专利名称：铂类药物疗效相关基因snp检测特异性序列和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及钼类药物疗效相关基因ERCC1、ERCC2、XRCCl和GSTPl的SNP检测的特异性序列和液相芯片。
背景技术：
自从1967年顺钼的抗癌活性被发现以来，钼类抗癌药物的研究和应用得到了迅速的发展。目前已发展出以卡钼为代表的第二代，和以奥沙利钼为代表的第三代钼类药物。 钼类是目前常用的广谱抗肿瘤药，已成为癌症化疗中不可缺少的药物。钼类药物的疗效虽得到广泛认可，但患者用药后药效的个体差异很大、且有不同程度的毒副作用。其副作用主要是消化系统毒性，常见为恶心、呕吐，还可有肾毒性、肝毒性和骨髓抑制，耳毒性和神经毒性较轻。钼类药物的抗肿瘤作用是通过作用于DNA，形成Pt-DNA结合物，导致DNA的链内和链间交联，从而抑制DNA的合成及复制。大量的临床研究已经证实，钼类药物的疗效/毒副作用与患者体内四个基因的单核苷酸多态性(SNP)关系密切，即ERCC1、ERCC2、XRCCl和 GSTPl。ERCCl和ERCC2都是DNA核苷酸切除修复途径的关键基因，XRCCl是DNA碱基切除修复途径中的重要因子。GSTPl是一种谷胱甘肽S转移酶，它通过将有毒物质的亲电子基团与谷胱甘肽结合，起到保护细胞大分子的作用。这四个基因通过参与DNA修复等生理过程，使受钼类化合物破坏的DNA回复正常或使DNA免受破坏，在肿瘤细胞中造成耐药，而在正常细胞中则能够减少毒副作用。因此，专家推荐患者在接受钼类化疗之前，进行相关的基因SNP检测，帮助临床医生根据患者的个体差异制定个体化用药方案。这样将明显提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。大量临床研究显示，最常见的造成这四个基因功能减弱的多态性位点分别是 ERCCl 的 C19007T 和 C8092A，ERCC2 的 A2282C, XRCCl 的 G1301A,以及 GSTPl 的 A1578G。在中国人群中，ERCC1-C19007T、ERCC1-C8092A、ERCC2-A2282C 和 XRCC1-G1301A 的基因分布频率分别约为21%、M%、5%和30% ；GSTP1-A1578G基因分布频率约21%。大量研究表明， 在ERCC1、ERCC2、XRCC1这三个基因中携有一个或以上功能减弱等位基因型的患者，在接受钼类化疗时，发生毒副作用的几率明显升高，以致治疗效果较差。而GSTP1-A1578G基因多态性位点的情况正好相反，遗传基因型为GA或GG的患者，在接受钼类化疗时，对钼类药物的反应率较高、有较好的疗效。因此，通过对这五个常见功能SNP位点进行检测，根据患者的基因型判断是否采用钼类药物或制定个体化用药方式，将能明显提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。目前已建立了若干以PCR为基础的检测基因单核苷酸多态性(SNP)的技术，如直接测序法，半定量PCR技术，PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测，以上技术具有灵敏度低，样品易污染、假阳性率高等缺点。普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。而聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分析技术和基于TaqMan技术的等位基因差异分析法一次只能进行一种SNP位点的检测，耗时费力；传统的固相芯片价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。基于芯片的原理，美国 Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex 阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。我们采用x-Taq液相芯片技术可以同时检测多个SNP位点，实现高通量快速简便化操作，大大提高了检测效率，在同类检测技术中处于领先地位。
发明内容
本发明的目的之一是提供与钼类药物疗效密切相关的ERCC1、ERCC2、XRCCl和 GSTPl基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于单项或者并行检测以下5个常见的SNP位点=ERCCl 的 C19007T 和 C8092A，ERCC2 的 A2282C, XRCCl 的 G1301A,以及 GSTPl 的 A1578G。一种钼类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，包括有1.针对每种型别的SNP位点分别设计的野生型和突变型特异ASPE引物对，每种 ASPE引物由3’端的针对目的基因SNP位点的特异性序列和5’端的tag序列组成，所述野生型及突变型特异性ASPE引物对分别选自=SEQ ID NO. 1及SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3及 SEQID NO. 4,SEQ ID NO. 5及 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7及 SEQ ID NO. 8、和 /或SEQ IDN0. 9 及 SEQ ID NO. 10 ；2.分别包被有特异的anti-tag序列1的微球，所述anti-tag序列能相应地与(1) 中所选tag序列互补配对；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 11 SEQ ID N0. 20中的序列；优选地，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；3.针对 ERCCl 基因的 C19007T、ERCC1 基因的 C8092A、ERCC2 基因的 A2282C、XRCC1 基因的G1301A、和/或GSTPl基因的A1578G SNP位点的目标序列的扩增引物。优选地，分别扩增出五个具有SNP位点的目标序列的引物选自SEQ ID N0. 21 SEQ ID N0. 30中的序列，即针对 C19007T 的 SEQ ID N0. 21 和 SEQ ID N0. 22，针对 C8092A 的 SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID N0. 24，针对 A2282C 的 SEQ ID N0. 25 和 SEQ ID N0.洸，针对 G1301A 的 SEQ IDN0. 27 和 SEQ ID N0. 28，针对 A1578G 的 SEQ ID N0. 29 和 SEQ ID N0. 30。本发明的另一目的是提供用于钼类药物疗效相关基因SNP检测的特异性序列，该序列特性强，能准确区分SNP的各种基因型。所述特异性序列为针对ERCCl基因的C19007T的SNP位点的SEQ ID N0. 31及 SEQ IDN0. 32、针对 ERCCl 基因的 C8092A 的 SNP 位点的 SEQ ID N0. 33 及 SEQ ID N0. 34、针对ERCC2基因的A2282C的SNP位点的SEQ ID N0. 35及SEQ ID N0. 36、针对XRCCl基因的G1301A 的 SNP 位点的 SEQ ID NO. 37 及 SEQ ID NO. 38、和 / 或针对 GSTPl 基因的 A1578G 的 SNP 位点的 SEQID NO. 39 及 SEQ ID NO. 40。本发明的主要优点在于1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。所制备的钼类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及 anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分SNP的各种
基因型。3.使用本发明所述的钼类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片的检测方法步骤简单，可通过一步多重PCR即可完成五个具有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次 PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合临
床需要。5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷， 同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例1钼类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片试剂盒，主要包括有一、特异性引物序列(ASPE引物)针对钼类药物疗效相关基因的各5个常见SNP位点分别设计特异性的引物序列。 ASPE弓丨物由Tag+特异性引物序列组成。ASPE引物序列如下表所示表IASPE弓丨物序列(Tag+特异引物)
权利要求
1.一种钼类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，包括有(1).针对GSTPl基因的A1578GSNP位点设计的野生型和突变型特异ASPE引物对，每种ASPE引物由3’端的针对目的基因SNP位点的特异性序列和5’端的tag序列组成，所述野生型及突变型特异性ASPE引物对为SEQ ID NO. 9及SEQ ID NO. 10 ；(2).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 19 SEQ ID NO. 20中的序列；(3).针对GSTPl基因的A1578GSNP位点的目标序列的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的钼类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，(3)中所述引物为针对 A1578G 的 SEQ ID NO. 29 及 SEQ ID N0. 30。
3.根据权利要求1所述的钼类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，(2)中所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。
4.根据权利要求3所述的钼类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。
5.一种钼类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有(1).针对每种型别的SNP位点分别设计的野生型和突变型特异ASPE弓丨物，每种ASPE 引物由3’端的针对目的基因SNP位点的特异性序列和5’端的tag序列组成，所述野生型及突变型特异性ASPE引物对为针对GSTPl基因的A1578G的SEQ ID N0. 9及SEQ ID N0. 10， 以及选自针对ERCCl基因的C19007T的SEQ ID NO. 1及SEQ ID N0. 2、针对ERCCl基因的 C8092A 的 SEQID N0. 3 及 SEQ ID N0. 4、针对 ERCC2 基因的 A2282C 的 SEQ ID N0. 5 及 SEQ ID N0. 6、和针对XRCCl基因的G1301A的SSEQ ID N0. 7及SEQ ID N0. 8中的一对以上；(2).分别包被有特异的anti-tag序列的10种微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列，所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对；所述 anti-tag 序列选自 SEQ ID NO. 11 SEQ ID N0. 20 中的序列；(3).扩增出具有需要检测的、相应SNP位点的目标序列的引物对针对GSTPl基因的A1578G的SEQ ID N0.四及SEQ ID N0. 30，以及选自针对ERCCl基因的C19007T的SEQ IDN0. 21 及 SEQ ID N0. 22、针对 ERCCl 基因的 C8092A 的 SEQ ID N0. 23 及 SEQ ID N0. 24、针对 ERCC2 基因 A2282C 的 SEQ ID N0. 25 及 SEQ ID N0. 26、和针对 XRCCl 基因的 G1301A 的 SEQ IDN0. 27 及 SEQ ID N0. 28 中的一对以上。
6.根据权利要求5所述的钼类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，(2)中所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。
7.根据权利要求6所述的钼类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。
8.一种用于钼类药物疗效相关基因SNP检测的特异性序列，其特征是，所述特异性序列包括针对GSTPl基因的A1578G的SNP位点的SEQ ID N0. 39及SEQ ID N0. 40。
9.根据权利要求8所述的钼类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述特异性序列还包括有针对ERCCl基因的C19007T的SEQ ID N0. 31及SEQ ID N0. 32、针对 ERCCl 基因的 C8092A 的 SEQ ID N0. 33 及 SEQ ID N0. 34、针对 ERCC2 基因的 A2282C 的 SEQ ID N0. 35 及 SEQ ID N0. 36、和 / 或针对 XRCCl 基因的 G1301A 的 SEQ ID N0. 37 及 SEQ ID N0. 38。
全文摘要
本发明公开了一种铂类药物疗效相关基因SNP检测特异性序列、液相芯片，所述液相芯片主要包括有选自SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4、SEQID NO.5及SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8、和/或SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10的野生型及突变型特异性ASPE引物对；分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的序列；扩增SNP位点的目标序列的引物。本发明所述检测液相芯片及检测方法的检测灵敏度高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
文档编号C12Q1/68GK102312007SQ20111030110
公开日2012年1月11日 申请日期2009年6月9日 优先权日2009年6月9日
发明者何嘉英, 杨惠夷, 许嘉森 申请人:广州益善生物技术有限公司