 丁基-吡啶溴盐、 1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼盐或1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲基磺酸盐中任一种。
4.根据权利要求1所述的利用离子液体预处理提高纤维素酶产糖率的方法，其特征在于所述缓冲液的PH值与所选用的纤维素酶的适用范围一致，以保证最大程度发挥酶活。
5.根据权利要求1所述的利用离子液体预处理提高纤维素酶产糖率的方法，其特征在于步骤中所述纤维素酶为绿色木霉、里氏木霉、黑曲霉、康宁木霉或海枣曲霉中任一种。
6.根据权利要求1所述的利用离子液体预处理提高纤维素酶产糖率的方法，其特征在于步骤(5)中所述酶解过程中，搅拌速度为150 190r/min，40 60°C内某一恒定温度下进行。
全文摘要
本发明涉及一种利用离子液体预处理提高纤维素酶解产糖率的方法，本发明利用不同种类离子液体对不同来源的天然木质素进行预处理来提高其酶解产糖率。首先利用离子液体对天然木质素在一定温度及充分搅拌的情况下进行预处理，然后将再生纤维素从混合液中提取出来，并加以干燥。以再生纤维素为底物，在一定的温度、pH及浓度下，加入可以将其分解成还原糖的纤维素酶，最后生成为葡萄糖为主要含量的糖液。本发明能够明显提高木质素的产糖率，有效提高纤维素酶的可及性及反应效率，使反应终期糖液达到可发酵水平，简化了整个工艺过程。
文档编号C12P19/14GK102154412SQ20111000878
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月17日 优先权日2011年1月17日
发明者任杰, 张艳娟, 袁华 申请人:同济大学