专利名称：微生物发酵生产乳酸脱氢酶的方法
技术领域：
本项目涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种微生物发酵生产乳酸脱氢酶方法。该方法生产的乳酸脱氢酶主要应用于临床白血病、心肌梗塞诊断，以及肺癌、淋巴瘤、卵巢癌等多种肿瘤的早期诊断和疗效判断，是生产丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒的主要原料，可以作为食品添加剂用于发酵奶制品、腌溃品、糖果制品和饮料的生产。
背景技术：
乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, EC111. 27,简写为LDH)是生物体糖酵解过程中重要的氧化还原酶(Ellen, Microbiological Reviews, 1980)。LDH普遍存在于动物、 植物及微生物。基于血清LDH活性水平可以反映富含LDH细胞的增殖、代谢等生物学性状，LDH作为临床诊断试剂被广泛应用(张之南，血液病诊断与疗效标准，1998)。目前主要应用是临床白血病、心肌梗塞诊断，肺癌、淋巴瘤、卵巢癌等多种肿瘤的早期诊断和疗效判断，生产丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒的主要原料，作为食品添加剂用于发酵奶制品、腌溃品、糖果制品和饮料生产(王翰林，实用预防医学，2010 ;石轩峰等，河南工业大学学报，2005)。早期生产LDH的方法是从动物脏器尤其是心肌和骨骼肌中提取，但很难得到纯度较高的LDH，而通过微生物发酵法则容易制得，目前我国微生物发酵生产LDH处于菌种选育、发酵条件优化、酶分离纯化、基因克隆及表达等研究阶段(朱勇，食品与发酵工业，2006 ;杨海麟等，工业微生物，2005)。虽然关于微生物发酵生产LDH的报道较多，但LDH产量较低，我国目前医用LDH主要依靠进口，LDH产业化、规模化微生物发酵生产还未见报道。由于动物脏器组织中酶系复杂，生物活性物质变化较大，难以提取高纯度的乳酸脱氢酶。利用微生物发酵生产LDH比从动物组织中提取更容易制得纯度高的乳酸脱氢酶，发酵生产工艺简单，提取步骤相对简易，酶的纯化工艺稳定，生产不受原料来源影响，更适用于批量生产，且微生物发酵生产的LDH在医用诊断、检测精密度上要高于其他方法生产的LDH(苏虹等，吉林大学学报，2006)。因此，微生物发酵生产乳酸脱氢酶具有广阔的开发潜力和应用前
旦
o技术内容本发明的目的是提供一种微生物发酵生产乳酸脱氢酶的方法，该方法主要是微生物经过产物定向驯化后，在26 32°C液体发酵生产乳酸脱氢酶的方法，这种生产方法获得的乳酸脱氢酶粗酶液活性可以达到120U/mL，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。该方法生产的LDH操作简单、方便、快捷、成本低，可以从根本上避免动物组织提取的繁琐工艺和昂贵设备。本发明所述的一种微生物发酵生产乳酸脱氢酶的方法具体包括以下步骤(I)将产生乳酸脱氢酶的微生物进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在26 32 °C生长良好；(2)按常规方法将产物定向驯化后的乳酸脱氢酶产生菌在26 32°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的4 10%接种量接入液体发酵培养基中，在26 32°C培养60 114h时，即微生物发酵生产乳酸脱氢酶结束；(4)将(3)的发酵液在6，000 8，OOOrpm离心收集液体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(5)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为乳酸脱氢酶粗酶液；(6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。乳酸脱氢酶生产菌(CGCMM菌种编号1. 557或I. 1856)先活化、定向驯化后，按本发明产酶条件发酵生产乳酸脱氢酶，驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用10 25%甘油制成的菌悬液、在-80°C条件下可以长期保藏。
具体实施例方式实施例一(I)培养基制备①菌种活化培养基葡萄糖5. Og,蛋白胨5. Og,酵母膏2. Og,琼脂16. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌株产物定向驯化培养基葡萄糖2. 5 7. 5g,蛋白胨4. 5 6. 5g,酵母膏
3.0 6. Og,丙酮酸0. 2 0. 7mL,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。③液体种子培养基蛋白胨8 12g,酵母膏I. 5 3. 5g,葡萄糖2. 5 8. Og,KH2PO4 I. 5 2. 5g，K2HPO4 0.5 1.5g，自来水 I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。④发酵产酶培养基葡萄糖6. 5 8. 5g,酵母膏I. 5 2. 5g,蛋白胨3. 0 6. 5g,玉米浆12. 5 16. 5mL，KH2PO4 2. 5 6. Og,乙酸铵I. 5 5. Og,丙酮酸0. 2 0. 6mL，吐温80 1.5 4.5mL，自来水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生乳酸脱氢酶的微生物按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在26 32°C环境条件下生长良好；(3)按常规方法将产物定向驯化后的乳酸脱氢酶产生菌在26 32°C培养36 60h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(4)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的4 6%接种量接入IOL液体发酵培养基中，在26 28°C培养96 114h时，即微生物发酵生产乳酸脱氢酶结束；(5)将(4)的发酵液在6，000 8，OOOrpm离心收集液体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(6)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为乳酸脱氢酶粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。实施例二 (I)培养基制备①菌种活化培养基葡萄糖5. Og,蛋白胨5. Og,酵母膏2. Og,琼脂16. Og,蒸馏水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌株产物定向驯化培养基葡萄糖2. 5 7. 5g,蛋白胨4. 5 6. 5g,酵母膏3. 0 6. Og,丙酮酸0. 2 0. 7mL,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。③液体种子培养基蛋白胨8 12g,酵母膏I. 5 3. 5g,葡萄糖2. 5 8. Og,KH2PO4 I. 5 2. 5g，K2HPO4 0.5 1.5g，自来水 I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。 ④发酵产酶培养基葡萄糖6. 5 8. 5g,酵母膏I. 5 2. 5g,蛋白胨3. 0 6. 5g,玉米浆12. 5 16. 5mL，KH2PO4 2. 5 6. Og,乙酸铵I. 5 5. Og,丙酮酸0. 2 0. 6mL，吐温80 1.5 4.5mL，自来水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生乳酸脱氢酶的微生物按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在26 32°C环境条件下生长良好；(3)按常规方法将产物定向驯化后的乳酸脱氢酶产生菌在26 32°C培养36 60h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(4)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的6 8%接种量接入50L液体发酵培养基中，在28 30°C培养78 96h时，即微生物发酵生产乳酸脱氢酶结束；(5)将⑷的发酵液6，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(6)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为乳酸脱氢酶粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。实施例三(I)培养基制备①菌种活化培养基葡萄糖5. Og,蛋白胨5. Og,酵母膏2. Og,琼脂16. Og,蒸懼水
I.0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌株产物定向驯化培养基葡萄糖2. 5 7. 5g,蛋白胨4. 5 6. 5g,酵母膏3. 0 6. Og,丙酮酸0. 2 0. 7mL,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。③液体种子培养基蛋白胨8 12g,酵母膏I. 5 3. 5g,葡萄糖2. 5 8. Og,KH2PO4 I. 5 2. 5g，K2HPO4 0.5 1.5g，自来水 I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。④发酵产酶培养基葡萄糖6. 5 8. 5g,酵母膏I. 5 2. 5g,蛋白胨3. 0 6. 5g,玉米浆12. 5 16. 5mL，KH2PO4 2. 5 6. Og,乙酸铵I. 5 5. Og,丙酮酸0. 2 0. 6mL，吐温80 1.5 4.5mL，自来水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生乳酸脱氢酶的微生物按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在26 32°C环境条件下生长良好；
(3)按常规方法将产物定向驯化后的乳酸脱氢酶产生菌在26 32°C培养36 60h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(4)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的8 10%接种量接入100L液体发酵培养基中，在30 32°C培养60 78h时，即微生物发酵生产乳酸脱氢酶结束；(5)将(4)的发酵液6，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(6)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为乳酸脱氢酶粗酶液；
(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
权利要求
1.一种微生物发酵生产乳酸脱氢酶的方法，其包括以下步骤 (1)将产生乳酸脱氢酶的微生物进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在26 32°C环境条件下生长良好； (2)按常规方法将产物定向驯化后的乳酸脱氢酶产生菌在26 32°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子； (3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的4 10%接种量接入液体发酵培养基中，在26 32°C培养60 114h时，即微生物发酵生产乳酸脱氢酶结束； (4)将(3)的发酵液在6，000 8，OOOrpm离心收集液体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀； (5)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10,000 14，OOOrpm离心,收集到的上清为乳酸脱氢酶粗酶液； (6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
2.根据权利要求I所述的方法，在步骤(6)之后进一步包括将步骤(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中菌种定向驯化培养基、液体种子培养基、产酶培养基分别为 (1)菌株产物定向驯化培养基葡萄糖2.5 7. 5g,蛋白胨4. 5 6. 5g,酵母膏3. 0 .6. Og,丙酮酸0. 2 0. ImL,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。
(2)液体种子培养基蛋白胨8 12g，酵母膏I.5 3. 5g，葡萄糖2. 5 8. 0g, KH2PO4I. 5 2. 5g，K2HPO4 0.5 I. 5g,自来水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。
(3)发酵产酶培养基葡萄糖6.5 8. 5g,酵母膏I. 5 2. 5g,蛋白胨3. 0 6. 5g,玉米浆 12. 5 16. 5mL, KH2PO4 2. 5 6. Og,乙酸铵 I. 5 5. Og,丙酮酸 0. 2 0. 6mL,吐温 80I. 5 4. 5mL,自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。
全文摘要
本发明所述的一种微生物发酵生产乳酸脱氢酶的方法是将产生乳酸脱氢酶的微生物进行6～10次活化，再经过产物定向驯化4～6次，使其在26～32℃环境条件下生长良好；按常规方法将产物定向驯化后的乳酸脱氢酶产生菌在26～32℃逐级扩大培养，按发酵液体积的4～10％接种量接入液体发酵培养基中，在26～32℃培养60～114h时，即微生物发酵生产乳酸脱氢酶结束；发酵液在6,000～8,000rpm离心收集菌体，数次洗涤后收集沉淀，悬浮于缓冲液中，并加石英砂研磨，10,000～14,000rpm离心收集上清即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
文档编号C12N9/04GK102653734SQ20121010689
公开日2012年9月5日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者张庆芳, 石淑钰, 迟乃玉 申请人:大连大学