专利名称：一种rb1基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种RBl基因突变检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
视网膜母细胞瘤基因KRetinoblastomal，RBl)是人类第一个分离克隆的抑癌基因。因为该基因与视网膜母细胞瘤的发生密切相关，因此被命名为视网膜母细胞瘤基因。RBl基因是细胞周期的负调控因子，通过与转录因子结合调节细胞增殖和分化所需基因的表达，从而维持细胞生长发育的平衡。因此，该基因的功能与细胞周期、细胞衰老、细胞凋亡、细胞分化和生长抑制等有关。目前，对RBl基因突变进行检测和分析的方法很少，主要有直接测序法和单链构象多态性分析法(Single-Strand ConformationPolymorphism, SSCP),其中最常用的方法有PCR产物的SSCP分析法。SSCP分析法主要是通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离具有不同空间结构的单链DNA分子，并通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果，通过单链DNA带迁移率与正常对照的相对比，判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变，该方法简便、快速；但是，SSCP分析法并不能确定碱基突变的位置和类型，电泳条件要求严格，另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供RBl基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于单独或并行检测RBl基因三种常见基因型C1654T、C1666T和C1981T的野生型和突变型。实现上述目的的技术方案如下一种RBl基因突变检测液相芯片，包括有(A).针对RBl基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对C1654T位点的SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8 ;针对C1666T位点的SEQ ID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10 ;和 / 或针对 C1981T 位点的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID NO. 12 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 6 ；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 18，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
优选地，所述扩增引物为针对C1654T、C1666T位点的SEQ ID NO. 19及SEQ IDNO. 20 ;和 / 或针对 C1981T 位点的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22。优选地，所述ASPE引物为针对C1654T位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 7组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 8组成的序列；针对C1666T位点的由SEQ IDNO. 3和SEQ IDN0. 9组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 10组成的序列；和/或针对C1981T位点的由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 11组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ IDNO. 12组成的序列。本发明的另一目的是提供用于RBl基因突变检测的特异性引物。实现该目的的技术方案如下所述特异性引物序列为针对C1654T位点的SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8 ;针对C1666T 位点的 SEQ ID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10 ;和 / 或针对 C1981T 位点的 SEQ ID NO. 11 及SEQ IDN0. 12。本发明的主要优点在于1.本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的RBl基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。3.本发明的检测方法步骤简单，三种突变位点检测可通过一步PCR即可完成2条含有3个突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例1本实施例所述的RBl基因突变检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物 针对RBl基因三种常见基因型C1654T、C1666T和C1981T的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“ tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE弓丨物序列如下表所示
表IRBl基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种RBl基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有 (A).针对RBl基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对C1654T位点的SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8 ;针对C1666T位点的SEQID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10 ;和 / 或针对 C1981T 位点的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID NO. 12 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 6 ； (B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 18，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的RBl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对 C1654T、C1666T 位点的 SEQ ID NO. 19 及 SEQ ID NO. 20 ;和 / 或针对 C1981T 位点的 SEQIDNO. 21 及 SEQ ID NO. 22。
3.根据权利要求1所述的RBl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为针对C1654T位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 7组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ IDNO. 8组成的序列；针对C1666T位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 9组成的序列及由SEQID NO. 4和SEQ ID NO. 10组成的序列；和/或针对C1981T位点的由SEQ ID NO. 5和SEQID NO. 11组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 12组成的序列。
4.根据权利要求1所述的RBl基因突变检测液相芯片，其特征是， (A).所述ASPE引物为针对C1654T位点的由SEQID NO.1和SEQ ID NO. 7组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 8组成的序列；针对C1666T位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 9组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 10组成的序列；和针对C1981T位点的由SEQ IDNO. 5和SEQ ID NO. 11组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 12组成的序列； (B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 18，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).所述扩增引物为针对C1654T、C1666T位点的SEQID NO. 19及SEQ ID NO. 20 ；和针对 C1981T 位点的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22。
5.根据权利要求1-4任一项所述的RBl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。
6.用于RBl基因突变检测的特异性引物，其特征是，所述特异性引物序列为所述特异性引物序列为针对C1654T位点的SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8 ;针对C1666T位点的SEQID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10 ;和 / 或针对 C1981T 位点的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID NO. 12。
全文摘要
本发明公开了一种RB1基因检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为针对C1654T位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；针对C1666T位点的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10；和/或针对C1981T位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
文档编号C12Q1/68GK103031370SQ20111030194
公开日2013年4月10日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者许嘉森, 何嘉英, 陈家欣 申请人:广州益善生物技术有限公司