专利名称：一株植物乳杆菌及其高密度培养和冻干菌粉制备的方法
技术领域：
本发明涉及一株植物乳杆菌及其高密度培养和冻干菌粉制备的方法。
背景技术：
植物乳杆菌与人类的生活关系密切，是一种常见于奶油、肉类及许多蔬菜发酵制品中的乳酸菌，能通过胃并定植于肠道发挥有益作用。它对肠道微生物有重要影响，无论在食品发酵，还是在工业乳酸发酵以及医疗保健等领域，都有着广泛的应用。本发明使用的植物乳杆菌P8是分离自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗传统发酵乳制品(酸牛奶)中的一株益生菌,经16S rDNA同源性分析与Gene Bank中标准菌株植物乳杆菌ATCC14917的同源性为100%。植物乳杆菌P8作为一种益生菌，具备优良的益生特性，经研究表明该菌株具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、胆盐耐受性、在肠道 有凝集作用(自凝集和它凝集)及抑制常见肠道致病菌生长特性(Yan Bao,Heping Zhang等人，《Annals of Microbiology》)。含有益生菌植物乳杆菌P8的发酵乳可改善机体内的微生态环境、预防和治疗高脂血症。植物乳杆菌P8作为一种益生菌，在食品发酵、动物饲料及医疗保健等领域具有广泛的应用前景和巨大经济效益。高密度培养技术(High Cell Density Culture)，也就是高密度发酵技术。由于各个菌种所能达到的最高菌体浓度相差较大，目前的文献中并没有对高密度培养有确切的定义。一般来说，高密度培养是指应用一定的培养技术或装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较传统培养方式有显著的提高，从而达到减少培养体积，还可以缩短生产周期，最终提高特定产物的比生产速率，减少设备投资从而降低生产成本，提高在市场上的竞争力。随着发酵剂的商业化生产和应用的迅速增加，工业发酵的基本目标自然转向了以最小的代价获得最大的产值和利润，而实现这一目标的工程手段是针对每个特定过程建立相应的高效发酵模式。因此，进行工业化生产，大规模培养非遗传修饰菌和工程菌的技术和工艺就显得日趋重要。乳酸菌浓缩发酵剂制备的关键是要实现对其进行高活性、高密度的培养。植物乳杆菌可添加到食品基料中，制成能够改善人体肠道健康的功能性食品，像瑞典 Skanemejerier 公司生产的含有 L. plantarum 299v 的 ProVivarosehip 饮料；也可制成调节肠道微生态平衡、提升免疫力的益生菌制剂，如加拿大生产的含L. planta rumR0202的益生菌制剂Jarrow Formulas ;还可用作猪饲料的益生素添加剂，如用能够耐受猪胃肠道转运的L. plantarum 4. I。本发明针对一株从内蒙古传统发酵乳制品-酸牛奶中分离，并经过体外耐酸性试验、耐胆酸盐试验、降胆固醇试验等一系列试验筛选得到的具有潜在益生作用的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8),通过优化液体培养基以及对培养条件的控制等方法实现高密度发酵，发酵液经离心收集菌体、添加保护剂后冷冻干燥得到冻干菌粉，可以应用于益生菌发酵剂和益生菌制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一株植物乳杆菌及其高密度培养和冻干菌粉制备的方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的一株植物乳杆菌,其特征在于所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8)是分离自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗传统发酵乳制品(酸牛奶)中的一株益生菌，具有人工胃液和人工消化液耐受性、胆盐耐受性、肠道凝集作用及抑制常见肠道致病菌等特性；该菌菌株已于2011年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名植物乳杆菌Lactobacillus plantarum,保藏号为 CGMCC No. 5468。一种如上所述的植物乳杆菌的高菌体密度培养的方法，包括以下步骤
a.菌种的活化将冷冻保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8)接种于MRS液体培养基中，37°C培养18 24小时，如此传代培养I 2次得到活化菌种；b.优化培养基的配制将优化培养基各成份按比例配制，混合均匀后调pH值为6. 5，121 °C下灭菌15min ；优化培养基各成分的含量比例如下鹿糖50 80kg,酵母粉20 40kg,大豆蛋白胨8 20kg,朽1檬酸I I. 5kg,朽1檬酸钠 20 25kg, MgSO4. 7H20 I. 5 2. 0kg, MnSO4. 5H20 0. 08 0. 12kg,吐温-80 0· 8 I. 0kg,蒸懼水 IOOOLoc.种子发酵液的制备取步骤a中活化好的菌种接种于b中配制的培养基中，37°C培养8 10小时；d.接种与培养将步骤c的种子发酵液，接种于b中配制的培养基中，在控制的发酵条件下发酵8 15h ；发酵条件控制为33 37°C恒温培养，通过流加中和剂的方法控制发酵过程pH保持5. 6 6. 2，保持微通氧或厌氧发酵。其中中和剂可以是NaOH、KOH、Na2C03等无机碱水溶液或氨水溶液。其中微通氧条件通过通空气O. 02 O. 05vvm,或每两个小时通空气一次的方法实现；厌氧条件通过通氮气O. 02 O. 05vvm,或每两个小时通氮气一次的方法实现。e.终止发酵当菌体产酸停止时终止发酵，得到植物乳杆菌的高密度发酵液，发酵液活菌数可达 1010cfu/ml 以上。其中可根据pH不再降低，中和剂流加停止来判断产酸是否停止。一种如上所述的植物乳杆菌冻干菌粉的制备方法包括如下步骤a.菌体浓缩高密度发酵液经5000 12000g离心浓缩菌体；b.添加保护剂菌体浓缩液添加5 10倍的保护剂溶液；保护剂溶液的成分配方比例如下脱脂乳30 35kg,脱盐乳清粉15 20kg,工业海藻糖15 20kg,维生素C3 4kg,卵憐脂0. 05 O. 08kg,蒸懼水IOOOLoc.干燥将上述添加保护剂后的菌悬液经冷冻干燥得到冻干菌粉。菌粉活菌总数可以达到4X 10ncfu/g以上，可以应用于益生菌发酵剂或益生菌制剂。本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8)对酸和胆盐耐受能力强,并且具有降胆固醇，降血脂，改善肠道菌群等多种益生功能，经高密度发酵后冷冻干燥后可得到高活力的冻干菌粉，满足了对于益生菌发挥益生功效所需的高活力的要求，可直接应用于益生菌制剂或益生菌发酵剂。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明；以下实施例仅为说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。 实施例I :一株植物乳杆菌,所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8)是分离自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗传统发酵乳制品(酸牛奶)中的一株益生菌，具有人工胃液和人工消化液耐受性、胆盐耐受性、肠道凝集作用及抑制常见肠道致病菌等特性；该菌菌株已于2011年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为 CGMCC No. 5468。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8)的高密度培养方法a.菌种的活化将_80°C冷冻保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8)接种于5ml MRS液体培养基中(MRS培养基蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g,磷酸氢二钾2g,乙酸钠5g,朽1檬酸三钠2g,吐温-801g,硫酸镁200mg,硫酸猛54mg,蒸馏水lOOOmL，pH6. 5 121°C 15min灭菌备用)，37°C培养18小时，如此传代培养2次得到活化的菌种。b.配制优化培养基,将鹿糖50 80kg,酵母粉20 40kg,大豆蛋白胨8 20kg,柠檬酸 I I. 5kg,柠檬酸钠 20 25kg, MgSO4. 7H20 I. 5 2. 0kg, MnSO4. 5H20 0. 08
0.12kg，吐温-80 0· 8 I. 0kg,水 1000L,充分溶解。c.制备种子培养液将上述活化好的菌种2%接种于优化培养基中，37°C培养10小时。d.接种发酵将种子培养液7%接种于优化培养基中，37°C恒温，每2小时通空气2分钟保持微通氧条件发酵，自动控制流加氨水保持PH5. 9发酵至产酸停止，氨水不再流加时终止发酵，得到植物乳杆菌高密度培养液。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8)冻干菌粉的制备方法将植物乳杆菌高密度发酵液经IOOOOg离心得到浓缩菌体，按浓缩菌体与保护剂溶液比例I : 8加入保护剂溶液(脱脂乳30 35kg，脱盐乳清粉15 20kg，工业海藻糖15 20kg,维生素C 3 4kg,卵磷脂0. 05 0. 08kg,蒸懼水1000L),混合均勻后入冷冻干燥机中冷冻干燥36小时,得到植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8)冻干菌粉。菌粉的活菌数可达4X10ncfU/g以上，可直接应用于益生菌发酵剂或益生菌制剂。实施例2
一株植物乳杆菌,所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8)是分离自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗传统发酵乳制品(酸牛奶)中的一株益生菌，具有人工胃液和人工消化液耐受性、胆盐耐受性、肠道凝集作用及抑制常见肠道致病菌等特性；该菌菌株已于2011年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为 CGMCC No. 5468。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8)的高密度发酵a.菌种的活化将_80°C冷冻保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8)接种于MRS液体培养基中37°C培养18小时，如此传代培养2次得到活化的菌种。b.配制优化培养基,将鹿糖50 80kg,酵母粉20 40kg,大豆蛋白胨8 20kg,柠檬酸 I I. 5kg,柠檬酸钠 20 25kg, MgSO4. 7H20 I. 5 2. 0kg, MnSO4. 5H20 0. 08
0.12kg，吐温-80 0· 8 I. 0kg,水 1000L,充分溶解。C.制备种子培养液将上述活化好的菌种2%接种于优化培养基中，37°C培养10小时。d.接种发酵将种子培养液9%接种于优化培养基中，37°C恒温,每2小时通氮气2分钟保持厌氧发酵，自动控制流加10M KOH溶液保持pH6. 2发酵至产酸停止，氨水不再流加时终止发酵，得到植物乳杆菌高密度培养液。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8)冻干菌粉的制备方法，同实施例I。
权利要求
1.一株植物乳杆菌，其特征在于所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8)是分离自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗传统发酵乳制品中的一株益生菌，具有人工胃液和人工消化液耐受性、胆盐耐受性、肠道凝集作用及抑制常见肠道致病菌等特性；该菌菌株已于2011年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为 CGMCC No. 5468。
2.一种如权利要求I所述的植物乳杆菌的高密度培养方法，其特征在于依次包括下述步骤 a.菌种的活化 将冷冻保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8)接种于MRS液体培养基中，37°C培养18 24小时，如此传代培养I 2次得到活化菌种； b.培养基的配制 将优化培养基各成份按比例配制，混合均匀后，然后调PH值为6. 5，121 °C下灭菌15min ； c.种子发酵液的制备 取步骤a中活化好的菌种接种于b中配制的培养基中，37°C培养8 10小时； d.接种与培养 将步骤c的种子发酵液，接种于b中配制的培养基中，在控制的发酵条件下发酵8 15h ； e.终止发酵 当菌体产酸停止时终止发酵，得到植物乳杆菌的高密度发酵液。
3.—种如权利要求I所述的植物乳杆菌的冻干菌粉的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤 a.菌体浓缩高密度发酵液经5000 12000g离心浓缩菌体； b.添加保护剂菌体浓缩液添加5 10倍的保护剂溶液； c.干燥将上述添加保护剂后的菌悬液经冷冻干燥得到冻干菌粉。
4.根据权利要求2所述的植物乳杆菌的高密度培养方法，其特征在于b步骤和e步骤中优化培养基各成分的含量比例如下 鹿糖50 80kg,酵母粉20 40kg,大豆蛋白胨8 20kg,朽1檬酸I I. 5kg,朽1檬酸钠20 25kg, MgSO4. 7H20 I. 5 2. 0kg, MnSO4. 5H20 0. 08 0. 12kg,吐温-80 0· 8 I. 0kg,蒸馏水1000L。
5.根据权利要求2所述的植物乳杆菌的高密度培养方法，其特征在于d步骤中控制的发酵条件为35 37°C恒温培养，通过流加中和剂的方法控制发酵过程pH保持恒定，保持微通氧或厌氧发酵。
6.根据权利要求2所述的植物乳杆菌的高密度培养方法，其特征在于e步骤中可根据PH不再降低，中和剂流加停止来判断是否到达发酵终点。
7.根据根据权利要求3所述的方法，其特征在于b步骤中保护剂的各成分的含量比例如下脱脂乳30 35kg,脱盐乳清粉15 20kg,工业海藻糖15 20kg,维生素C 3 4kg,卵磷脂0. 05 0. 08kg,蒸馏水IOOOL0
8.根据权利要求5所述植物乳杆菌的高密度培养方法，其特征在于中和剂可以选择NaOH> KOH> Na2C03等无机碱水溶液或氨水溶液。
9.根据权利要求5所述植物乳杆菌的高密度培养方法，其特征在于pH保持微酸性，.5.6-6. 2 之间。
10.根据权利要求5所述的植物乳杆菌的高密度培养方法，其特征在于微通氧条件通过通空气O. 02 O. 05vvm或每两个小时通空气一次的方法实现；厌氧条件通过通氮气.O. 02 O. 05vvm或每两个小时通氮气一次的方法实现。
全文摘要
一株植物乳杆菌及其高密度培养和冻干菌粉制备的方法。技术方案是其特征在于所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P8)是分离自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗传统发酵乳制品(酸牛奶)中的一株益生菌，具有人工胃液和人工消化液耐受性、胆盐耐受性、肠道凝集作用及抑制常见肠道致病菌等特性；该菌菌株已于2011年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.5468。
文档编号C12N1/04GK102864096SQ20121011545
公开日2013年1月9日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者高鹏飞, 姚国强 申请人:北京和美科盛生物技术有限公司