专利名称：胰腺癌易感基因无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及生物医学和生物技术，具体涉及ー种胰腺癌易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因水平评估胰腺癌发病的风险级别，并作为预防和治疗胰腺癌的方向指导。
背景技术：
胰腺癌是ー种常见的恶性肿瘤，占全部恶性肿瘤的2%。约95%的胰腺癌为导管细胞腺癌，其具有恶性度高，早期诊断率低，疗效欠佳，预后差等特点，病死率接近100 %，总体5年期生存率小于5%。据世界卫生组织公布的统计资料，近年来，胰腺癌的发病率在全球范围内呈逐年上升趋势，2008年全世界新发胰腺癌病例278684例，发病率为3. 9/10万， 2010年全世界新发胰腺癌病例达293541例，增加5. 06%。在我国，胰腺癌的发病率也呈逐年上升趋势，其标化病死率在10年间(1991-2000年)从I. 46/10万增长到2. 38/10万，增加了近I倍。2008年，我国新发胰腺癌病例44217例，发病率为2. 8/10万，可以判断，随着世界人ロ的迅速增长和年龄的日趋老龄化，胰腺癌必将成为威胁人类健康的主要疾病。引起胰腺癌的危险因素很多，研究表明其主要因素为两类遗传因素和环境因素。 遗传方面，可能与基因突变、基因多态性、表观遗传学等因素引起的遗传易感性提闻有关。最近的研究表明，胰腺癌的发生与XPC、MTHFR、CYP2E1、GSTTl四个遗传易感基因密切相关。XPC 全称 xeroderma pigmentosum, complementation group C,即着色性干皮病基因组C，它是核苷酸切除修复系统的重要成分，与HHR23B形成复合物，在切除修复初始阶段发挥识别DNA损伤的功能。一旦DNA修复功能出现异常，细胞恶性转化的概率也将增加。 XPC蛋白水平表达的高低是影响细胞损伤识别的关键因子之一。存在DNA损伤修复缺陷的个体，对癌症的易感性増加，这可能与基因组不稳定性的増加有夫。XPC缺陷可导致遗传不稳定性的发生，从而致使胰腺癌的发生。PAT多态是XPC第9号内含子的多个AT双核苷酸的插入缺失多态，其具有3种基因型PAT (未缺失)、PAT (杂合缺失)、PAT (纯和缺失)，对中国人群关联分析报道，PAT(纯和缺失)和PAT(杂合缺失)型患者其DNA损伤修复能力降低，基因组稳定性下降，抵抗致癌物质的能力降低，大大增加了胰腺癌的发病风险。因此， XPC基因PAT单核苷酸多态性位点可作为胰腺癌发病的风险预测因子和指针之一。MTHFR 的全称为 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH),是亚甲基四氢叶酸还原酶蛋白编码基因。MTHFR作为ー种还原酶，可将叶酸代谢通路中的5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，从而有利于叶酸生物学功能的发挥。此外，由于叶酸代谢通路与同型半胱氨酸代谢通路耦联，因此，MTHFR酶活性的正常发挥有利于保持血液中的同型半胱氨酸水平，不至于出现高同型半胱氨酸血症，为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基。此外叶酸的中间代谢产物在核苷酸合成过程中也有重要的作用，通过ー碳単位代谢为嘌呤环的形成提供碳原子。MTHFR基因的缺陷将导致机体多个基础生化途径的紊乱，包括细胞周期调控、DNA复制、DNA甲基化修饰等，由此将引发癌症、心脑血管等多种病症。研究发现，MTHFR C677T单核苷酸多态性位点与胰腺癌患病风险有夫，当叶酸摄入和吸收水平高时，677T/T和677C/T基因型人群患胰腺癌风险较低，这两类基因型被视为胰腺癌保护基因，而677C/C基因型人群在MTHFR酶耐热性较强，不利于dUMP转变为dTMP，容易造成DNA 损伤，胰腺癌发生风险明显增强。CYP2E1又称细胞色素P450 2E1，是细胞色素P450酶体系的一员，是药物代谢的核心体系成员。该酶主要分布于肝脏，其最适底物多为亲脂性小分子化合物，包括苯、乙醇、氯乙烯、亚硝胺等，其中大部分为前致癌物和前毒物。CYP2E1能够将这些前致癌物和前毒物活化，从而给机体带来伤害。目前研究表明，CYP2E1基因上多态现象能改变其编码酶的表达水平与活性，因而影响到机体对环境毒物的代谢能力，导致多种癌症的发生。CYP2E1存在 RsaI多态性，影响了 CYP2E1基因的转录。研究发现，CYP2E1 RsaI等位基因在胰腺癌病例组和对照组中的分布具有显著差异，是胰腺癌发生的易感因素，特别是在与酒精协同作用下， 患胰腺癌的风险进一步上升。CYP2E1 RsaI单核苷酸多态性位点的基因型有C/C、C/T、T/T 三种，其中T/T基因型与胰腺癌密切相关，该风险基因型携带者，CYP2E1基因表达的蛋白将使苯、乙醇、氯乙烯、亚硝胺等前致癌物转化为致癌物质，使个体患胰腺癌的风险骤然升高。 因此，CYP2E1 RsaI单核苷酸多态性位点可以用于胰腺癌的遗传检测与风险评估。谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)属于II相代谢酶，能促进各种亲电子的化合物(包括环境致癌物及其中间代谢产物)与谷胱甘肽结合，形成易溶于水的化合物排出体外，是与毒物或致癌物的解毒代谢有关的酶类，已知人类GSTs家族中GSTMl和GSTTl与肿瘤发生的关系最为密切。GSTTl具有present和null两个等位基因，其中present具有正常的酶活性，而null基因是指结构基因缺失的纯合子，又称为空白基因型，缺乏GSTTl酶活性。正常的GSTTl酶活性可能通过促进致癌剂的亲电作用及从体内的排除而保护易感组织，防止体细胞的DNA突变，而GSTTl基因的纯和缺失可能会降低或丧失机体代谢及排出致癌物的功能，从而具有较大的肿瘤危险性。因此，GSTTl基因缺失可以作为胰腺癌发生的重要危险因素。综上所述，鉴于XPC、MTHFR、GYP2E1、GSTT14个基因与胰腺癌的发生有着重要的关联关系，因此，可以将这些基因做为预测和筛查胰腺癌的潜在指标，通过对这些胰腺癌易感基因的检测，能在预防和治疗胰腺癌以及降低疾病的发生率方面起到不容忽视的重要作用。
发明内容
本发明基于XPC基因上单核苷酸多态性位点PAT(未缺失/杂合缺失/纯和缺失)， MTHFR基因上单核苷酸多态性位点C677T(rsl801133)，CYP2E1基上单核苷酸多态性位点 Rsal(rs2031920), GSTTl基因是否缺失(Null/Present)这4个单核苷酸多态性位点基因型可作为评估胰腺癌发病的危险因子的基础上，研制一种胰腺癌易感基因检测试剂盒。该试剂盒包括检测XPC基因上PAT(未缺失/杂合缺失/纯和缺失)，MTHFR基因是否缺失(Null/ Present), GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，CYP2E1基因上RsaI这4个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70 %乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10XPCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul Exol 酶 0. 375ul ; ddH203. 875ul。测序反应体系25%BigDye mix lul ；3. 2uM DNA 测序引物 lul ;125mMEDTA 溶液 lul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商 所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1.检测试剂盒的使用1、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(l)XPC PAT(+/_)正向引物5' -TAGCACCCAGCAGTCAAAG-3'XPC PAT(+/_)反向引物5' -TGTGAATGTGCTTAATGCTG-3'(2)MTHFR(C677T)正向引物5' -AGGGAGGCTTCAACTACGC-3'MTHFR(C677T)反向引物5' -GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT-3'(3)CYP2El(RsaI)正向引物5' -AAGTGATTTGGCTGGATTGTA-3'CYP2El(RsaI)反向引物5' -ATACAGACCCTCTTCCACCTT-3'(4)GSTT1 (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSIT1 (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'PCR扩增的反应体系为10XPCR反应缓冲液2. 5iil ;25mM的dNTP混合液0. 2 yl、 5U/ul Taq 酶 0. 125 yl、DNA 模板 1 yl (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0. 25u 1, ddH20 19. 175u 1 ；XPC PAT (+/-)扩增反应条件为94°C预变性 5min，然后 94°C变性 lmin，50°C lmin 退火，72°C延伸50s，35个循环后，72°C延伸10分钟。MTHFR(C677T)扩增反应条件为94°C预变性 5min，然后 94°C变性 55s，50°C lmin 退火，72°C延伸lmin，32个循环后，72°C延伸10分钟。GSTT1 (Null/Present)、GSTT1 (Null/Present)扩增反应条件为94 °C 预变性DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70 %乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10XPCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul Exol 酶 0. 375ul ; ddH203. 875ul。测序反应体系25%BigDye mix lul ；3. 2uM DNA 测序引物 lul ;125mMEDTA 溶液 lul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。5min，然后94°C变性lmin, 52°C 55s退火，72°C延伸50s，35个循环后，72°C延伸10分钟。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul，lU/ul SAP 酶 O. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去离子水 3. 875ul。在 ABI2720 型 PCR 扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min, 72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(I)XPC PAT(+/-)测序引物5' TAGCACCCAGCAGTCAAAG3'(2)MTHFR(C677T)测序引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'(3)GSTTl (Null/Present)测序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'(4)CYP2E1 (RsaI) (Ile462Val)测序引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mix lul，3. 2uMDNA 测序引物Iul，去离子水2ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室温下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的 SNP位点的基因型。实施例2.筛查胰腺癌风险人群的基因无创检测服务I.无创采样由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔粘膜上皮细胞取样，样本用细胞保存液常温保存。2. DNA 抽提采用酚氯仿法对采集到的口腔粘膜细胞进行DNA抽提。3.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者全基因组DNA的XPC基因上PAT，MTHFR 基因上 C677T(rsl801133)， GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)， CYP2E1 基因上 RsaI (rs2031920)的4个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这4个SNPs位点的基因型。4.胰腺癌发病高危人群生物信息学分析及风险评估通过对受检者SNPs基因型的生物信息学分析和风险评估模型鉴定，出具胰腺癌易感基因风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者XPC基因上PAT，MTHFR基因上 C677T(rsl801133) ,GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，CYP2E1 基因上 RsaI (rs2031920) 的4个SNP位点基因检测信息，胰腺癌风险评估结果和防治方案。根据受检者的风险评估等级，由医师向受检者详细说明并解读胰腺癌易感基因无创检测报告单。
权利要求
1.一种检测胰腺癌易感基因的无创检测试剂盒，其组成成分为XPC基因上单核苷酸多态性位点PAT (未缺失/杂合缺失/纯和缺失)，MTHFR基因上单核苷酸多态性位点 C677T(rsl801133) ,CYP2E1基上单核苷酸多态性位点RsaI (rs2031920)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)基因型的PCR特异引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、 ddH20 等。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特点在于所述的特异性引物对是指针对XPC基因上单核苷酸多态性位点PAT (正常/杂合缺失/纯和缺失)，MTHFR基因上单核苷酸多态性位点C677T(rsl801133)，CYP2E1基上单核苷酸多态性位点RsaI (rs2031920)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，能特异性扩增出包含4个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特点在于所述的DNA测序引物是针对XPC基因上单核苷酸多态性位点PAT (正常/杂合缺失/纯和缺失)，MTHFR基因上单核苷酸多态性位点C677T(rsl801133)，GYP2E1基上单核苷酸多态性位点RsaI (rs2031920)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，能通过DNA测序技术特异性检测出上述4个SNPs位点基因型的DNA 测序引物。
4.根据权利要求I所示的试剂盒,其所含的4对特异性引物序列如下(I)XPC PAT (+/-)正向引物5' -TAGCACCCAGCAGTCAAAG-3'5' -TGTGAATGTGCTTAATGCTG-3'5' -AGGGAGGCTTCAACTACGC-3'5' -GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT-3'5' -AAGTGATTTGGCTGGATTGTA-3'5' -ATACAGACCCTCTTCCACCTT-3'(4)GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSITl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所含的4条DNA测序引物序列如下(1)XPCPAT (+/-)测序引物5' -TAGCACCCAGCAGTCAAAG-3'(2)MTHFR(C677T)测序引物5'-AGGGAGGCTTCAACTACGC-3'(3)CYP2E1(RsaI)测序引物5' -AAGTGATTTGGCTGGATTGTA-3'(4)GSITl(Null/Present)测序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'。
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括(1)卩0 反应体系10\ 0 反应缓冲液2.5111，251111dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各、0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 产物纯化体系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)测序反应体系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA测序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。XPC PAT(+/-)反向引物(2)MTHFR(C677T)正向引物 MTHFR(C677T)反向引物(3)CYP2E1(RsaI)正向引物 CYP2E1 (RsaI)反向引物
全文摘要
本项发明提供了一种检测胰腺癌易感基因的无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测XPC基因上单核苷酸多态性位点PAT(正常/杂合缺失/纯和缺失)，MTHFR基因上单核苷酸多态性位点C677T(rs1801133)，CYP2E1基上单核苷酸多态性位点RsaI(rs2031920)，GSTT1基因是否缺失(Null/Present)，这四个基因基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应体系、PCR产物纯化体系、DNA测序反应体系等。本项发明的试剂盒通过检测与胰腺癌发生密切相关的4个单核苷酸多态性位点的基因型来评估人群中胰腺癌的患病风险级别与程度，并根据受检者基因检测结果从基因维度指导中国人群进行针对性的预防胰腺癌的发生，从而降低胰腺癌的发病概率。本发明所使用样本为口腔粘膜细胞，采集方法无痛、无创、可避免交叉感染。基因测序过程采用ABI 3730型测序仪，方法简便，结果准确，可靠，适宜推广。
文档编号C12Q1/68GK102586447SQ20121005367
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者潘加奎, 郑俊斌 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司