专利名称：高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及到疫苗的生产领域，具体地，是涉及到一种高效表达HA蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用。技术领域流感是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的一种急性、高度接触性传染 病，高致病性禽流感被国际动物卫生组织确定为A类疫病。流感病毒根据基质蛋白(Matrixprotein,Μ)的不同可以分为A、B、C三型。根据流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)抗原性的差异,又可将流感病毒分为不同的亚型，A型流感病毒根据HA划分为16个亚型，根据NA划分为9个亚型。流感病毒具有高度传染性，可通过飞沫传播，因此它能在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界大流行。1983-1984年，美国宾州的高致病性禽流感暴发，造成1700万家禽死亡，损失近6500万美元。2003年年底，亚洲多个国家和地区暴发了高致病性的禽流感。禽流感的暴发，使I亿多只家禽死亡或被扑杀，部分国家禽肉产量和销售量急剧下降，价格下跌，禽肉及其制品进出口暂时中止；此外，家禽养殖业、饲料行业和旅游业也都受到不利的影响。据粮农组织估计，由此遭受的损失至少为5亿美元。此外，许多亚型的禽流感病毒具有跨宿主传播至人的能力，因而，该病的暴发也同时危害着社会公共安全。二十世纪爆发了三次流感的大流行，分别是1918年西班牙流感(HlNl)、1957年亚洲流感(H2N2)和1968年香港流感(H3N2)，其中最大规模的流行为西班牙流感。该流感疫病造成全球2000万人的死亡，超过第一次世界大战死亡人数,列全球所有传染病死亡的第一位。流感病毒的基因组由单股，负义RNA片段组成.。A型流感病毒分为8个片段，编码11种功能蛋白，片段1、2、3分别编码三个聚合酶蛋白PB2、PB1和PA ;片段4编码血凝素HA ;片段5编码核衣壳蛋白NP ;片段6编码神经氨酸酶NA ;片段7编码基质蛋白Ml和离子通道M2 ;片段8编码非结构蛋白NSl和NS2。其中HA和NA是流感病毒最主要的两种表面糖蛋白，HA蛋白是流感病毒最重要的保护性抗原。目前，各国对动物和人流感的预防控制采取了不同的措施，但是疫苗接种仍然是预防流感的最佳选择，因此研制有效的流感疫苗对于控制流感流行具有极其重要的意义。全病毒灭活疫苗是目前应用最广泛的疫苗，该疫苗安全性好，不会出现毒力返强和变异的危险，能够经受同种亚型流感病毒的攻击。目前已上市的流感疫苗基本都是使用鸡胚培养制备，国内外使用鸡胚培养疫苗已经有50年历史。由于鸡胚生产流感疫苗需要消耗大量的鸡胚，鸡胚带有潜在污染可能，而且培养周期过长，不易于扩大产量，不利于应对大规模的流感爆发。为此，世界卫生组织、美国政府等都鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗。为加快细胞培养流感疫苗技术的开发，美国政府决定投资11亿美元资助葛兰素史克、edlmmune、诺华、DynPort、Solvay和巴斯德6个主要的流感疫苗开发新技术。在2007年，全球最大的生物制药公司之一诺华宣布其人用流感疫苗Optaflu上市，成为唯一获批(欧盟批准)的人用细胞培养流感疫苗，是50年流感疫苗生产史最重大的创新
之一 。无论采用鸡胚法和大规模细胞制备法获得病毒，重要的影响因素便是疫苗种毒本身是不是高产量的病毒株。A/Puerto Rico/8/34(PR8)是一株鸡胚适应病毒株，是目前在鸡胚上高产株之一，疫苗研制中常常将PR8的6个内部基因与流行毒株的HA和NA基因重组(6+2模式)，将重组病毒作为疫苗株来提高病毒滴度。为了进一步提高PR8的病毒滴度，满足在流感大暴发时，巨大的疫苗需求量，科研人员进行了大量的研究，通过优化病毒基因来提高病毒株产量。研究发现该流感病毒一些蛋白的某个氨基酸位点对该病毒的增殖能力具有重要的影响，如PB2上360位的酪氨酸(Tyr)和NSl上55位的谷氨酸(Glu)也起到一定作用。
发明内容
本发明的目的之一，在于提供一种PR8突变重组流感病毒，该重组流感病毒可高效表达HA蛋白，适用于大规模生产流感疫苗。实现上述目的技术方案如下一种PR8重组流感病毒，其含有Hl亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2, PA，NP, M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变，所述Hl亚型流感病毒是除PR8病毒以外的Hl亚型流感病毒(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一种PR8重组流感病毒，其含有H3亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因( 81，？82，？么，册^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一种PR8重组流感病毒，其含有H4亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因( 81，？82，？么，册^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一种PR8重组流感病毒，其含有H5亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因( 81，？82，？么，册^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一种PR8重组流感病毒，其含有H6亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因( 81，？82，？么，册^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一种PR8重组流感病毒，其含有H7亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因( 81，？82，？么，册^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一种PR8重组流感病毒，其含有H9亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因( 81，？82，？么，册^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一种PR8重组流感病毒，其含有HlO亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因( 81，？82，？么，册^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO 24-27 所示)。本发明的另一目的是提供制备上述PR8重组流感病毒的方法。实现该目的的技术方案如下一种制备上述PR8重组流感病毒的方法，包括以下步骤构建分别包含Hl、H3、H4、H5、H6、H7、H9、HlO亚型流感病毒的HA和NA基因的重
组质粒；构建包含PR8病毒突变基因片段的重组质粒，该PR8病毒突变基因片段选自下述突变的NS或NP基因片段编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段，编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段；将上述各亚型流感病毒的HA基因的重组质粒和NA基因的重组质粒，与上述包含PR8病毒突变基因片段的重组质粒、以及分别包含PR8病毒PA、PB1、PB2、M、NP或NS内部基因的质粒按相应组合一起转染293T细胞，培养转染后的细胞；将培养的细胞上清接种于鸡胚，在孵化器内培养合适时间后，收获鸡胚尿囊液，检测该尿囊液的血凝性，如果有血凝活性，并且经过序列分析确定没有非预期突变后，即获得PR8重组流感病毒。在本发明的具体实施例中，制备上述PR8重组流感病毒的方法，包括以下步骤(一 )、构建重组质粒
八、获得!11、!13、!14、册，册、!17、!19、!110亚型流感病毒的拟和嫩基因；获得!11、!13、!14、册、册、!17、!19、!110亚型流感病毒的拟和嫩基因的方法为分别抽提HI、H3、H4、H5、H6、H9和HlO亚型流感病毒的总RNA ；分别以总RNA为模板，反转录合成Hl、H3、H4、H5、H6、H9、HlO亚型流感病毒的cDNA ；以获得的cDNA 为模板，分别用 SEQ ID. NO 13 和 SEQ ID. NO 14 以及 SEQ ID. NO 11和SEQ ID. NO 12为上下游引物，分别扩增出HI、H3、H4、H6、H9、HlO亚型流感病毒的HA基因和HI、H3、H4、H5、H6、H9、HlO亚型流感病毒的NA基因；以H5亚型流感病毒的cDNA为模板，用突变H5HA碱性裂解位点的引物SEQ ID. NO
15和 SEQ ID. NO :13、及引物 SEQ ID. N0:16 和 SEQ ID. NO :14 分别扩增，再用 SEQ ID. NO 13和SEQ ID. NO 14引物进行PCR融合扩增，获得含有低致病性禽流感毒株碱性裂解位点的H5N1亚型流感病毒的HA基因；所述H7亚型流感病毒的HA和NA基因的制备为人工合成H7亚型流感病毒的NA基因和含有低致病性禽流感毒株碱性裂解位点的HA基因，并用SEQ ID. NO 13和SEQID. NO :14和SEQ ID. NO 11和SEQ ID. NO 12为上下游引物，分别进行扩增，分别扩增出H7亚型流感病毒的HA基因和NA基因。B、分别获得编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段；优选地，所述分别获得编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段的制备为以含有PR8病毒NP基因的重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID. NO :7和SEQID. NO 6以及引物SEQ ID. NO 5和SEQ ID. NO 8在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID. NO :7和SEQ ID. NO 8为引物，进行第二次PCR扩增融合，获得点突变G132A的PR8病毒NP基因片段；以PBD-PR8NS重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID. NO 9和SEQ ID. NO 2以及引物SEQ ID. NO : I和SEQ ID. NO : 10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID. NO 9和SEQ ID. NO 10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码含有E67S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；
以PBD-PR8NS重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO 4以及SEQID. NO :3和引物SEQ ID.N0:10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO : 10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码含有E74S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；以上述的编码含有E67S定点突变NS2蛋白的NS基因片段为模板，分别用引物SEQ ID. NO 9 和 SEQ ID. NO 4 以及引物 SEQ ID. NO 3 和 SEQ ID. NO :10 在 Pfx DNA 聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO 10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码同时含有E74S和E74S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；C、制备重组质粒分别将获得的编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段和上述获得的HA和NA基因经过酶切、连接及转化，获得相应的重组质粒；所述重组质粒为以下中的一种以上PBD-(HI)HA、PBD-(HI)NA ；PBD-(H3)HA、PBD-(H3)NA ；PBD-(H4)HA、PBD-(H4N2) NA ；PBD-(H5) HA、PBD-(H5) NA ；PBD-(H6)HA、PBD-(H6)NA ；PBD- (H7)HA、PBD- (H7)NA ;PBD-(H9)HA、PBD-(H9) NA ;PBD_ (HlO) HA、PBD-(HlO)NA ;PBD-PR8NS_NS2E67/74S、PBD-PR8NS-NS2E67S、PBD-PR8NS-NS2E74S、PBD-PR8NP-G132A、PBD-PR8PB1、PBD-PR8PB2、 PBD-PR8PA、PBD-PR8NP、PBD-PR8M、PBD PR8NS(Zejun Li, et al. JVI, 2005, 79 (18)12058-12064)。(二)、制备PR8重组流感病毒将上述获得的重组质粒按照相应组合，转染于293T细胞；转染后的细胞上清用TPCK-Trypsin处理后，接种SPF鸡胚，培养；收获鸡胚尿囊液，获得上述的PR8重组流感病毒。本发明的另一目的是上述PR8重组流感病毒的应用。具体技术方案如下上述任一所述的PR8重组流感病毒在制备流感疫苗中的应用。本发明的发明人发现当PR8病毒株的NS2蛋白第67位氨基酸由E突变为S(E67S点突变)，或NS2蛋白第74位氨基酸由E突变成S (E74S点突变)，或NS2蛋白第64和74位氨基酸同时由E突变成S(E67S/E74S点突变)，病毒突变株在鸡胚上的增殖能力明显提高。此外，NP蛋白的第132位氨基酸由G突变为A时(G132A点突变)，突变体的病毒株在细胞上的增殖能力明显提高。利用这些高增殖能力突突病毒的内部基因和不同亚型(H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10)流感病毒进行人工重组，获得本发明所述的高效表达HA抗原的重组病毒，这些重组病毒可用于大规模制备流感疫苗。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图I重组PR8突变病毒及重组PR8病毒在鸡胚上的血凝活性。图2重组PR8突变病毒及重组PR8病毒在细胞上的血凝活性。
具体实施例方式实施例I重组质粒的构建与鉴定I、引物设计
设计流感病毒PR8的NS和NP的突变引物；流感病毒12bp反转录引物、A型流感的通用引物、H5和H7HA裂解位点突变引物由本实验室设计。上述引物具体的序列见表1(本发明中所用到的引物序列，具体见表I)，均由上海Invitrogen公司合成。2、两点定点突变采用两步PCR方法对预期突变氨基酸位点的核苷酸进行突变。首先以PBD-PR8NP为模板，分别用 BSPQI-NP-forward 和 PR8-NP-400R 以及 PR8-NP-387F 和 BSPQI-NP-reverse为上下游引物，在Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)的作用下分别进行PCR扩增。PCR获得的两个片段，通过胶回收试剂盒回收。以回收的两段PCR产物为模板，以BSPQI-NP-forward和BSPQI-NP-reverse为引物，进行第二次PCR融合。如此获得编码G132A点突变的NP蛋白的NP基因片段。PCR扩增程序为94°C预变性5min，进入以下循环，94°C变性45s，53 °C退火45s，72°C延伸lmin-lmin45s，运行30个循环，最后再72°C延伸lOmin。反应结束后，PCR 产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳实验。用同样的方法，利用表I中NS2突变引物PR8-NS2-193F、PR8-NS2-204R，PR8-NS2-215F、PR8-NS2-224R和NS基因扩增引物BSPQI_NS-forward和BSPQI-NS-reverse分别获得含有NS2E67S、E74S和NS2E67/74S点突变的NS基因PCR扩增产物。具体如下以PBD-PR8NS重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO 2以及引物SEQ ID.N0:1和SEQ ID.N0:10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO : 10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码含有E67S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；以PBD-PR8NS重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO 4以及SEQID. NO :3和引物SEQ ID.N0:10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO : 10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码含有E74S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；以上述的编码含有E67S定点突变NS2蛋白的NS基因片段模板，分别用引物SEQID. NO 9 和 SEQ ID. NO 4 以及引物 SEQ ID. NO 3 和 SEQ ID. NO :10 在 Pfx DNA 聚合酶的作用下分别进行PCR扩增;以两段PCR产物为模板，以SEQ ID. NO :9和SEQ ID.N0:10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码同时含有E74S和E74S定点突变NS2蛋白的NS基因片段。3、HA和NA基因的PCR扩增HA和NA基因来源于不同亚型的流感病毒(HxNy，代表H1N1、H3N2、H4N2、H5N1、H6N4、H7N7、H9N2、H10N8亚型流感病毒)。除H7N7亚型流感外，其他病毒用Trizol (Invitrogen)抽提总 RNA。用反转录试剂盒(TakaRa),根据其说明书，用12bp引物5' -AGCAAAAGCAGG-3'(表I)为特异性引物，合成cDNA第一链。以获得的cDNA的第一链为模板，用 BSPQI-HA-forward、BSPQI-HA-reverse 和 BSPQI-NA-forward、BSPQI-NA-reverse为上下游引物(含有BspQI酶切位点，如表1)，分别扩增出片段的!1謂1、!13吧、!14吧、册财、H9N2、H10N8 亚型流感病毒的 HA 和 H1N1、H3N2、H4N2、H5N1、H6N4、H9N2、H10N8 亚型流感病毒的NA基因。PCR扩增程序为94 V预变性5min，进入以下循环，94°C变性45s，53 V退火45s，72°C延伸lmin45s，运行30个循环，最后再72°C延伸lOmin。反应结束后，PCR产物在
I.O %琼脂糖凝胶上进行电泳验证。
抽提获得H5N1亚型流感病毒HA基因后，用突变H5HA碱性裂解位点的下游引物H5_reverse和BSPQI-HA-forward、突变碱性裂解位点的上游引物H5_forward和BSPQI-HA-reverse 分别进行 PCR 扩增，再用 BSPQI-HA-forward、BSPQI-HA_reverse 引物进行融合PCR。PCR扩增程序为94°C预变性5min，进入以下循环，94°C变性45s，53 °C退火45s，72°C延伸lmin45s， 运行30个循环，最后再72°C延伸lOmin。反应结束后，PCR产物在I. 0%琼脂糖凝胶上进行电泳验证。获得含有低致病性禽流感毒株碱性裂解位点的H5的HA基因。在本研究中人工合成了 H7N7流感病毒的NA基因和含有低致病性禽流感毒株碱性裂解位点的 HA 基因，并用 BSPQI-HA-forward、BSPQI-HA-reverse 和 BSPQI-NA-forward、BSPQI-NA-reverse为上下游引物(含有BspQI酶切位点，如表I)，分别进行了 PCR扩增。PCR扩增程序为94°C预变性5min，进入以下循环，94°C变性45s，53°C退火45s，72°C延伸lmin45s，运行30个循环，最后再72°C延伸lOmin。反应结束后，PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳验证。4、PCR产物的割胶回收电泳结束后在紫外光下从凝胶上切下目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用DNA快速回收试剂盒回收DNA。具体方法如下在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，放入一无菌的L 5ml的EP管中，加入3倍凝胶体积(IOOmg = IOOul体积)的Buffer DE-A(凝胶液)，混合均匀后于75°C加热，间断混合(2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6_8min)。加入O. 5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B (结合液)，混合均勻；当回收的DNA片段小于400bp时,加入I个凝胶体积的异丙醇。将混合液转移到DNA制备管中，12000Xg离心Imin,倒掉收集管中的废液。将制备管置回收集管中，加入500ul Buffer Wl (洗涤液)，12000 X g离心30s，弃掉收集管中的废液。将制备管置回收集管中，加入700ul Buffer W2(去盐液)，12000Xg离心lmin，弃掉收集管中的废液，以同样的方法再洗一次。将制备管置回收集管中，12000\8空离11^11。最后将制备管置于洁净的I. 5ml EP管中，在制备膜中央加入30ul的去离子水，室温静置lmin，12000Xg离心Imin洗脱DNA，置于_20°C保存备用。5、酶切、连接及转化上述PCR纯化产物与PBD载体(ZejunLi，et al. JVI, 2005, 79 (18) :12058-12064)分别用BSPQI限制性内切酶进行消化，用胶回收试剂盒回收目的片段与PBD质粒的酶切产物，然后用T4连接酶将酶切后的PCR产物与酶切处理的PBD载体进行连接。连接产物转化于感受态细胞JM109(上海索莱生物科技有限公司)，无菌条件下涂布于含Amp的LB固体培养基上，37 °C培养8-20h。6、重组质粒的鉴定挑取LB固体培养基上的单个菌落，放入加有约3ml含Amp的LB液体培养基的试管中，37°C振荡培养10h。将菌液用碱性抽提法抽提的质粒，用PCR方法进行验证。鉴定为阳性的质粒进行序列测定，用DNAstar序列分析软件进行序列分析，确定序列正确无误。分别如SEQID. NO 20-23所示的核酸序列，或其氨基酸序列为SEQ ID. NO :24_27。此外，各个亚型的HA和NA基因的序列经核实也是正确的。表1NS2、NP基因的定点突变引物和A型流感病毒通用引物
权利要求
1.一种PR8重组流感病毒，其特征在于，其含有H6亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因( 81，？82，？么，册^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。
2.一种制备权利要求I所述的PR8重组流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤 构建分别包含H6亚型流感病毒的HA和NA基因的重组质粒； 构建包含PR8病毒突变基因片段的重组质粒，该PR8病毒突变基因片段选自下述突变的NS或NP基因片段编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段，编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段； 将上述H6亚型流感病毒的HA基因的重组质粒和NA基因的重组质粒，与上述包含PR8病毒突变基因片段的重组质粒、以及分别包含PR8病毒PA、PBU PB2、M、NP或NS内部基因的质粒按相应组合一起转染293T细胞，培养转染后的细胞； 将培养的细胞上清接种于鸡胚，在孵化器内培养合适时间后，收获鸡胚尿囊液，检测该尿囊液的血凝性，如果有血凝活性，并且经过序列分析确定没有非预期突变后，即获得PR8重组流感病毒。
3.权利要求I所述的PR8重组流感病毒在制备流感疫苗中的应用。
4.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求I所述的PR8重组流感病毒。
全文摘要
本发明公开了一种PR8重组流感病毒，该重组流感病毒含有H6亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。本发明还公开了上述PR8重组流感病毒的制备方法和应用。本发明通过构建重组质粒、共转染细胞和SPF鸡胚扩增得到的PR8重组流感病毒，能高效表达HA蛋白和/或NA基因，可用于大规模制备流感疫苗。
文档编号C12N15/44GK102839160SQ201210349518
公开日2012年12月26日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者李泽君, 滕巧泱 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所