专利名称：抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种RNA干扰载体，特别涉及一种抑制猪源P53基因表达的RNA干扰载体及其制备与应用。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference, RNAi )是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA (double strandedRNA, dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。外源 dsRNA进入细胞后产生的小分子干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)的反义链和多种核酸 酶形成了沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC), RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程。RNAi的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程。这种技术已经成为研究基因功能的重要工具，并将在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括化学合成、体外转录、长片断dsRNAs 经 RNase III类降解(e. g. Dicer, E. coll, RNase III)、siRNA 表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs，以及PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达。其中，化学合成与体外转录方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA在细胞内的RNAi效应持续时间短。针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达，该方法的基本思路是将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果，具有表达稳定、持久，抑制效果明显的特点。通过质粒表达siRNAs大都是用Pol III启动子启动编码shRNA (short hairpinRNA)的序列。选用Pol III启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4-5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有Pol III启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。而且，由于质粒可以复制扩增，与其它合成方法相比，能够显著降低制备siRNA的成本。此外，带有抗生素标记的siRNA表达载体可用于长期抑制研究，通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达数星期甚至更久。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。
本发明的另一目的在于提供一种抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体。本发明的再一目的在于提供上述抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备方法。本发明的目的还在于提供上述干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板或抑制猪源P53基因表达的RNA干扰载体的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现通过大量筛选和实验得到干扰猪源p53基因的有效靶片段，其序列为
5 ’ -GTTGGGAGAATTTATGAAA-3’。根据上述靶片段序列设计shRNA的转录模板的正义链和反义链，loop结构的序列为TTCAAGAGA，转录终止序列采用6个T结构。为了便于插入载体，在正义链的5’端添加了BamH I酶切位点粘性末端GATCC，3’端添加了 Hind III酶切位点粘性末端A ；反义链的5’端添加了 Hind III酶切位点粘性末端AGCTT，3’端添加了 BamH I酶切位点粘性末端G。最终得到干扰猪源P53基因的shRNA的正义链，如SEQ ID NO. 2所示，干扰猪源p53基因的shRNA的反义链，如SEQ ID NO. 3所示。一种干扰猪源P53基因的ShRNA的转录模板为SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3退火杂交形成的双链DNA。—种抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体，具有如图I所不的结构，命名为pGenesilencer-GFP-p53，包括骨架载体、猪U6 RNA聚合酶III启动子和上述干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。所述的骨架载体为pEGFP-Cl载体；所述的pEGFP_Cl载体的多克隆位点中的BamHI和Hind III酶切位点进行了突变；所述的BamH I酶切位点由5’ -AAGCTT-3’突变为5’ -AAGTTT-3’，所述的 Hind III酶切位点由 5’ -GGATCC-3’ 突变为 5’ -GGAACC-3’。所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体具有骨架载体pEGFP_Cl的特性，其多克隆位点如图2所示。所述的猪U6 RNA聚合酶III启动子取代了 pEGFP_Cl载体的Π复制起点，在猪U6RNA聚合酶III启动子后接入了干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。上述抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备方法，包括如下步骤(I)突变 pEGFP-Cl 载体多克隆位点(multiple cloning site,MCS)中的 BamH I和Hind III酶切位点，得到BamH I和Hind III酶切位点突变的重组载体pEGFP-Cl-BH。(2) PCR扩增得到如SEQ ID NO. 4所示的Mlu I酶切位点+TAT+Spe I酶切位点+SV40ori (复制起点)序列+Stu I酶切位点的DNA片段S。(3)将步骤(2)得到的片段S和步骤(I)得到的重组载体pEGFP-Cl-BH分别用MluI和Stu I酶切，将酶切后的片段连接得到重组载体pEGFP-Cl-Spe I ；(4) PCR扩增得到如SEQ ID NO. 5所示的Spe I酶切位点+pU6基因全长序列(猪U6 RNA聚合酶III启动子序列)+BamH I酶切位点+ATA+Hind III酶切位点+Mlu I酶切位点的DNA片段U6。(5)将步骤(4)得到的片段U6和步骤(3)得到的重组载体pEGFP_Cl-Spe I分别用Spe I和Mlu I酶切，将酶切后的片段连接得到重组载体PEGFP-C1-U6。(6)将SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3退火杂交得到干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。(7)将步骤(5)得到的重组载体pEGFP-Cl-U6用BamH I和Hind III酶切，酶切后的片段与步骤(6)得到的干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板连接得到抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体。步骤(I)中所述的突变的方法优选为①以pEGFP-Cl载体上1386_1646bp片段(SP Sma I到Mlu I酶切位点之间)为靶片段，设计BI和B2引物突变掉BamH I酶切位点，以pEGFP-Cl载体为模板，PCR扩增得到靶片段B; BI :5，-CCCCGGGAACCCGGATCTAGATAA-3，，B2 :5’ -ACGCGTAGATACATTGATGAGTTTGGACAA-3’ ；②将①中得到的靶片段B和pEGFP-Cl载体分别用Sma I和Mlu I酶切，将酶切后的片段连接得到BamH I酶切位点突变的重组载体pEGFP_Cl_B ；③以pEGFP-Cl载体上606_1357bp片段(即Nhe I到EcoR I酶切位点之间)为靶片段，设计Hl和H2引物突变掉Hind III酶切位点，以pEGFP-Cl载体为模板，PCR扩增得到靶片段H;Hl :5，-CTAGCTAGCTACCGGTCGCCA-3，，H2 :5， -GGAATTCGAAGTTTTTGAGCTCGA-3，；④将③中得到的靶片段H和②中得到的重组载体pEGFP-Cl-B分别用Nhe I和EcoR I酶切，将酶切后的片段连接得到BamH I和Hind III酶切位点突变的重组载体pEGFP-Cl-BH。步骤(2)中所述的PCR扩增是以pEGFP-Cl载体为模板、S上游和S下游为引物，S 上游5，-CGACGCGTTATACTAGTGGTGTGGAAAGTCCCCA-3，，S 下游5，-GAAGGCCTTAGGCCTCCAAAAAAGCCTC-3，。步骤(4)中所述的PCR扩增是以ST细胞(猪睾丸细胞)的cDNA为模板、pU6_上游和pU6-下游为引物，pU6-上游5，-GGACTAGTTGGCTCCAGACCTCGCGGTGGT-3，，pU6-下游5，-CGACGCGTAAGCTTATAGGATCCTGTGCTGCCGAAGCGA-3，。步骤(6)中所述的退火杂交的条件优选为95°C，5min ；72°C,15min ;4°C保存。上述干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板或抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体在抑制猪源P53基因表达中的应用。上述抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体在抑制猪源靶基因中的应用，通过将干扰猪源靶基因的shRNA的转录模板取代干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板实现。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)本发明公开的干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板和抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体能有效抑制猪源p53基因的表达。(2)抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体可以在猪源细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久，可以进行较长期研究；即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有助于富集带质粒的细胞，可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。
(3)抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体具有骨架载体pEGFP_Cl的特性，其以EGFP作为转录效率指示标记,原核筛选标志Kan和真核筛选标志neo共用同为一段基因,质粒相对较小，可实施流式筛选和G418筛选；还可以表达外源基因，有利于稳定表达外源蛋白或基因敲除靶基因的细胞系的筛选。(4)通过将干扰猪源靶基因的shRNA的转录模板取代干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板能够得到抑制猪源其它基因表达的RNA干扰载体，为研究其它猪源基因的作用提供了基础。
图I是抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体结构图。图2抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的多克隆位点示意图。 图3是靶片段B PCR扩增结果图。图4是靶片段H PCR扩增结果图。图5是片段S结构示意图。图6是片段S PCR扩增结果图。图7是片段U结构示意图。图8是片段U PCR扩增结果图。图9是相对荧光定量-PCR检测PK-15细胞内p53基因的表达水平图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。表I.实施例中所用序列
名称l￥￥lSiBJ位点
Bi5，-CCCCGGGAACC(GGATCTAGATAA-3，Sma I
B25，-ACGCGTAGATAC—AJTGATGAGTTTGGACAA-3’Mlu I
Hl5'-CTAGCTAGCTACCGGTCGCCA-3'Nhe I
H2S3-Ggaattcgaagtttttgagctcga-S1EcoR I
$上游 s^cgacgcgttatactagtggtgtggAaagtcccca-Bimiu ι , sPe I
s —卜'游 5 ^gaaggccttaggcctccaaaaaagcctc-s ’Stu I
pU6-丨:游 S'-GGACmGITGGCTCCAGACCTCGCGGTGGT-S*Spc I
pU6-卜■游 5'-CGACGCGTAAGCTTATAGGATCCTGTGCTGCCGAAGCGA-3， Spe I、HmdIIl、
BamH I
p53 shRNA 5'-GATCCGTTGGGAGAATTTATGAAATTCAAGAGAWTC'ATAAATTI 丨义"Hi CTC’CT A ACTTTTTTA-3'_.....p53"shRNA.............5,:AGCT^AAAAAGTTGGGAGA^^^AA^CTC^^^................................................................................................
权利要求
1.一种干扰猪源P53基因的ShRNA的转录模板，其特征在于为SEQ ID NO. 2和SEQID NO. 3退火杂交形成的双链DNA。
2.一种抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体，其特征在于包括骨架载体、猪U6 RNA聚合酶III启动子和权利要求I所述的干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。
3.根据权利要求2所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体，其特征在于 所述的骨架载体为pEGFP-Cl载体；所述的pEGFP-Cl载体的多克隆位点中的BamH I和Hind III酶切位点进行了突变； 所述的猪U6RNA聚合酶III启动子取代了 pEGFP-Cl载体的Π复制起点，在猪U6 RNA聚合酶III启动子后接入了权利要求I所述的干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。
4.根据权利要求3所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体，其特征在于所述的BamH I酶切位点由AAGCTT突变为AAGTTT，所述的Hind III酶切位点由GGATCC突变为GGAACC。
5.权利要求4所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1)突变pEGFP-Cl载体多克隆位点中的BamHI和Hind III酶切位点，得到BamH I和Hind III酶切位点突变的重组载体pEGFP-Cl-BH ； (2)PCR扩增得到如SEQID NO. 4所示的Mlu I酶切位点+TAT+Spe I酶切位点+SV40复制起点序列+Stu I酶切位点的DNA片段S ； (3)将步骤(2)得到的片段S和步骤(I)得到的重组载体pEGFP-Cl-BH分别用MluI和Stu I酶切，将酶切后的片段连接得到重组载体pEGFP-Cl-Spe I ； (4)PCR扩增得到如SEQID NO. 5所示的Spe I酶切位点+猪U6 RNA聚合酶III启动子序列+BamH I酶切位点+ATA+Hind III酶切位点+Mlu I酶切位点的DNA片段U6 ； (5)将步骤(4)得到的片段U6和步骤(3)得到的重组载体pEGFP-Cl-SpeI分别用SpeI和Mlu I酶切，将酶切后的片段连接得到重组载体PEGFP-C1-U6 ； (6)将SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 3退火杂交得到干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板； (7)将步骤(5)得到的重组载体PEGFP-C1-U6用BamHI和Hind III酶切，酶切后的片段与步骤(6)得到的干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板连接得到抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体。
6.根据权利要求5所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备方法，其特征在于步骤(I)中所述的突变的方法为 ①以pEGFP-Cl载体上1386-1646bp片段为靶片段，设计BI和B2引物突变掉BamHI酶切位点，以pEGFP-Cl载体为模板，PCR扩增得到靶片段B ；BI :5’ -CCCCGGGAACCCGGATCTAGATAA-3’，B2 :5’ -ACGCGTAGATACATTGATGAGTTTGGACAA-3’ ； ②将①中得到的靶片段B和pEGFP-Cl载体分别用SmaI和Mlu I酶切，将酶切后的片段连接得到BamH I酶切位点突变的重组载体pEGFP_Cl_B ； ③以pEGFP-Cl载体上606-1357bp片段为靶片段，设计Hl和H2引物突变掉HindIII酶切位点，以pEGFP-Cl载体为模板，PCR扩增得到靶片段H ；Hl :5’ -CTAGCTAGCTACCGGTCGCCA-3’，H2 :5’ -GGAATTCGAAGTTTTTGAGCTCGA-3’ ； ④将③中得到的靶片段H和②中得到的重组载体pEGFP-Cl-B分别用Nhe I和EcoR I酶切，将酶切后的片段连接得到BamH I和Hind III酶切位点突变的重组载体pEGFP-Cl-BH。
7.根据权利要求5所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备方法，其特征在于 步骤(2)中所述的PCR扩增是以pEGFP-Cl载体为模板、S上游和S下游为引物，S 上游5’ -CGACGCGTTATACTAGTGGTGTGGAAAGTCCCCA-3’，S下游5’ -GAAGGCCTTAGGCCTCCAAAAAAGCCTC-3’ ； 步骤(4)中所述的PCR扩增U6是以ST细胞cDNA为模板、pU6_上游和pU6_下游为引物，pU6-上游5’ -GGACTAGTTGGCTCCAGACCTCGCGGTGGT-3’， pU6-下游5，-CGACGCGTAAGCTTATAGGATCCTGTGCTGCCGAAGCGA-3，。
8.根据权利要求5所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备方法，其特征在于 步骤(6)中所述的退火杂交条件为95°C，5min ；72°C,15min ;4°C保存。
9.权利要求I所述的干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板或权利要求2 4任一项所述的抑制猪源P53基因表达的RNA干扰载体在抑制猪源p53基因表达中的应用。
10.权利要求2 4任一项所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体在抑制猪源靶基因中的应用，其特征在于通过将干扰猪源靶基因的shRNA的转录模板取代干扰猪源P53基因的shRNA的转录模板实现。
全文摘要
本发明公开了一种抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体及其制备方法与应用，属于基因工程领域。该RNA干扰载体以pEGFP-C1为骨架载体，包括猪U6RNA聚合酶Ⅲ启动子和干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。将pEGFP-C1BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点突变；将猪U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子和干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板通过酶切和连接的方式引入到pEGFP-C1载体上得到。该RNA干扰载通过持续抑制靶基因的表达来进行RNA干扰研究和/或鉴定基因功能，为抗病转基因育种猪奠定了基础。
文档编号C12N15/85GK102839180SQ20121034946
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者沈海燕, 张建峰, 郭鹏举, 张春红, 周恒 , 朱余军 申请人:广东省农业科学院兽医研究所