专利名称：油棕猝倒病菌荧光定量pcr检测试剂及检测试剂盒和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及病原真菌的检测技术，具体涉及涉及油棕猝倒病菌荧光定量PCR检测试剂及检测试剂盒和应用。
背景技术：
油棕猝倒病菌G0FiAi^B印^^论/^)，又称华丽腐霉，是油棕上的一种重要病害，该病菌寄主范围很广，除侵染油棕(^/aeis^/i/^e/^is)以外，还能够侵染玉米^彻 ^^)、向日胃(JIe 1 ianthusanriuuS、、大轰(Mordeumvulgare.)、黄 /R (Cucumissativus)> 番薯(Ipomoeaba ta tas )、zj、麦(Tri ticumaes ti vum )、香豆(Viciafaba )、豆工豆(Vignasinensis )、
(.Capsicum spp. )> {Nautilocalyxlynchei)>^K^MM {Pelargonium spp.)、秋海棠属(Begviiia spp.)等250余种植物，引起寄主幼苗整株失水萎蔫及根部、茎基部、切口变褐腐烂与皮层脱落等症状。目前，该病菌主要分布在比利时、法国、德国、意大利、荷兰、日本、坦桑尼亚、刚果和美国的夏威夷、弗罗里达、宾夕法尼亚州，国内台湾、海南曾有报道，但其他地区未见发生报道，为我国进境植物检疫性有害生物。油棕猝倒病菌的检测方法主要包括传统的形态学特征结合生理生化性状的生物学鉴定和特异性引物PCR、核糖体DNA序列分析、RFLP等。生物学鉴定方法耗工费时，而且某些形态特征不稳定，可能退化或消失，并且油棕猝倒病菌为异宗配合型，单性培养不能产生有性器官，更增加了其鉴定难度；Wang等研制的特异性引物PCR灵敏度不是很高，无法检测较低含量的DNA样品；核糖体DNA序列分析，虽然获得生物信息量大，但是实验操作繁琐，检测周期长；RFLP可省去序列分析中许多繁琐工序，但是需要进行多种酶切也费时费工，并且以上的分子检测方法都要进行电泳等PCR后处理，接触有毒试剂溴化乙锭，还易发生交叉污染而造成假阳性结果。荧光定量PCR (Real-time fluorescent PCR)是近几年发展起来的PCR技术与荧光检测相结合的方法，其原理是使用能特异标记核苷酸序列的荧光物质，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，具有检测周期短、特异性与灵敏度高以及无需PCR后处理等优点。以TaqMan水解探针为例，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通常状态下，荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移现象，荧光基团的荧光被淬灭基团吸收。当PCR进入退火阶段时，荧光探针特异的结合在两条引物之间，在延伸阶段被聚合酶的5'端外切酶活性切开。荧光基团与淬灭基团分离，仪器检测出荧光。由于荧光信号伴随着PCR模板的扩增而增长，因此可以根据荧光信号是否增长来确定模板是否扩增。荧光PCR仪在反应过程中连续的检测荧光信号的变化，当荧光信号增强到某一阈值时，此时的循环次数(Ct)就被记录下来。该Ct值与反应体系中起始模板量的对数值有严格的线性关系。因此，除了可定性确定反应体系中是否含有目标DNA之外，还可以对反应体系中的模板DNA进行相对定量。因此，研究建立特异、敏感、可对低含量A 论直接进行检测的方法，在检疫、诊断、分子流行病学研究等方面具有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种对油棕猝倒病菌具有特异性高、敏感性强，定量和快速检测的荧光定量PCR检测试剂。本发明还提供了含有该检测试剂的检测试剂盒和应用。本发明系选择油棕猝倒病菌ITS区保守片段为靶目标，应用primer Express 5. 0软件，设计合成引物和探针。将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最合适的引物和探针。本发明所述的油棕猝倒病菌荧光定量PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为94bp，一对特异性引物序列pyspF :5’ -ttaaatggacagggtctttc tat-3，禾口 pyspR :5，-tgccgaagtc gccaaaag-3，，特异性探针序列 pyspT 5' -FAM-cgagcaccac acttcacaca g_TAMRA_3，0本发明所述的油棕猝倒病菌荧光定量PCR检测试剂的引物和探针制备
一、选择油棕猝倒病菌ITS区保守片段为靶目标，该保守片段的扩增目标核苷酸序列如 SEQ ID NO 4 所示；
二、应用primerExpress 5. 0软件，设计合成引物和探针；
三、引物和探针的合成采用β—乙腈磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；引物和探针由上海生工合成；
四、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光基团为TAMRA ；荧光报告基团FAM也可以用ΤΕΤ、VIC、JOE等发光基团代替；
五、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探
针；
六、经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估，得到扩增效率和特异性好的所述的引物和所述的探针。由本发明的油棕猝倒病菌荧光定量PCR检测试剂组成的检测试剂盒，由下述组份组成CTAB提取液(溶液1)30 mLX 2瓶，该CTAB提取液为含有终浓度为0. 7mol/L的NaCl、终浓度为100mmol/L、pH8. 0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(1Tris-HCl )、终浓度为20mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、终浓度为10g/L的聚乙烯吡咯烷酮360 (PVP-360)，终浓度为20g/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积终浓度为洲(V:V)的β-巯基乙醇的水溶液，含有浓度都为1 μ mol/L的所述引物和浓度为0. 4 μ mol/L的所述探针的2 X —步荧光定量PCR缓冲液(溶液II )1.25 mL,浓度为5U/yL的Taq DNA聚合酶(溶液III) 50 μ L，灭菌去离子水(溶液IV) 1. 25 mLX2支，含有油棕猝倒病菌、P. splendent)阳性DNA的阳性对照液(溶液V)50 μ L，不含有A splendens阳性DNA的阴性对照液(灭菌去离子水，溶液VI)50 μ L，含有浓度为IOOng/ μ L的P. splendens阳性DNA的定量标准液(溶液VII) 25 μ L。一步荧光定量PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶均购于TAKARA公司。阳性对照液和定量标准液是根据CTAB法提取的油棕猝倒病菌DNA配制的。用本发明的油棕猝倒病菌荧光定量检测试剂盒检测油棕猝倒病菌的方法，其步骤为
1)总DNA提取取经干燥的菌丝0. 5g，放入1. 5mL浸在液氮里的离心管中，用塑料杵碾碎；再加入600yL CTAB提取液，65°C水浴30min，不时颠倒混勻，10000 r/min离心5min ；取上清，加入该上清等体积的氯仿和异戊醇混合液，颠倒离心管至形成乳浊状，4°C IOOOOrpm离心5min，所述氯仿和异戊醇混合液中氯仿与异戊醇体积比为1 ；取上清于新的1. 5mL离心管，加入冰冷乙醇和浓度为3 mol/L、PH为6. 0的醋酸钠(NaAc)溶液，所述醋酸钠溶液的体积为该上清体积的1/10，所述冰冷乙醇的体积为该上清体积的2. 5倍，颠倒混勻后，置于-20°C保存30 min,4°C 10000 rpm离心lOmin，弃上清，用质量浓度为70%的乙醇漂洗沉淀二次，晾干后，加入100 μ L灭菌去离子水溶解沉淀，得到样品DNA，4°C保存备用；
2)PCR反应反应体系25 μ L 含有浓度都为1 μ mol/L的所述引物和浓度为0. 4 μ mol/L的所述探针的2 X —步荧光定量PCR缓冲液12.5 μ L，浓度为5U/μ L的Taq DNA聚合酶0. 5 μ L，样品DNA 0. 5 μ L，灭菌去离子水补足余量；反应参数50°C预热2 min ；95°C预变性10 min ；95°C 15s,60°C 1 min，40个循环；PCR反应中若样品DNA有荧光信号则为油棕猝倒病菌；同时用阳性对照液或阴性对照液替代样品DNA进行PCR反应，可以进一步定性比较分析，用定量标准液替代样品DNA进行PCR反应，可以进行样品DNA的回归曲线与根据定量标准液10 一 1 10 一7倍稀释的回归曲线比对，作出样品DNA定量分析。本发明的油棕猝倒病菌荧光定量PCR检测试剂是将PCR技术与荧光检测相结合，构建并筛选出上述扩增效率和特异性好的一对引物和一条探针，克服了常规PCR费时、易污染以及扩增后需电泳检测等缺点，可对样品中的油棕猝倒病菌进行快速准确的定性与定量检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、重复性好等优点。具体优点如下
1、本发明与常规PCR的检测试剂相比，具有特异、敏感的优点；可对样品中低含量(可以8倍稀释)的代论/74隐症或带菌寄主进行准确检测，是一种非常适合八splendens检测的方法；
2、本发明与常规PCR的检测试剂相比，具有适用范围广，使用安全的优点；可对植株中的八577^/76/^进行快速检测，适用范围广；本发明克服了常规PCR的产物须电泳检测、接触有毒试剂的缺点，降低了生物安全隐患，提高了使用安全性；
3、本发明与常规PCR的检测试剂相比，具有检测量大和快速检测的优点；可同时进行大量样品检测，具有高通量性，可减少DNA或PCR产物污染的风险；常规PCR的检测时间一般6小时以上，本发明无需扩增后的电泳分析，样品检测时间在4小时之内；
4、与常规PCR相比，荧光定量PCR作出一个定量的、客观的估计，判断出阳性、阴性和可疑结果，Ct值为40.0可确定为阳性和阴性的临界值。更重要的是荧光定量PCR特别适用于带菌量少，难以分离培养的样品中病菌的快速检测；
5、本试剂所组成的试剂盒可在收到样品后4小时之内作出定性、定量检测结果。用该荧光定量PCR试剂盒检测P. splendens是一种的特异、敏感和稳定的检测方法。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。1、设计引物和探针
本发明选择油棕猝倒病菌ITS区保守片段为靶目标，通过GenBank中报道的八splendens及近似种ITS序列进行同源性分析比较，选定油棕猝倒病菌ITS区保守片段(94bp)，应用primer ExpreSS5. 0软件，设计引物和探针。引物和探针的合成采用β —乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成探针，合成同时进行两端荧光标记，探针5'端标记的荧光报告基团是FAM，3'端标记的是不发荧光的淬灭基团TAMRA。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，确定扩增效率和特异性最好的一对引物和一条探针，引物序列分别如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示，探针序列如SEQ ID NO 3所示，扩增目标片段长度为94bp，其序列如SEQ ID NO 4所示。
2、标准化试剂盒组份(25 μ L反应X 100次)。
溶液I30mLX2 瓶溶液II1. 25mL溶液III50 μ L溶液IV1. 25mLX2 支溶液V50 μ L溶液VI50 μ L溶液VII25 μ L3、CTAB 法 DNA 提取
取油棕猝倒病菌菌丝0. 5g放入1.5mL浸在液氮里的离心管中，用塑料杵碾碎，加入600 μ L CTAB提取液，65°C水浴30 min，10000 r/min离心5min，取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液(ν v=24 1 )，颠倒混勻，40C 10000 rpm离心5min,取上清于新的离心管，加入该上清1/10体积的NaAc溶液(3 mol/L, pH 6.0)和该上清2. 5倍体积的冰冷乙醇(饱和)，置于-20°C保存30min ;4°C 10000 rpm离心lOmin，弃上清，用质量浓度为70 %乙醇漂洗沉淀二次，晾干后，加入100 μ L灭菌去离子水溶解沉淀，得到样品DNA或阳性对照及配成浓度为lOOng/μ L定量标准液，4°C保存备用；该CTAB提取液中NaCl的终浓度为0. 7mol/L、Tris-HCl (pH8. 0)的终浓度为 100mmol/L、EDTA 的终浓度为 20mmol/L、PVP-360 的终浓度为10g/L，CTAB的终浓度为20g/L和β -巯基乙醇的体积终浓度为m (ViV)04、尸.spIendens荧光定量PCR扩增
P. spIendens荧光定量PCR采用25 μ L体积反应体系，在ΑΒΙ7900型荧光定量PCR仪中，反应体系为溶液1112. 5 μ L，溶液II10. 5 μ L，溶液V或溶液VI或溶液VII或DNA样品0. 5μ L，灭菌去离子水补足余量，按下列反应参数进行PCR反应50°C预热2 min ；95°C预变性IOmin ;95°C 15s,60°C 1 min，40个循环；用溶液V和溶液VI，按上述反应体系和反应参数对设计的多对引物和探针最佳配对筛选实验，对筛选的引物和探针的浓度进行精确筛选，以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值(△ to)。每次检测时，每个样品检测做3管平行试验。在阴性对照为阴性、阳性对照为阳性时，整个试验有效，结果本发明的一对特异性引物和一条特异性荧光探针为Ct值低、灵敏度高，为合适的引物和探针。每个样品须作多个备份，以进行稳定性、重复性试验。5、P.印^^论/^荧光定量PCR的特异性和敏感性试验采用近似种的刺腐霉Aspinosum、 宽雄腐霉A dissotocum、异宗腐霉P. heterothal 1 ium、钟器腐霉P. vexans、畸雌腐霉A irregulare、终敬腐霉R WiifiK 、侧雄腐霉A paroecandram、HU霉P.aphani derma turn ^P. sylvaticum^P. takayamanum、P. a t tran theridium 以及疫霉属烟草、良霉Phytophthora nicotianaePhytophthora palmivora 和一些常见的根链格椒 Alternaria radicina > ^ ! Bo trytis cinerea > ttipt^ifelf lif Bacillus subtil is的DNA样品与代印^^论/^菌株的DNA样品进行特异性比较检测。并将A splendensi株的DNA样品进行10倍系列稀释，对上述菌株的DNA样品进行常规PCR检测(常规方法)和按上述步骤4反应体系及相同条件下进行荧光定量PCR检测，比较它们的敏感性，常规PCR采用的引物与荧光定量PCR的引物一致；结果本发明的一对特异性引物和一条特异性荧光探针只有A 论flS菌株产生荧光信号，可以对8倍稀释反应有效，因此特异性强、灵敏度尚。6.Λ splendens荧光定量PCR的稳定性和重复性试验在评估荧光定量PCR检测油棕猝倒病菌方法的重现性、稳定性时，用阳性样品和阴性样品，在按上述步骤4反应体系及相同条件下，反复进行荧光定量PCR检测，每次试验的每个样品做6个平行的反应管，重复12次；因此本发明的一对特异性引物和一条特异性荧光探针稳定性和重复性好。7、油棕猝倒病菌定量标准液的制备、标准曲线的建立以及样品中油棕猝倒病菌含量的计算用CTAB法提取油棕猝倒病菌的DNA，用分光光度计测定其OD26tl值来进行DNA模板定量，OD260值为1相当于50 μ g/mL双链DNA。采用灭菌去离子水，把提取得到的DNA稀释定量到100 ng/yL。对该标准品进行10倍系列稀释，得到10 — 1 10 — 7倍稀释的DNA模板用于荧光定量PCR扩增(按上述步骤4反应体系及反应条件)，以模板浓度的对数值为X轴，Ct值为Y轴作回归曲线并得出回归方程。根据结果换算，可从未知样品的Ct值得出其含有油棕猝倒病菌的DNA含量。8、引物和探针及其浓度的筛选选择引物、探针、模板的最佳浓度配比，获得荧光定量PCR反应的最低Ct值和最高Afo1，提高扩增效率和敏感性。将引物浓度从0. lymol/L lymol/L以0. 1 μ mol/L递增，确定引物最佳终浓度。探针浓度从0. 2 μ mol/L 1 μ mol/L以0. 1 μ mol/L递增，确定探针最佳终浓度。结果是25 μ L反应体系中引物终浓度为0. 5 μ mol/L,探针终浓度为0. 2 μ mol/L较好。9、对样品的检测
对供试样品进行荧光定量PCR检测，结果表明，阳性样品均具有典型的扩增曲线，Ct值小于35. 0，阴性对照及阴性样品均无典型扩增曲线，也无Ct值。三个平行试验的结果稳定一致。证明荧光定量PCR检测P. splendens的特异性强、敏感度高和重复性好。9. 1 总 DNA 提取
(1)取经干燥的菌丝0.5g，放入1.5 mL浸在液氮里的离心管中，用塑料杵碾碎；
(2)加入600yL溶液I，65°C水浴30min，不时颠倒混勻，10 000 r/min离心5 min ；
(3)取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(V:V=24:1)，颠倒离心管至形成乳浊状不很快分层，4°C 10 000 rpm 离心 5 min ；
(4)取上清于新的1.5 mL离心管，加入该上清体积1/10的NaAc (3 mol/L,pH 6. 0)和2. 5倍的冰冷乙醇，颠倒混勻后，置于-20°C保存30 min。4°C 10000 rpm离心10 min，弃上清；
(5)用70%乙醇漂洗沉淀二次，晾干后，加入100 μ L灭菌去离子水溶解沉淀，4°C保存9. 2PCR 反应
(1)25μ L反应体系溶液II12. 5 μ L，溶液II10. 5 μ L，样品DNA0. 5 μ L，灭菌去离子水补足余量；同时设阳性对照和阴性对照25 μ L反应体系2管；
(2)定量也用标准品进行稀释后进行PCR反应制作标准曲线，标准品至少7个稀释度。9.3扩增在ΑΒΙ7900型荧光定量PCR仪中，按下列反应参数进行50°C预热2min ;95°C预变性 10 min ；95°C 15s，60°C 1 min，40 个循环。
9. 4结果分析和判定
(1)结果分析条件设定
阈值线设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准；
(2)质控标准
阴性对照无Ct值，并且无典型扩增曲线。阳性对照的Ct值应小于35. 0，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照扩增曲线基本重合，特别是在荧光临界值(Ct值)附近。否则，此次实验视为无效。定量用的标准品扩增曲线出现典型的扩增曲线，指数区较明显，7个点具良好的线性范围，平台区汇于一起，相关系数在0. 99以上；
(3)结果描述及判定
阴性无Ct值或无扩增曲线，表示样品中无油棕猝倒病菌；
阳性Ct值应小于等于35. 0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在油棕猝倒病菌；有效原则Ct值在35. (Γ40. 0的样本建议重做。重做结果无Ct值或无典型扩增曲线判为阴性，否则判为阳性；
定量样品DNA的回归曲线与根据标准品的回归曲线比对，作出样品DNA定量。
权利要求
1.油棕猝倒病菌荧光定量PCR检测试剂，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为94bp，其特征在于该一对特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO :2所示，该特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，该特异性探针的5'端标记有荧光报告基团FAM，3'端标记有不发荧光的淬灭基团TAMRA，扩增目标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。
2.由权利要求1所述的油棕猝倒病菌荧光定量PCR检测试剂组成的试剂盒，其特征在于由下述组份组成CTAB提取液30mLX2瓶，含有浓度都为1 μ mol/L的所述引物和浓度为0. 4 μ mol/L的所述探针的2 X —步荧光定量PCR缓冲液1. 25mL,浓度为5U/ μ L的TaqDNA聚合酶50 μ L，灭菌去离子水1. 25 mLX 2支，含有油棕猝倒病菌阳性DNA的阳性对照液50μ L，不含有油棕猝倒病菌阳性DNA的阴性对照液50μ L，含有浓度为lOOng/μ L的油棕猝倒病菌阳性DNA的定量标准液25 μ L，所述CTAB提取液为含有终浓度为0. 7mol/L的NaCl、终浓度为lOOmmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、终浓度为20mmol/L的乙二胺四乙酸、终浓度为10g/L的聚乙烯吡咯烷酮360，终浓度为20g/L的十六烷基三甲基溴化铵和体积终浓度为21的β -巯基乙醇的水溶。
3.利用权利要求2所述的油棕猝倒病菌荧光定量检测试剂盒检测油棕猝倒病菌的方法，其特征在于步骤为1)总DNA提取取经干燥的菌丝0.5g，放入1. 5mL浸在液氮里的离心管中，用塑料杵碾碎；再加入600 μ L CTAB提取液，65°C水浴30min，不时颠倒混勻，10000 r/min离心·5min;取上清，加入该上清等体积的氯仿和异戊醇混合液，颠倒离心管至形成乳浊状，4°C、IOOOOrpm离心5min，所述氯仿与异戊醇混合液中氯仿和异戊醇体积比为Μ: 1 ；取上清于新的1. 5mL离心管，加入冰冷乙醇和浓度为3 mol/L、I3h为6. 0的醋酸钠溶液，所述醋酸钠溶液的体积为该上清体积的1/10，所述冰冷乙醇的体积为该上清体积的2. 5倍，颠倒混勻后，置于-20°C保存30 min，4°C、IOOOOrpm离心lOmin，弃上清，用质量浓度为70%的乙醇漂洗沉淀二次，晾干后，加入100 μ L灭菌去离子水溶解沉淀，得到样品DNA，4°C保存备用；2)PCR反应反应体系25 μ L 含浓度都为1 μ mol/L的所述引物和浓度为0. 4 μ mol/L的所述探针的2 X —步荧光定量PCR缓冲液12.5 μ L，浓度为5U/μ L的Taq DNA聚合酶·0. 5 μ L，样品DNA 0. 5 μ L，灭菌去离子水补足余量；反应参数50°C预热2 min ；95°C预变性·10 min ；95°C 15s,60°C 1 min，40个循环；PCR反应中若样品DNA有荧光信号则为油棕猝倒病菌。
全文摘要
本发明公开了油棕猝倒病菌荧光定量PCR检测试剂及检测试剂盒和应用，检测试剂含有序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的一对特异性引物和序列如SEQ ID NO3所示一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为94bp，扩增目标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO4所示；检测试剂盒由CTAB提取液、含引物和探针的PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、阳性对照液、阴性对照液和定量标准液等组份，检测方法包括总RNA的提取和荧光PCR反应，该油棕猝倒病菌荧光定量PCR检测试剂检测时，克服了常规PCR费时、易污染以及扩增后需电泳检测等缺点，可对样品中的油棕猝倒病菌进行快速准确的定性与定量检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、重复性好等优点。
文档编号C12Q1/68GK102382890SQ20111035609
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者张慧丽, 徐瑛, 王建峰, 闻伟刚 申请人:宁波检验检疫科学技术研究院