Ehbp1基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种EHBP1基因突变检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对C177T位点的SEQ?ID?NO.9及SEQ?ID?NO.10，针对C164T位点的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12，针对C158A位点的SEQ?ID?NO.13及SEQ?ID?NO.14，和/或针对G76A位点的SEQ?ID?NO.15及SEQ?ID?NO.16；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，能实现多个突变位点的野生型和突变型单独和并行检测。
【专利说明】EHBP1基因突变检测特异性引物和液相芯片
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种EHBPl基因突变检测特异性引物和液相芯片。【背景技术】
[0002]EHBPl基因称Ε?域结合蛋白I,英文名称为Ε? domain binding proteinl,位于2号染色体2pl5上，62900985到63273621碱基对之间。EHBPl基因包含一个假定的肌动蛋白结合调宁蛋白同源结构域，在一个完整的细胞上，该基因的高表达能够介导大量肌动蛋白的重组。EHBPl基因编码EPS15同源域蛋白，编码的蛋白在内吞作用白细胞聚集上发挥着作用，有研究表明，EHBPl基因的单核苷酸多态性与前列腺癌发生有关，EHBPl基因的缺陷可以导致机体对前列腺癌的遗传类型12 (HPC12)的易感性，而大多数的前列腺癌是由前列腺导管腺癌发展而来的。
[0003]目前，EHBPl基因突变检测方法主要有=Illumina光纤微珠芯片技术、SNPlexGenotyping System技术和突光定量PCR技术,虽然Illumina光纤微珠芯片技术是高灵敏度和精确性的高通量检测系统，但是自动化程度低，手工操作比较多，难以满足实际应用的需要,SNPlexTMSystem技术对SNP序列特异性要求较高，不能随意地分析所选择的单核苷酸多态性位点，难以应用于临床检测诊断，而且该方法操作比较复杂，不能满足实际应用的需要。荧光定量PCR技术灵敏度高、特异性强、自动化程度高的特点，但存在样品易污染、假阳性率高的缺点，且每次只能检测一种突变类型，同样不能满足实际应用的需要。
[0004]本发明目标检测的EHBPI基因突变位点，如表所示:
[0005]
序号|EHBP1基因位点突变的内容[Wl~
1SEQ ID N0.41的第177位核苷酸，发生C — T突变 C177T
2SEQ ID N0.42的第164位核苷酸，发生C — T突变 C164T
3SEQ ID N0.43的第158位核苷酸，发生C — A突变 C158A
6SEQ ID N0.44的第76位核苷酸，发生G — A突变 G76A~
[0006]SEQ ID N0.41 突变位点:C177T
[0007]CTACGAGCACACACACCACACTTAGCTGATTTTTGAAAATATTTTTGTGGAGATGGGGGTCTCACTACGTTGCCCAGGCTGGTCTTGAACTCCTGGCTTCAAGCAACCCTCCCATCACAGACTCCCAAAGTGGTGGGATTATAGGCATGAGCCACTGCCTCTGGACTCACTGGCAT Q CCATATAGCACATATTATGTTGTAGGCACTTTGCTAGACTCTAAAGTGATAAACAGACACTTATGGTAATGTTTTTGTTGTCGCTTTTTGAGACAGGGTCTTGCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAATGGCACAATCTCAGCTTACTGCAGCCTCAACCTCCTAAACTCAAGCAATTCTCCCACCTCAGCCTCC
[0008]SEQ ID N0.42 突变位点:C164T[0009]AGTCTTTGCTTTGGCAGTCTGGGAGGGATCTTCACATGGGAAGAGTCACTTGAGTTAGATCTCAAGTGAGATATAACTTGAGTTAGGTCAGCCAATCCCCCAGTCCTCCAGGGGTACCCCCACACCTGGCAGGGCTCCTGTTCCACACTGAGGTCCTTATTC0CCAAGGGACCTTGATAATCCTCAGGGGTTCTGCCACCATCGGGCAGCCCATGGGCCGGGGGGGTGAAGCACATGGGCTCAAGTTCCAGTCCTGGCTGACACCTAACTCATGGGGTAACCTTGGGCAAACTACCTAAATCCTTTGTGTCTGTTTCCTCCTCT
[0010]SEQ ID N0.43 突变位点:C158A
[0011 ] GCATTCTCTGGACTCTTACAAGGACACTAATCCATTAATAAGGAGTCTAGCCTCATGACCTCATCTAAGCCTAATTACTTTCCAAAAACTATCTCCTAGTACCATCTCATTAAGGGTTAGGGTTTCAACTTACGAATTTTAGGG
ggacacaagcatcQagttcataacaaatatcttttcttgagtgtatttgatatctgtctgtcctctttggtgaaat
GTCTGTCAGTGCCTTTTGCCCATTTTCTAATTAAGTTATTTGCTATTGCATTATTATTGATTTCCTACAAGTTAACT TTAATCTCTCTAGTTTTGGTTCCTGACTGAAGTTTATTTTGTCCTGGAGGAGGAACATTTGGCAATGTCTATATATG
CCTTCAGTTGTCACACGAG
[0012]SEQ ID N0.44 突变位点:G76A
[0013]TCCCTCAACATCTGTCCCTTTCTGAAAAAGTACATCCTTAGGCTTGATTTTTGGCTTCCTAAGTAAATGCTTACT@TGAGCATTAATATTAATAACAATAGTTTACATTTATTGAAGACTTCCCATCTACTATGTAAACCATTTGGAAGAAGAAAACAATAAAGAAAAAAGATTGACTGGGTGCGGTGGCTCACGCCTGTAATACCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCAGGTGGATCACAAGGTCAGGAGTTCAAGAC
【发明内容】
[0014]本发明的目的之一是提供EHBPl基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测EHBPl基因四种常见基因型C177T、C164T、C158A和G76A的野生型和突变型。
[0015]实现上述目的的技术方案如下:
[0016]一种EHBPl基因突变检测液相芯片，包括有:
[0017](A).针对EHBPl基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对C177T位点的SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10，针对C164T位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，针对 C158A 位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和/或针对G76A位点的SEQ ID N0.15及SEQ ID N0.16 ;所述tag序列选自SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.8 ；
[0018](B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.17~SEQ ID N0.24，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
[0019]( C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
[0020]在其中一些实施例中，所述扩增引物是:针对C177T位点的SEQ ID N0.25及SEQID N0.26，针对 C164T 位点的 SEQ ID N0.27 及 SEQ ID N0.28，针对 C158A 位点的 SEQ IDN0.29 及 SEQ ID N0.30，和 / 或针对 G76A 位点的 SEQ ID N0.31 及 SEQ ID N0.32。
[0021]在其中一些实施例中，所述ASPE引物为:针对C177T位点的由SEQ ID N0.1和SEQID N0.9组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.10组成的序列，针对C164T位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.11组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.12组成的序列，针对C158A位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.13组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQID N0.14组成的序列，和/或针对G76A位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.15组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.16组成的序列。
[0022] 本发明的另一目的是提供用于EHBPl基因突变检测的特异性引物。
[0023]实现上述目的的技术方案如下:
[0024]用于EHBPl基因突变检测的特异性引物，所述特异性引物序列为:针对C177T位点的 SEQID N0.9 及 SEQ ID N0.10，针对 C164T 位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，针对 C158A 位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 / 或针对 G76A 位点的 SEQ ID N0.15 及SEQ ID N0.16。
[0025]本发明的主要优点在于:
[0026]1.本发明所提供的EHBPl基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的EHBPl基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
[0027]2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。
[0028]3.本发明的检测方法步骤简单，4种突变位点检测可通过一步PCR即可完成4条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
[0029]4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
【具体实施方式】
[0030]实施例1EHBPl基因突变检测液相芯片，主要包括有:
[0031]一、ASPE 引物
[0032]针对EHBPl基因四种常见基因型C177T、C164T、C158A和G76A的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
[0033]表1EHBPl基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特异性引物序列)
【权利要求】
1.一种EHBPl基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有: (A).针对EHBPl基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对C177T位点的SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10，针对C164T位点的SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，针对 C158A 位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 / 或针对 G76A 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 ~SEQID N0.8 ； (B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.17~SEQ ID N0.24，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的EHBPl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物是:针对C177T 位点的 SEQ ID N0.25 及 SEQ ID N0.26，针对 C164T 位点的 SEQ ID N0.27 及 SEQID N0.28，针对 C158A 位点的 SEQ ID N0.29 及 SEQ ID N0.30，和 / 或针对 G76A 位点的 SEQID N0.31 及 SEQ ID N0.32。
3.根据权利要求1或2所述的EHBPl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为:针对C177T位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.9组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.10组成的序列，针对C164T位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.11组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.12组成的序列，针对C158A位点的由SEQ ID N0.5和SEQID N0.13组成的序列及 由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.14组成的序列，和/或针对G76A位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.15组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.16组成的序列。
4.根据权利要求1所述的EHBPl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10 个 T。
5.用于EHBPl基因突变检测的特异性引物，其特征是，所述特异性引物序列为:针对C177T 位点的 SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10，针对 C164T 位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ IDN0.12，针对 C158A 位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 / 或针对 G76A 位点的 SEQ IDN0.15 及 SEQ ID N0.16。
【文档编号】C12N15/11GK103571931SQ201210259510
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月18日 优先权日:2012年7月18日
【发明者】许嘉森, 吴诗扬 申请人:益善生物技术股份有限公司