一种以PDDA-Fe₃O₄纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法

专利名称：一种以PDDA-Fe₃O₄纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种TODA-Fe3O4磁性纳米粒子固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法。
背景技术：
随着生化工程技术的发展及纺织品绿色加工要求的提高，纺织品生物酶前处理已被公认为是一种符合环保要求的印染加工方法。其中葡萄糖氧化酶可以催化葡萄糖生成过氧化氢用于纺织品漂白，同时生成的葡萄糖酸内酯可进一步水解生成葡萄糖酸，能螯合水中具有催化过氧化氢分解作用的金属离子，使得漂白过程中不需要再另外添加稳定剂，减少了化学试剂用量和环境污染，是一种具有发展前景的生物漂白技术。但游离的葡萄糖氧化酶存在使用稳定性差、酶处理后无法回收等缺点，导致酶制 剂无法再继续利用，不利于实际的开发应用，这些问题阻碍了酶制剂工业化应用和推广。固定化酶受非催化部分载体的物理和化学性质影响，可在活力、专一性、PH稳定性和温度稳定性方面发生变化，具有贮存稳定性高、易回收、可重复使用等优点，近年来在纺织领域的应用研究日益受到关注。综上所述，设计新型载体和运用当代高新技术，开发新型、高效固定化酶，进一步提高转化率和生产能力，是未来研究的重点。

发明内容
本发明的目的在于提供了一种TODA-Fe3O4磁性纳米粒子固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法，本发明具有技术简单易行、制备出的载体具有高比表面积和良好的生物相容性、酶负载量高、酶活性高、酶的热稳定性和PH稳定性高，且在外加磁场作用下该固定化酶易于回收再利用的特点。为了达到上述目的，本发明的技术方案是—种以PDDA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤1)以聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料制备TODA-Fe3O4磁性纳米粒子；2)以TODA-Fe3O4磁性纳米粒子为载体固定化葡萄糖氧化酶。所述的步骤I)采用二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料于三颈烧瓶中，在精密增力电动搅拌器搅拌下，缓慢滴加NaOH溶液，反应结束后，反应体系变为黑色悬浮液，静置一段时间，去除上清液，用蒸馏水反复洗涤至上清液无色后，置于烘箱中烘干，即得TODA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末。所述的二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液的质量浓度为3-5% ；FeCl3 6H20溶液的摩尔浓度为0. 1-0. 3mol/L ；FeCl2 *4H20的摩尔浓度为0. 05-0. 15mol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 *6H20溶液和FeCl2 *4H20的体积用量比为(5_15):(35-45):(35-45)。
所述的二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液的质量浓度优选为4% ；FeCl3 6H20溶液的摩尔浓度优选为0. 2mol/L ；FeCl2 *4H20的摩尔浓度为0. lmol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的体积用量比优选为I :4 4。所述的步骤I)的反应温度为20-40°C，反应时间为20-40min。所述的的步骤2)将步骤I)制备的TODA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末和酶加入到pH=6的缓冲溶液中，混合均匀后，加入戊二醛溶液，充分交联；交联完成后，用离心机以9000r/min的转速离心5min，倒出离心液，用水冲洗附于离心管壁上的物质，再离心，倒去离心液，反复数次后，最终附于离心管壁上的物质即为固定化葡萄糖氧化酶。所述的TODA-Fe3O4纳米粒子用量为0. 05-0. 15g ;所述的pH=6的缓冲溶液采用0. 2mol/L磷酸氢二钠溶液和0. lmol/L柠檬酸溶液的混合溶液，用量为15_25mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(商品名葡萄糖氧化酶Sigma酶活力10000u)用量为0. 3_2mg ;所述的戊二醛用量为0.01-0. 04mg。所述的TODA-Fe3O4纳米粒子用量优选为0. IOg ;所述的pH=6的缓冲溶液用量优选为20mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma IOOOOu)用量优选为I. 05mg ;所述的戍二醒用量优选为0. 02mgo所述的交联温度为10_40°C，交联时间为0. 5-2. 5h。所述的交联温度为20°C，交联时间为lh。本发明的有益效果为(I) TODA-Fe3O4磁性纳米粒子制备和酶的固定化技术简单易行，且制备出的载体具有高比表面积和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一种带正电的离子聚合物，将其用于纳米Fe3O4的制备过程中，可以充当稳定剂的作用，能较好地抑制Fe3O4纳米粒子的聚集,从而形成均勻的F1DDA-Fe3O4复合物。同时由于I3DDA的存在，使得Fe3O4纳米粒子表面带上正电荷，有利于带负电荷的葡萄糖氧化酶的固定。(3)本发明的TODA-Fe3O4磁性纳米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶负载量高、酶活性高、酶的热稳定性和PH稳定性高，且在外加磁场作用下该固定化酶易于回收再利用。
具体实施例实施例I 本实施例的一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤1)以聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料制备TODA-Fe3O4磁性纳米粒子；所述的步骤I)采用二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料于三颈烧瓶中，其中二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液的质量浓度为4% ；FeCl3 6H20溶液的摩尔浓度为0. 2mol/L ；FeCl2 4H20的摩尔浓度为0. lmol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的体积用量比为I :4 :4。然后在精密增力电动搅拌器搅拌下，缓慢滴加NaOH溶液，反应温度为30°C，反应时间为30min。反应结束后，反应体系变为黑色悬浮液，静置一段时间，去除上清液，用蒸馏水反复洗涤至上清液无色后，置于烘箱中烘干，即得I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末。2)以TODA-Fe3O4磁性纳米粒子为载体固定化葡萄糖氧化酶。将步骤I)制备的I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末和葡萄糖氧化酶溶液加入到pH=6的缓冲溶液中，混合均匀后，加入戊二醛溶液，充分交联；交联温度为20°C，交联时间为60min。交联完成后,用离心机以9000r/min的转速离心5min,倒出离心液,用水冲洗附于离心管壁上的物质，再离心，倒去离心液，反复数次后，最终附于离心管壁上的物质即为固定化葡萄糖氧化酶。其中I3DDA-Fe3O4纳米粒子用量为0. IOg ;所述的pH=6的缓冲溶液采用0. 2mol/L磷酸氢二钠溶液和0. lmol/L柠檬酸溶液的混合溶液，用量为20mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma IOOOOu)用量为I. 05mg ;所述的戊二醛用量分别为0. 01mg、0. 02mg、0. 03mg和0. 04mg的条件下；分别制备固定化酶,研究戍二醒用量对固定化葡萄糖氧化酶活力的影响，结果如表I所示，表I为戊二醛用量对固定化酶活力影响表。由表I可得戊二醛用量为0. 02mg时固定化酶活力最强。本实施例的制备方法具有以下优点(I) I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子制备和酶的固定化技术简单易行，且制备出的载体具有高比表面积和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一种带正电的离子聚合物，将其用于纳米Fe3O4的制备过程中，可以充当稳定剂的作用，能较好地抑制Fe3O4纳米粒子的聚集,从而形成均勻的F1DDA-Fe3O4复合物。 同时由于I3DDA的存在，使得Fe3O4纳米粒子表面带上正电荷，有利于带负电荷的葡萄糖氧化酶的固定。(3)本实施例的TODA-Fe3O4磁性纳米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶负载量高、酶活性高、酶的热稳定性和PH稳定性高，且在外加磁场作用下该固定化酶易于回收再利用。实施例2本实施例的一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤1)以聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料制备TODA-Fe3O4磁性纳米粒子；所述的步骤I)采用二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料于三颈烧瓶中，其中二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液的质量浓度为4% ；FeCl3 6H20溶液的摩尔浓度为0. 2mol/L ；FeCl2 4H20的摩尔浓度为0. lmol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的体积用量比为I :4 :4。然后在精密增力电动搅拌器搅拌下，缓慢滴加NaOH溶液，反应温度为30°C，反应时间为30min。反应结束后，反应体系变为黑色悬浮液，静置一段时间，去除上清液，用蒸馏水反复洗涤至上清液无色后，置于烘箱中烘干，即得TODA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末。2 )以TODA-Fe3O4磁性纳米粒子为载体固定化葡萄糖氧化酶。将步骤I)制备的I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末和葡萄糖氧化酶加入到pH=6的缓冲溶液中，混合均匀后，加入戊二醛溶液，充分交联；交联温度为20°C，交联时间为60min。交联完成后，用离心机以9000r/min的转速离心5min，倒出离心液，用水冲洗附于离心管壁上的物质，再离心，倒去离心液，反复数次后，最终附于离心管壁上的物质即为固定化葡萄糖氧化酶。其中I3DDA-Fe3O4纳米粒子用量为0. IOg ;所述的pH=6的缓冲溶液采用0. 2mol/L磷酸氢二钠溶液和0. lmol/L柠檬酸溶液的混合溶液，用量为20mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma IOOOOu)用量为0. 35mg、0. 7mg、l. 05mg、l. 4mg和I. 75mg的条件下；所述的戊二醛用量为0. 02mg。分别制备固定化酶，研究酶用量对固定化葡萄糖氧化酶活力的影响，结果如表2所示，表2为酶用量对固定化酶活力影响表。由表2可得酶用量为I. 05mg时固定化酶活力最强。
本实施例的制备方法具有以下优点(I) I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子制备和酶的固定化技术简单易行，且制备出的载体具有高比表面积和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一种带正电的离子聚合物，将其用于纳米Fe3O4的制备过程中，可以充当稳定剂的作用，能较好地抑制Fe3O4纳米粒子的聚集,从而形成均勻的F1DDA-Fe3O4复合物。同时由于I3DDA的存在，使得Fe3O4纳米粒子表面带上正电荷，有利于带负电荷的葡萄糖氧化酶的固定。(3)本实施例的TODA-Fe3O4磁性纳米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶负载量高、酶活性高、酶的热稳定性和PH稳定性高，且在外加磁场作用下该固定化酶易于回收再利用。实施例3 本实施例的一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤1)以聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料制备TODA-Fe3O4磁性纳米粒子；所述的步骤I)采用二烯丙基二甲基 胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料于三颈烧瓶中，其中二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液的质量浓度为4% ；FeCl3 6H20溶液的摩尔浓度为0. 2mol/L ；FeCl2 4H20的摩尔浓度为0. lmol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的体积用量比为I :4 :4。然后在精密增力电动搅拌器搅拌下，缓慢滴加NaOH溶液,反应温度为40°C,反应时间为30min。反应结束后，反应体系变为黑色悬浮液，静置一段时间，去除上清液，用蒸馏水反复洗涤至上清液无色后，置于烘箱中烘干，即得I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末。2)以TODA-Fe3O4磁性纳米粒子为载体固定化葡萄糖氧化酶。将步骤I)制备的I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末和葡萄糖氧化酶加入到pH=6的缓冲溶液中，混合均匀后，加入戊二醛溶液，充分交联；交联时间为60min。交联完成后，用离心机以9000r/min的转速离心5min，倒出离心液，用水冲洗附于离心管壁上的物质，再离心，倒去离心液，反复数次后，最终附于离心管壁上的物质即为固定化葡萄糖氧化酶。其中TODA-Fe3O4纳米粒子用量为0. IOg ;所述的pH=6的缓冲溶液采用0. 2mol/L磷酸氢二钠溶液和0. lmol/L柠檬酸溶液的混合溶液，用量为20mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma IOOOOu)用量为I. 05mg ;所述的戊二醛用量为0. 02mg。交联时的温度分别为10°C、20°C、3(rC和40°C的条件下，分别制备固定化酶，研究交联温度对固定化葡萄糖氧化酶活力的影响，结果如表3所示；表3为交联温度对固定化酶活力的影响。由表3可得交联温度为20°C时固定化酶活力最强。本实施例的制备方法具有以下优点(I) I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子制备和酶的固定化技术简单易行，且制备出的载体具有高比表面积和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一种带正电的离子聚合物，将其用于纳米Fe3O4的制备过程中，可以充当稳定剂的作用，能较好地抑制Fe3O4纳米粒子的聚集,从而形成均勻的F1DDA-Fe3O4复合物。同时由于I3DDA的存在，使得Fe3O4纳米粒子表面带上正电荷，有利于带负电荷的葡萄糖氧化酶的固定。(3)本实施例的TODA-Fe3O4磁性纳米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶负载量高、酶活性高、酶的热稳定性和PH稳定性高，且在外加磁场作用下该固定化酶易于回收再利用。实施例4本实施例的一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤1)以聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料制备TODA-Fe3O4磁性纳米粒子；所述的步骤I)采用二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料于三颈烧瓶中，其中二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液的质量浓度为4% ；FeCl3 6H20溶液的摩尔浓度为0. 2mol/L ；FeCl2 4H20的摩尔浓度为0. lmol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的体积用量比为I :4 :4。然后在精密增力电动搅拌器搅拌下，缓慢滴加NaOH溶液，反应温度为30°C，反应时间为30min。反应结束后，反应体系变为黑色悬浮液，静置一段时间，去除上清液，用蒸馏水反复洗涤至上清液无色后，置于烘箱中烘干，即得I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末。2)以TODA-Fe3O4磁性纳米粒子为载体固定化葡萄糖氧化酶。将步骤I)制备的I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末和葡萄糖氧化酶溶液加入到PH=6的缓冲溶液中，混合均匀后，加入戊二醛溶液，充分交联；交联温度为20°C，交联完成后，用离心机以9000r/min的转速离心5min，倒出离心液，用水冲洗附于离心管壁上的物质，再离心，倒去离心液，反复数次后，最终附于离心管壁上的物质即为固定化葡萄糖氧化酶。其中TODA-Fe3O4纳米粒子用量为0. IOg ;所述的pH=6的缓冲溶液采用0. 2mol/L磷酸·氢二钠溶液和0. lmol/L柠檬酸溶液的混合溶液，用量为20mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma IOOOOu)用量为I. 05mg ;所述的戊二醛用量为0. 02mg。交联时的时间分别为0. 5h、lh、l. 5h、2h和2. 5h的条件下,制备固定化酶,研究交联时间对固定化葡萄糖氧化酶活力的影响，结果如表4所示，表4为交联时间对固定化酶活力的影响表。由表4可得交联时间为I小时固定化酶活力最强。本实施例的制备方法具有以下优点(I) I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子制备和酶的固定化技术简单易行，且制备出的载体具有高比表面积和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一种带正电的离子聚合物，将其用于纳米Fe3O4的制备过程中，可以充当稳定剂的作用，能较好地抑制Fe3O4纳米粒子的聚集,从而形成均勻的F1DDA-Fe3O4复合物。同时由于I3DDA的存在，使得Fe3O4纳米粒子表面带上正电荷，有利于带负电荷的葡萄糖氧化酶的固定。(3)本实施例的TODA-Fe3O4磁性纳米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶负载量高、酶活性高、酶的热稳定性和PH稳定性高，且在外加磁场作用下该固定化酶易于回收再利用。实施例5本实施例的一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤1)以聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料制备TODA-Fe3O4磁性纳米粒子；所述的步骤I)采用二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料于三颈烧瓶中，其中二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液的质量浓度为4% ；FeCl3 6H20溶液的摩尔浓度为0. 2mol/L ；FeCl2 4H20的摩尔浓度为0. lmol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的体积用量比为I :4 :4。然后在精密增力电动搅拌器搅拌下，缓慢滴加NaOH溶液，反应温度为30°C，反应时间为30min。反应结束后，反应体系变为黑色悬浮液，静置一段时间，去除上清液，用蒸馏水反复洗涤至上清液无色后，置于烘箱中烘干，即得TODA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末。2 )以TODA-Fe3O4磁性纳米粒子为载体固定化葡萄糖氧化酶。将步骤I)制备的I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末和葡萄糖氧化酶加入到pH=6的缓冲溶液中，混合均匀后，加入戊二醛溶液，充分交联；交联温度为20°C，交联时间为60min。交联完成后，用离心机以9000r/min的转速离心5min，倒出离心液，用水冲洗附于离心管壁上的物质，再离心，倒去离心液，反复数次后，最终附于离心管壁上的物质即为固定化葡萄糖氧化酶。其中I3DDA-Fe3O4纳米粒子用量为0. IOg ;所述的pH=6的缓冲溶液采用0. 2mol/L磷酸氢二钠溶液和0. lmol/L柠檬酸溶液的混合溶液，用量为20mL ;所述的酶分别采用固定化葡萄糖氧化酶和游离葡萄糖氧化酶，用量为I. 05mg ;所述的戊二醛用量为0. 02mg。分别制备固定化酶和游离酶；其中固定化酶和游离酶活力如表5所示，表5为游离酶和固定化酶的活力比较表。由表5可得固定化酶活力比游离酶活力强。本实施例的制备方法具有以下优点(I) I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子制备和酶的固定化技术简单易行，且制备出的载体具有高比表面积和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一种带正电的离子聚合物，将其用于纳米Fe3O4的制备过程中，可以充当稳定剂的作用，能较好地抑制Fe3O4纳米粒子的聚集,从而形成均勻的F1DDA-Fe3O4复合物。同时由于I3DDA的存在，使得Fe3O4纳米粒子表面带上正电荷，有利于带负电荷的葡萄糖氧化酶的固定。 (3)本实施例的TODA-Fe3O4磁性纳米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶负载量高、酶活性高、酶的热稳定性和PH稳定性高，且在外加磁场作用下该固定化酶易于回收再利用。实施例6本实施例的一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤1)以聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料制备TODA-Fe3O4磁性纳米粒子；所述的步骤I)采用二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料于三颈烧瓶中，其中二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液的质量浓度为3% ；FeCl3 6H20溶液的摩尔浓度为0. lmol/L ；FeCl2 4H20的摩尔浓度为0. 05mol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的体积用量比为1:7:7。然后在精密增力电动搅拌器搅拌下，缓慢滴加NaOH溶液,反应温度为20°C,反应时间为40min。反应结束后，反应体系变为黑色悬浮液，静置一段时间，去除上清液，用蒸馏水反复洗涤至上清液无色后，置于烘箱中烘干，即得I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末。2)以TODA-Fe3O4磁性纳米粒子为载体固定化葡萄糖氧化酶。将步骤I)制备的I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末和葡萄糖氧化酶溶液加入到pH=6的缓冲溶液中，混合均匀后，加入戊二醛溶液，充分交联；交联温度为10°C，交联时间为2. 5h。交联完成后,用离心机以9000r/min的转速离心5min,倒出离心液,用水冲洗附于离心管壁上的物质，再离心，倒去离心液，反复数次后，最终附于离心管壁上的物质即为固定化葡萄糖氧化酶。其中I3DDA-Fe3O4纳米粒子用量为0. 15g ;所述的pH=6的缓冲溶液采用0. 2mol/L磷酸氢二钠溶液和0. lmol/L柠檬酸溶液的混合溶液，用量为25mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma 10000U)，用量为2mg ;所述的戊二醛用量为0. 04mg。制备固定化酶。本实施例的制备方法具有以下优点(I) I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子制备和酶的固定化技术简单易行，且制备出的载体具有高比表面积和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一种带正电的离子聚合物，将其用于纳米Fe3O4的制备过程中，可以充当稳定剂的作用，能较好地抑制Fe3O4纳米粒子的聚集,从而形成均勻的F1DDA-Fe3O4复合物。同时由于I3DDA的存在，使得Fe3O4纳米粒子表面带上正电荷，有利于带负电荷的葡萄糖氧化酶的固定。(3)本实施例的TODA-Fe3O4磁性纳米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶负载量高、酶活性高、酶的热稳定性和PH稳定性高，且在外加磁场作用下该固定化酶易于回收再利用。实施例7 本实施例的一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤1)以聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料制备TODA-Fe3O4磁性纳米粒子；所述的步骤I)采用二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料于三颈烧瓶中，其中二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液的质量浓度为5% ；FeCl3 6H20溶液的摩尔浓度为0. 3mol/L ；FeCl2 4H20的摩尔浓度为0. 15mol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的体积用量比为1:3:3。然后在精密增力电动搅拌器搅拌下，缓慢滴加NaOH溶液，反应温度为40°C，反应时间为20min。反应结束后，反应体系变为黑 色悬浮液，静置一段时间，去除上清液，用蒸馏水反复洗涤至上清液无色后，置于烘箱中烘干，即得TODA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末。2)以TODA-Fe3O4磁性纳米粒子为载体固定化葡萄糖氧化酶。将步骤I)制备的I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末和葡萄糖氧化酶加入到pH=6的缓冲溶液中，混合均匀后，加入戊二醛溶液，充分交联；交联温度为40°C，交联时间为0. 5h。交联完成后，用离心机以9000r/min的转速离心5min，倒出离心液，用水冲洗附于离心管壁上的物质，再离心，倒去离心液，反复数次后，最终附于离心管壁上的物质即为固定化葡萄糖氧化酶。其中I3DDA-Fe3O4纳米粒子用量为0. 05g ;所述的pH=6的缓冲溶液采用0. 2mol/L磷酸氢二钠溶液和0. lmol/L柠檬酸溶液的混合溶液，用量为15mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma 10000U)，用量为0. 3mg;所述的戊二醛用量为0.04mg。制备固定化酶。本实施例的制备方法具有以下优点(I) I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子制备和酶的固定化技术简单易行，且制备出的载体具有高比表面积和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一种带正电的离子聚合物，将其用于纳米Fe3O4的制备过程中，可以充当稳定剂的作用，能较好地抑制Fe3O4纳米粒子的聚集,从而形成均勻的F1DDA-Fe3O4复合物。同时由于I3DDA的存在，使得Fe3O4纳米粒子表面带上正电荷，有利于带负电荷的葡萄糖氧化酶的固定。(3)本实施例的TODA-Fe3O4磁性纳米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶负载量高、酶活性高、酶的热稳定性和PH稳定性高，且在外加磁场作用下该固定化酶易于回收再利用。表I
权利要求
1.一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于包括以下步骤1)以聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20为原料制备I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子；2)以TODA-Fe3O4磁性纳米粒子为载体固定化葡萄糖氧化酶。
2.如权利要求I所述的一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的步骤I)采用二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液、FeCl3 GH2O溶液和FeCl2 *4H20为原料于三颈烧瓶中，搅拌下，缓慢滴加NaOH溶液，反应结束后，反应体系变为黑色悬浮液，静置一段时间，去除上清液，用蒸馏水反复洗涤至上清液无色后，置于烘箱中烘干，即得I3DDA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末。
3.如权利要求I或2所述的一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液的质量浓度为3-5%;FeCl3 6H20 溶液的摩尔浓度为 0. 1-0. 3mol/L ；FeCl2 4H20 的摩尔浓度为 0. 05-0. 15mol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的体积用量比为(5-15):(35-45):(35-45)。
4.如权利要求3所述的一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液的质量浓度为4% ；FeCl3 6H20溶液的摩尔浓度为0. 2mol/L ；FeCl2 *4H20的摩尔浓度为0. lmol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的体积用量比为I :4 :4。
5.如权利要求2所述的一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的步骤I)的反应温度为20-40°C，反应时间为20-40min。
6.如权利要求I所述的一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的步骤2)将步骤I)制备的TODA-Fe3O4磁性纳米粒子粉末和酶液加入到pH=6的缓冲溶液中，混合均匀后，加入戊二醛溶液，充分交联；交联完成后，用离心机以9000r/min的转速离心5min，倒出离心液，用水冲洗附于离心管壁上的物质，再离心，倒去离心液，反复数次后，最终附于离心管壁上的物质即为固定化葡萄糖氧化酶。
7.如权利要求6所述的一种以PDDA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的I3DDA-Fe3O4纳米粒子用量为0. 05-0. 15g ;所述的pH=6的缓冲溶液采用0. 2 mol/L磷酸氢二钠溶液和0. I mol/L柠檬酸溶液的混合溶液，用量为15_25mL ；所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma IOOOOu)用量为0. 3-2mg ;所述的戍二醒用量为 0. 01-0. 04mg。
8.如权利要求7所述的一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的I3DDA-Fe3O4纳米粒子用量为0. IOg ;所述的pH=6的缓冲溶液(配方0. 2 mol/L磷酸氢二钠溶液+0. I mol/L柠檬酸溶液)用量为20mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma IOOOOu)用量为I. 05mg ;所述的戊二醛用量为0. 02mg。
9.如权利要求6所述的一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的交联温度为10-40°C，交联时间为0. 5-2. 5h。
10.如权利要求9所述的一种以TODA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的交联温度为20°C，交联时间为lh。
全文摘要
本发明公开了一种以PDDA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤1)以聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐溶液、FeCl3·6H2O溶液和FeCl2·4H2O为原料制备PDDA-Fe3O4磁性纳米粒子；2)以PDDA-Fe3O4磁性纳米粒子为载体固定化葡萄糖氧化酶。本发明具有技术简单易行、制备出的载体具有高比表面积和良好的生物相容性、酶负载量高、酶活性高、酶的热稳定性和pH稳定性高，且在外加磁场作用下该固定化酶易于回收再利用的特点。
文档编号C12N11/14GK102796724SQ20121019934
公开日2012年11月28日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年6月13日
发明者白刚, 刘艳春, 钱红飞 申请人:绍兴文理学院