专利名称：鼻咽癌易感基因无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及ー种鼻咽癌易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估鼻咽癌发病的风险级别，并作为预防和治疗鼻咽癌的方向指导。
背景技术：
鼻咽癌是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤。常见临床症状是鼻塞、鼻涕流血、头痛、耳鸣；晚期侵及颅脑，可出现耳鸣、耳聋、头痛、复视及颈淋巴结肿大。在世界大多数国家，鼻咽癌发病率极低，但在中国南方部分省市和亚洲东南部ー些国家其发病率却很高，其中我国南方广东省是世界最高发地区，世界人ロ标化发病率高达男性约30/10万，女性约13/10万。研究结果表明，鼻咽癌具有显著的地区差异、家族集聚现象和发病率相对稳定等流行病学特征，移民流行病学研究证据和符合分离分析研究结果均提示遗传因素在鼻咽癌的发生发展中具有重要作用。细胞色素P450超家族是ー类重要的代谢酶基因。其编码的CYP450酶能将无活性的前致癌物代谢转变为具有活性的中间产物，这些中间产物具有亲电子性而且可以与 DNA共价结合形成加和物，从而损伤DNA及引起癌基因和抑癌基因的改变，导致癌变形成。 CYP2E1酶主要代谢活化ー些低分子量的化合物，包括亚硝胺类、黄曲霉素BI、苯并花、四氯化碳等。TNF是体内具有多种生物活性的重要致炎细胞因子，主要由脂多糖激活的单核、巨噬细胞及淋巴细胞等分泌。TNF有抗病毒、广泛的诱导炎症和免疫调节功能，最突出的是其強大的抗肿瘤特性。从而在自身免疫性疾病、感染性疾病，特别是在恶性肿瘤的发生发展过程中起重要作用。研究表明TNF-PG252A单核苷酸位点多态性与鼻咽癌易感性密切相关， 因此可以作为鼻咽癌易感性的危险因素之一。谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)是人体内ー类具有重要解毒作用的多基因酶族，其中的GSTMl和GSTTl分别编码GST- U和GST- 0同功酶，分别对多环芳烃类和环氧化物及杀虫剂中的卤代烷烃类有很强的解毒作用。研究表明GSTTl和GSTMl基因的缺失导致它们编码的同功酶缺失，均可能影响机体对上述毒物的解毒功能，増加宿主对该类致癌物作用的敏感性。有研究表明GSTMl和GSTTl存在人群缺失多态，且地域不同缺失率有差异，中国人 GSTMl缺失率偏高，在35% -63%，尤其GSTTl缺失率高达58%，这部分人群相当于增加了环境毒素和致癌物质的浓度，提高了个体罹患一系列类型癌症的风险。国内外研究表明，携带GSTMl和GSTTl缺失型的个体，鼻咽癌的风险增加，因此GSTM1/GSTT1缺失型是中国人群重要的鼻咽癌遗传易感因素之一。综上所述，鉴于CYP2E1基因上Rsall多态性，TNF-^基因上G252A位点多态性， GSTMl基因缺失与否(Present/Null)，GSTTl基因缺失与否(Present/Null)在鼻咽癌变过程中有着不可忽视的作用，可以将上述基因作为遗传易感因素来检测出受检者在鼻咽癌发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患鼻咽癌的高危人群，从而有针对性的预防和治疗鼻咽癌，这对于降低鼻咽癌的发病率有非常重要的意义。
发明内容
基于CYP2E1基因上Rsall多态性，TNF-β基因上G252A位点多态性，GSTMl基因缺失与否(Present/Null)，GSTTl基因缺失与否(Present/Null)的4个单核苷酸多态性位点基因型可作为评估鼻咽癌发病的危险因子的基础上，本发明提供一种鼻咽癌易感基因检测试剂盒。该试剂盒包括检测CYP2E1基因上Rsall多态性，TNF-β基因上G252A位点多态性，GSTMl基因缺失与否(Present/Null)，GSTTl基因缺失与否(Present/Null)的4个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)； PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。测序反应体系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 测序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液 Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例I.检测试剂盒的使用I、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(1)CYP2E1 (Rsall)正向引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'CYP2E1 (Rsall)反向引物5' ATACAGACCCTCTTCCACCTT3'(2)TNF-@ (G252A)正向引物5' CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'
TNF-P (G252A)反向引物5' TTCGTGCTTTGGACTACCG3'(3)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(4) GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSITl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5 ill ;25mM的dNTP混合液0. 2 yl、 5U/ul Taq 酶 0. 125 yl、DNA 模板 I (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0. 25u I, ddH20 19. 175u I ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul, lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去离子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(1)CYP2E1 (Rsall)测序引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'(2)TNF-P (G252A)测序引物5' CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'(3) GSTMl (Null/Present)测序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'(4) GSTTl (Null/Present)测序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 测序引物Iul，去离子水2ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %こ醇溶液15ul，于室温下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%こ醇溶液30ul, 3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的 SNP位点的基因型。实施例2.对人们进行预防鼻咽癌发病的基因无创检测的服务I.采样及抽提DNA由医院检验科医师指导受检者使用ロ腔采样拭进行ロ腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提2.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的CYP2E1基因上Rsall多态性， TNF-^基因上G252A位点多态性，GSTMl基因缺失与否(Present/Null)，GSTTl基因缺失与否(Present/Null)的4个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这4个SNPs位点的基因型。3.鼻咽癌发病高危人群风险评估通过对受检者SNPs基因型的分析，出具鼻咽癌易感基因风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者CYP2E1基因上Rsall多态性，TNF-β基因上G252A位点多态性， GSTMl基因缺失与否(Present/Null)，GSTTl基因缺失与否(Present/Null)的4个基因上 SNP位点基因检测信息、以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读鼻咽癌易感基因无创检测报告单。
权利要求
1.一种检测鼻咽癌易感基因无创检测试剂盒，其特征在于检测CYP2E1基因上Rsall 多态性，TNF-^基因上G252A位点多态性，GSTMl基因缺失与否(Present/Null)，GSTTl基因缺失与否(Present/Null)的4个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对CYP2E1 基因上Rsall多态性，TNF-^基因上G252A位点多态性，GSTMl基因缺失与否(Present/ Null)，GSTTl基因缺失与否(Present/Null)的4个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这4个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的DNA测序引物是针对CYP2E1 基因上Rsall多态性，TNF-^基因上G252A位点多态性，GSTMl基因缺失与否(Present/ Null)，GSTTl基因缺失与否(Present/Null)的4个单核苷酸多态性位点而设计，能通过 DNA测序技术特异性检测出上述4个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求I所示的试剂盒，其特征在于，所含的4对特异性引物序列如下(1)CYP2E1(Rsall)正向引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'CYP2E1 (Rsall)反向引物5' ATACAGACCCTCTTCCACCTT3'(2)TNF- ^ (G252A)正向引物5' CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'TNF-^ (G252A)反向引物5' TTCGTGCTTTGGACTACCG3'(3)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(4)GSTTl(Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所含的4条DNA测序引物序列如下(1)CYP2E1(Rsall)测序引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'(2)TNF-^(G252A)测序引物5, CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3,(3)GSTMl(Null/Present)测序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'(4)GSTTl(Null/Present)测序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括(1)卩0 反应体系10\ 0 反应缓冲液2.5111，251111dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 产物纯化体系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)测序反应体系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA测序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
全文摘要
本发明提供了一种检测鼻咽癌易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测CYP2E1基因上Rsal1多态性，TNF-β基因上G252A位点多态性，GSTM1基因缺失与否(Present/Null)，GSTT1基因缺失与否(Present/Null)的4个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与鼻咽癌发生密切相关的2个单核苷酸多态性位点的基因型来评估受检者鼻咽癌患病的风险级别，并最终根据每一位受检者的基因检测结果从基因层面指导受检者有针对性的预防鼻咽癌的发生，降低鼻咽癌的发病几率。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
文档编号C12Q1/68GK102586446SQ201210053659
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者姜丽, 潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司