一种培育高密度脱氮硫杆菌的方法
【专利摘要】本发明属于生物工程领域，涉及一种培育高密度脱氮硫杆菌（Thiobacillusdenitrificans，ATCC25259）的方法。所述的培菌方法为：往气升式生物反应器中按10～100∶1比例注入菌悬液和营养液；通入空气代替传统机械式搅拌进行曝气，曝气量为800～1200L/h，控制溶解氧浓度水平；维持气升式生物反应器中营养液的pH值为6～8、温度在25～35℃，电导率为20～60mS/cm。该培菌方法具有菌种培育与脱硫试验一体化、操作方便安全、培菌迅速、溶解氧供应充足且稳定、菌种丰富针对性强、驯化方式多样化等优点。
【专利说明】一种培育高密度脱氮硫杆菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物培育技术，应用于生物工程领域，具体涉及一种培育高密度脱氮硫杆菌的方法。
【背景技术】
[0002]含硫工业废气的治理已成为工业“三废”治理和控制大气污染物的一项重要任务。目前国内外去除含硫废气的脱硫技术主要可分为物理法、化学法和生物法。用传统的物理法或化学法处理含硫气体，具有使用设备繁多、工艺复杂、能耗大、二次污染处理过程复杂等缺点。微生物法能够有效脱硫的原因在于所选微生物不仅对废气适应较快，而且可使污染物得到降解和转化，且具有设备简单、费用低、不需再生和气体后处理、能耗少、管理维护方便等特点。因此，生物法已逐渐成为脱除含硫气体的一个重要研究方向。
[0003]生物脱硫过程主要依靠脱硫菌及菌群的代谢活动，所以高效脱硫微生物及菌群的筛选、培育、构建及其代谢机理是生物脱硫的关键与前提。由于生物酶催化反应的专一性，对于不同形态的硫，适用的脱硫细菌不一样。因此广泛查找自然界能代谢硫化物的微生物，筛选出高效、广谱脱臭菌群并进行深入地微生物学研究是现今工作重点之一。目前，常见的应用于H2S脱硫的无机化能自养硫杆菌属(Thiobacillus)主要有氧化亚铁硫杆菌(T.ferrooxidans)、脱氮硫杆菌(T.denitrificans)、氧化硫硫杆菌(T.thiooxidans)以及排硫硫杆菌(T.thioparus)等。其中,研究最广泛地是脱氮硫杆菌和氧化亚铁硫杆菌。
[0004]一方面，生物脱硫技术存在着菌种生长周期长，繁殖速度慢，不易调试，理论研究与实际应用相脱节 等主要问题；另一方面，现有的微生物培养主要在价格昂贵的发酵罐中进行，造成微生物培养成本增加，阻碍了生物脱硫技术在废气废液处理领域的推广应用。因此，结合废气处理微生物菌剂应用的特点，研究适宜的大规模培养方法，为进行含硫工业废气的微生物脱硫奠定物质基础。
【发明内容】
[0005]为解决现有技术中生物培育时间长、菌种单一、操作困难危险、驯化方式单一等不足，本发明的目的在于提供了一种采用气升式生物反应器进行气液两相培菌及反应器启动方法，具有培育迅速、菌种丰富针对性强、操作方便安全、驯化方式多样化等优点。
[0006]本发明培育高密度脱氮硫杆菌的气升式生物反应器，其特征是反应器内有一同心导流筒，反应器上部设有菌悬液加料口、营养液加液口和尾气排放口，反应器内部设有温度探头、PH探头、溶解氧探头、电导率探头和微孔布气器，反应器下部设有进气/液口、空气曝气管和营养液废液出口。温度探头、PH探头、电导率探头和溶解氧探头由电控装置操作控制。
[0007]本发明所述培育高密度脱氮硫杆菌的培菌方法，其特征是包括:
(1)往气升式生物反应器中按比例注入菌悬液和营养液；
(2)通入空气代替传统机械式搅拌进行曝气，并控制溶解氧浓度水平；(3)控制气升式生物反应器中pH值、温度在所述菌种适宜的范围内；
(4)控制内循环气升式生物反应器中的电导率，并通过定期排放营养液废液，并补充新 鲜营养液，维持电导率在一定内范围。
[0008]本发明培育高密度菌种方法是：先将菌悬液加入到气升式生物反应器中；然后按 照营养液：菌悬液=1(T100: 1配比，加入灭菌后的营养液，并调节初始pH值为中性。营 养液包括：Na2S203 8?12 g/L, KN03 4?6 g/L, Na2HP04 1 ?2 g/L, KH2P04 1 ?3 g/L, MgS04 0. 2?0. 6 g/L, NaHC03 0. 5?2. 0 g/L, NH4C1 0. 2?0. 8 g/L, CaCl2 0. 02^0. 05 g/L, MnS04 0. 01 ?0. 03 g/L, FeCl3 0. 01 ?0. 03 g/L,微量元素 10?20 mL/L。
[0009]所述培育高密度菌种方法中，利用硫代硫酸盐（S2032_)为能源，培养时间为广3天， 培养温度为25?35°C，培养pH为6?8，电导率为20?60 mS/cm,曝气量QAIK为800?1200 L/ h0
[0010]本发明所述的脱氮硫杆菌为脱氮硫杆菌（Thiobacillus denitrificans),革兰氏 染色阴性，光学显微镜下观察为短杆状，单个、成对或短链状排列；专性无机化能自养型，能 在好氧和厌氧条件下以硫代硫酸盐和S2_作为能源进行生长。30°C恒温培养箱中固体平板 培养，培养基表面上出现菌落，白色，透明，光滑，呈圆形，直径0. 2?lmm。
[0011]本发明的优点是：
用气升式生物反应器进行脱氮硫杆菌的培养，脱氮硫杆菌的培育密度可更快达到较高 水平，反应器能够给菌种提供更充足的溶解氧，且溶解氧的变化较稳定，培育系统具有启动 迅速、菌种丰富针对性强、操作方便安全、驯化方式多样化等优点。因此可见，气升式生物反 应器在脱氮硫杆菌的培养方法具有明显的技术优势。
[0012]本发明的脱氮硫杆菌培育的新型装置和工艺，整合集成多项高新技术，建立具有 我国自主知识产权的生物反应器式脱氮硫杆菌的高密度培育技术体系。而且气升式生物反 应器还将在废水废气处理、气体净化或分离等化工领域展现出良好的应用前景。该试验对 提高我国脱硫菌种培育技术与工艺水平，为将来脱硫菌种培育企业的技术改造与革新进行 必要的尖端技术储备与新型生物反应器的研发与升级均具有重要指导意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为本发明实施例中气升式生物反应器的结构示意图。
[0014]图中，1空气曝气管，2营养液废液排出口，3进气口，4菌悬液加料口，5尾气 排放口，6营养液加液口，7控温夹套，8固定条，9导流筒，10溶解氧电极，11 pH电极， 12电导率电极,13温度探头，14微孔布气器。
[0015]图2培养时间对脱氮硫杆菌生长活性影响。
[0016]图3培养温度对脱氮硫杆菌生长活性影响。
[0017]图4 pH值对脱氮硫杆菌生长活性影响。
[0018]图5曝气量对脱氮硫杆菌生长活性影响。
【具体实施方式】
[0019]下面通过实施例和附图，对本发明加以详细描述。
[0020]如附图1所示，本发明实施通过气升式生物反应器来实现的，气升式生物反应器内部有一导流筒9，通过上下两个固定条8，固定于反应器中心，导流筒下端距微孔布气器14处10~30cm。反应器上部设有菌悬液加料口 4、营养液加液口 6、尾气排放口 5。反应器下部设有进气/液口 3,底部设有空气曝气管1,曝气管1与微孔布气器14相通,并有营养液废液排出口 2 ;为控制溶解氧浓度、pH值和电导率值，反应器还设有在线检测的溶解氧电极10、pH电极11和电导率电极12，反应器的温度通过温度探头13测定，由反应器外部的控温夹套7来维持稳定。
[0021]所用分析测试方法为:脱氮硫杆菌生长曲线中生长指标OD (Optical Density)值采用7230G型分光光度计测定。
[0022]实施例1
按配方配备所需的营养液，置入三角瓶包扎后放入蒸汽灭菌锅中，进行高压湿热灭菌，在121℃~123°C、0.12 MPa下，灭菌20~30 min,取出冷却至室温。
[0023]使用上述灭菌营养液，以S2032_为能源，温度为30 V，pH=7,脱氮硫杆菌接种量为 10%，进行培养，分别在 Oh, 5 h, 15 h, 20 h, 25 h, 30 h, 40 h, 45 h, 50 h, 55h, 65h, 70 h，75 h，90 h，100 h取样测OD42tl，用未接种营养液作为对照。
[0024]试验结果图2表明:脱氮硫杆菌生长迅速，在15 h内保持在延滞期，菌体数目略有增长，然后细菌进入对数生长期，在此阶段(15h-30 h)，细菌生长活跃，大量繁殖。30 h后菌种进入稳定期，稳定期能够维持较长时间，生长70 h后，由于营养元素的逐渐消耗，细菌的生长进入衰亡期。
[0025]实施例2
使用上述灭菌营养液，以s2 032_为能源，脱氮硫杆菌接种量为10%，pH=7，在温度为2(T40°C范围内分别进行培养，取样测0D.，用未接种营养液作为对照。
[0026]试验结果图3表明:脱氮硫杆菌的最佳生长温度为25~35°C，30°C为脱氮硫杆菌最合适生长温度。低于25°C的培养温度对脱氮硫杆菌抑制生长显著；高于40°C的培养温度，脱氮硫杆菌生长亦受到显著的抑制。
[0027]实施例3
使用上述灭菌营养液，以s2 032_为能源，温度为30 V，脱氮硫杆菌接种量为10%，在PH=3-11范围内分别进行培养，取样测0D.，用未接种营养液作为对照。
[0028]试验结果图4表明:脱氮硫杆菌在pH值为5、时，尤其是在61范围内，菌种的OD值能维持在较高浓度，这是由于脱氮硫杆菌的最佳生长pH范围为6~8，而偏酸或偏碱都会对脱氮硫杆菌生长产生抑制。
[0029]实施例4
使用上述灭菌营养液，以s2032_为能源，温度为30 V，pH=7,脱氮硫杆菌接种量为10%，分别改变不同曝气量Qaik(Qaik=200，、500、1000、1500、2000 L/h)，进行培养，取样测OD420，用未接种营养液作为对照。
[0030]试验结果图5表明:随着Qaik的增大,溶解氧浓度逐渐增大；当脱氮硫杆菌的OD值在曝气量为1000 L/h时，达到较高水平，说明曝气量在达到1000 L/h时的溶解氧水平能够满足菌种生长的需要。在此基础上溶解氧的增加已不能大幅度提高菌种的生长，反而增加了物耗和能耗。
【权利要求】
1.一种培育高密度脱氮硫杆菌的方法，其特征在于按照以下步骤进行: (O往气升式生物反应器中注入菌悬液和营养液； (2)通入空气代替传统机械式搅拌进行曝气，通过曝气量调节溶解氧浓度水平； (3)控制气升式生物反应器中pH值为6~8、温度为25~35°C； (4)控制气升式生物反应器中的电导率，并通过定期排放营养液废液，并补充新鲜营养液，维持电导率20~60 mS/cm。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是先将菌悬液加入到气升式生物反应器中，然后按营养液:菌悬液=10-100:1配比，加入营养液，并调节混合液初始pH值为中性。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述营养液包括=Na2S2O38^12 g/L、KNO3 4飞g/L、Na2HPO4 2 g/L、KH2PO4 I~3 g/L、MgSO4 0.2~0.6 g/L、NaHCO3 0.5~2.0 g/L,、NH4Cl0.2~0.8 g/L、CaCl2 0.02~0.05 g/L、MnSO4 0.θ1-θ.03 g/L、FeCl3 0.Ο1-Ο.03 g/L 和微量元素10~20 mL/Lo
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于培养时间为1-3天。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于曝气量Qaik为80(Tl200L/h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于利用硫代硫酸盐(S2O32O为能源。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的营养液灭菌后使用，灭菌温度121。。~123°C、压力 0.12 MPa，灭菌时间 20~30 min。
【文档编号】C12R1/01GK103773706SQ201210402040
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月22日 优先权日:2012年10月22日
【发明者】郝爱香, 毛松柏, 孔京, 朱燕 申请人:中国石油化工股份有限公司, 南化集团研究院