专利名称：一株乙炔雌二醇高效降解菌及其制备方法
技术领域：
本发明属于雌激素降解菌及其制备领域，特别涉及一株乙炔雌二醇高效降解菌及其制备方法。
背景技术：
随着环境分析技术的提高和人们环境意识的增强，合成雌激素作为一种新兴污染物日益受到人们的关注。虽然这类物质在环境中的浓度不高，但即使微量的雌激素类物质， 也会对环境及人类健康造成极大的危害作用。已报道的合成雌激素种类很多，乙炔雌二醇(17 α -ethynylestradiol, EE2)(分子结构如图1所示)作为许多避孕药的活性成分，近年来在世界各地的湖泊、河流甚至土壤中被频繁检测出来。然而乙炔雌二醇是芳香杂环化合物，目前传统的污水处理方法(如吸附、活性污泥、生物膜、紫外、光催化降解等方法)不能够有效去除，使其被频繁检出，且具有一定的生态毒性，是目前最受关注的雌激素类污染物之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株乙炔雌二醇高效降解菌及其制备方法，该降解菌可以有效地降解乙炔雌二醇，且易于灭活，该方法的种源易得且分离纯化方法简便快捷。本发明的一株乙炔雌二醇高效降解菌，该降解菌经16S rDNA序列测定，基因全序列如下TGCAGTCGACGGCAGCACGGGAGCAATCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACG TGCCCTGTCGTGGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGCGGGGGACCGT AAGGCCTCGCGCGATAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCAG TAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGA ATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTT GTCCGGAAAGAAATCCCTTGCCCTAATACGGCGGGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG CCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGT AAGACAGGCGTGAAATCCCCGAGCTCAACTTGGGAATGGCGCTTGTGACTGCAAGGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGG TAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGACGTC ACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAA CTAGTTGTTGGGGATTCATTTCTTCAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA TTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACC TTACCTACCCTTGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATCAGGTGCCCGAAAGGGAAAGTGGACACAGGTGCTGC ATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTGCTAC GCAAGAGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTAT GGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTGCGTACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACGCATCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCG CGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTGCCAGAAGTAGTTAGCCT AACCGCAAGGAGGGCGAT。菌株16S rDNA的基因全序列在NCBI在线BLAST比对程序与GENBANK中核酸数据进行比对分析，登录号为JN226398，鉴定为贪铜菌，其系统进化树见图2，同源性达到99%， 命名为贪铜菌(Cupriavidus) DE7。所述的贪铜菌(Cupriavidus) DE7为阴性革兰氏杆菌，好氧，菌体长度为 0.4-0. 8um，其电镜扫描图见图3。在固体培养基中是呈金黄，不透明，无光泽，表面低凸面， 圆形，边缘整齐，直径大小为1-2. 5mm的菌落。在无机盐培养基中的培养特征为乳白色悬浊液。该菌株在紫外线照射池后，均已失去活性。本发明的一株乙炔雌二醇高效降解菌的制备方法，包括将活性污泥经定向驯化培养后，通过富集分离和纯化，即得该乙炔雌二醇高效降解菌。所述的定向驯化培养为活性污泥按10%的接入量接种于无机盐培养基中，以梯度压力式驯化法驯化；其中乙炔雌二醇浓度依次为3、5、10、15、20、25、3011^/1，在301、1601·/ min, 250mL锥形瓶中装填量IOOmL的条件下进行驯化培养，总驯化时间为2个月。上述的无机盐培养基为K2HPO4 4. 35g, KH2PO4 1. 7g，NH4Cl 2. lg，MgSO4 0. 2g， MnSO4O. 05g, FeSO4 · 7H20 0. Olg, CaCl2 · 2H20 0. 03g,蒸馏水 IOOOmL, pH = 6. 8 7. 0。所述的富集分离和纯化为将取驯化后的样品于8000r/min的转速下离心5分钟， 取上层水样作KT1 10_6梯度稀释，每种稀释浓度分别取ImL菌液于培养皿内，倒入富集培养基后将培养皿放在桌上，来回转动培养皿后，将培养皿倒置于30°C培养箱中培养48h ； 挑取形态清晰的单一菌落，编号，在富集培养基上划线，将培养皿倒置于30°C培养箱中培养 48h，再观察结果；反复几次，并在电子显微镜下观察，确保是纯的单一菌株后，将分离出的菌种接种到斜面培养基上，4°C下保存。上述的富集培养基和斜面培养基相同，其分为液体培养和固体培养基，其中液体培养基的组成为牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g, NaCl 5. 0g，蒸馏水lOOOmL，pH = 7. 0 7. 2 ； 固体培养基为在上述液体培养基中加入18g/L的琼脂粉。本发明的贪铜菌(CupriaViduS)DE7不仅可以利用乙炔雌二醇作为唯一的碳、氮源进行新陈代谢，而且能在相对较高浓度的乙炔雌二醇基质条件下(乙炔雌二醇浓度约为 25mg/L)良好生长。它对乙炔雌二醇的去除主要通过生物吸附和生物降解两个阶段，从而对乙炔雌二醇达到很高的去除率(80%以上)。同时适量的外加碳源不但不会影响本发明的菌株对乙炔雌二醇降解作用，而且对其降解具有促进作用。由于乙炔雌二醇为四环分子结构，并以苯环、芳香环为骨架，属于难生物降解的有机物，生物法无法有效地去除水中乙炔雌二醇，本发明提供了从城市污水处理厂二沉池的活性污泥中，通过驯化、富集分离、纯化等生物技术，而得到的一株对乙炔雌二醇具有高效降解作用的细菌；该菌株是废水处理系统中的优势菌株，因此该菌株能适应复杂的实际条件，这使得该菌的应用前景广阔。本发明所提供的贪铜菌(Cupriavidus)DE7质粒检测结果表明该菌不携带质粒， 因此降解基因编码于染色体上。这一特性使得在利用质粒进行水平基因转移的过程中，避免了质粒的不相容性，是构建具备多种降解能力的基因工程菌的良好材料。有益效果(1)本发明所提供的贪铜菌(Cupriavidus)DE7的种源为城市污水处理厂的活性污泥，种源易得，分离纯化方法简便快捷；(2)本发明所提供的贪铜菌(Cupriavidus)DE7可以有效地降解乙炔雌二醇，对乙炔雌二醇的降解率可达80%以上；且对一般抗生素均无抗性，易于灭活，保证了使用的生态安全性。
图1为乙炔雌二醇的分子结构式；图2为贪铜菌(CupriaViduS)DE7的系统进化树；图3为贪铜菌(Cupriavidus) DE7的扫描电镜。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1(1)取自城市污水处理厂二沉池的活性污泥按10%的接入量接种于无机盐培养基中，其中无机盐培养基为 K2HPO4 4. 35g, KH2PO4 1. 7g，NH4Cl 2. lg，MgSO4 0. 2g，MnSO4 0. 05g, FeSO4 · 7H20 0. Olg, CaCl2 · 2H20 0. 03g,蒸馏水 IOOOmL, pH = 6. 8-7. 0。以梯度压力式驯化法驯化，乙炔雌二醇浓度为3、5、10、15、20、25、3011^/1，在301、16017^11，2501^锥形瓶中装填量IOOmL的条件下进行驯化培养，总驯化时间为2个月；(2)取驯化2个月后的样品，静置30分钟，取上层水样lmL，作KT1 10_1(1梯度稀释。每种稀释浓度分别取ImL菌液于培养皿内，倒入富集培养基后将培养皿放在桌上，来回转动培养皿后，将培养皿倒置于30°C培养箱中培养48h。挑取形态清晰的单一菌落，编号， 在富集培养基上划线，将培养皿倒置于30°C培养箱中培养48h，再观察结果。反复几次，并在电子显微镜下观察，确保是纯的单一菌株后，将分离出的菌种接种到斜面培养基上，4°C 下保存于冰箱中待后续进行降解试验。其中富集培养基及斜面培养基为牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g,NaCl 5. 0g，蒸馏水1000mL，pH = 7. 0 7. 2 ；固体培养基中加入18g/L的琼脂粉。(3)分别挑取一定量的经分离纯化后的单一菌落于各自的无机盐培养基中，各无机盐培养基中均含有25mg/L的乙炔雌二醇，在30°C、160r/min，250mL锥形瓶中装填量 IOOmL的条件下进行培养，培养时间为72h。培养后通过电子显微镜观察细菌生长情况以及测定溶液中乙炔雌二醇的剩余浓度，从而确定出对乙炔雌二醇具有高效降解作用的菌株。本发明所提供的一株乙炔雌二醇高效降解菌在初始pH值为7左右，温度为30°C， 振荡速率为160r/min，250mL锥形瓶的装液量为IOOmL的条件下，菌株接种量为1 %，乙炔雌二醇初始浓度为25mg/L，培养时间72h，乙炔雌二醇的降解率高达84. 6%。
权利要求
1.一株乙炔雌二醇高效降解菌，该降解菌经16S rDNA序列测定，基因全序列如下TGC AGTCGACGGCAGCACGGGAGCAATCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCTGTCGT GGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGCGGGGGACCGTAAGGCCTCGCG CGATAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTG AGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAA TGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGA AATCCCTTGCCCTAATACGGCGGGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGACAGGCGT GAAATCCCCGAGCTCAACTTGGGAATGGCGCTTGTGACTGCAAGGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCAC GTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGACGTCACTGACGCTCA TGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGG GGATTCATTTCTTCAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAA AGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCT TGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATCAGGTGCCCGAAAGGGAAAGTGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGT CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTGCTACGCAAGAGCACT CTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTT CACACGTCATACAATGGTGCGTACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACGCATCGTAGTC CGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACG TTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGA GGGCGATo
2.根据权利要求1所述的一株乙炔雌二醇高效降解菌，其特征在于其菌体长度为 0. 4 0. Sum ；菌落直径大小为1-2. 5mm,圆形，边缘整齐，表面低凸面，无光泽，呈金黄色，不透明，革兰氏染色均为阴性。
3.—株乙炔雌二醇高效降解菌的制备方法，包括将活性污泥经定向驯化培养后，通过富集分离和纯化，即得该乙炔雌二醇高效降解菌。
4.根据权利要求3所述的一株乙炔雌二醇高效降解菌的制备方法，其特征在于所述的定向驯化培养为活性污泥按10%的接入量接种于无机盐培养基中，以梯度压力式驯化法驯化；其中乙炔雌二醇浓度依次为3、5、10、15、20、25、3011^/1，在301、16017^11，2501^锥形瓶中装填量IOOmL的条件下进行驯化培养，总驯化时间为2个月。
5.根据权利要求4所述的一株乙炔雌二醇高效降解菌的制备方法，其特征在于所述的无机盐培养基为 Κ2ΗΡ044· 35g, KH2PO4 1. 7g，NH4Cl 2. lg，MgSO4 0. 2g，MnSO4 0. 05g， FeSO4 · 7H20 0. Olg, CaCl2 · 2H20 0. 03g,蒸馏水 IOOOmL, pH = 6. 8 7. 0。
6.根据权利要求3所述的一株乙炔雌二醇高效降解菌的制备方法，其特征在于所述的富集分离和纯化为将取驯化后的样品于8000r/min的转速下离心5分钟，取上层水样作 ΙΟ"1 10_6梯度稀释，每种稀释浓度分别取ImL菌液于培养皿内，倒入富集培养基后将培养皿放在桌上，来回转动培养皿后，将培养皿倒置于30°C培养箱中培养48h;挑取形态清晰的单一菌落，编号，在富集培养基上划线，将培养皿倒置于30°C培养箱中培养48h，再观察结果；反复几次，并在电子显微镜下观察，确保是纯的单一菌株后，将分离出的菌种接种到斜面培养基上，4°C下保存。
7.根据权利要求6所述的一株乙炔雌二醇高效降解菌的制备方法，所述的富集培养基和斜面培养基相同，其分为液体培养和固体培养基，其中液体培养基的组成为牛肉膏3. Og, 蛋白胨10. 0g, NaCl 5. 0g，蒸馏水lOOOmL，pH = 7. 0 7. 2 ；固体培养基为在上述液体培养基中加入18g/L的琼脂粉。
全文摘要
本发明涉及一株乙炔雌二醇高效降解菌及其制备方法，该菌株的菌体长度为0.4～0.8um；菌落直径大小为1-2.5mm，圆形，边缘整齐，表面低凸面，无光泽，呈金黄色，不透明，革兰氏染色均为阴性；其制备方法包括将活性污泥经定向驯化培养后，通过富集分离和纯化，即得该乙炔雌二醇高效降解菌。本发明的乙炔雌二醇高效降解菌可以有效地降解乙炔雌二醇，对乙炔雌二醇的降解率可达80％以上，且对一般抗生素均无抗性，易于灭活，保证了使用的生态安全性；本发明的乙炔雌二醇高效降解菌的种源易得，分离纯化方法简便快捷。
文档编号C12N1/20GK102352336SQ20111032951
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月26日 优先权日2011年10月26日
发明者丁丽娜, 刘冲, 刘鹏程, 夏昆, 孙彦, 张泽光, 肖斌, 陈东辉, 韩潇, 黄敏, 黄满红 申请人:东华大学