用于鉴定分枝杆菌的寡核苷酸探针、生物芯片及鉴定方法
【专利摘要】本发明关于一种用于鉴定分枝杆菌的寡核苷酸探针、生物芯片及鉴定方法。所述的寡核苷酸探针包括片段长度为15至50个核苷酸的待与目标核酸序列杂交的专一性片段；以及片段长度为0至15个核苷酸的非专一性片段，其中所述专一性片段是位于所述寡核苷酸探针的3’端，且所述非专一性片段是用以连接一固相支持物。本发明还关于利用所述寡核苷酸探针的生物芯片及其用于鉴定分枝杆菌的方法。
【专利说明】用于鉴定分枝杆菌的寡核苷酸探针、生物芯片及鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明关于一种寡核苷酸探针,尤其是关于一种用于鉴定分枝杆菌的寡核苷酸探针、生物芯片及其鉴定方法。
【背景技术】
[0002]全球由结核杆菌群引起的结核病(tuberculosis)每年约有920万新案例，并造成170万人死亡。中国台湾每年亦有14，500至16，500个肺结核病例，故其被视为全世界公共卫生的大问题。
[0003]分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)包括绝对致病菌、兼性致病菌及腐生菌。目前已分离出将近100种分枝杆菌,其引起的疾病主要有结核病(tuberculosis)和麻风病(leprosy),除了结核分枝杆菌复合群(MTB complex)菌种外，尚有近三十种非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobateria, NTM)会引起肺部感染及各种何机全身性或局部感染；此菌为嗜氧性(aerobic)、革兰氏阳性(Gram-positive),因其细胞壁上含丰富腊质,抹片施以抗酸性染色(acid fast stain)后在显微镜下呈红色杆状的细胞型态；菌体抗酸性的特性为分枝杆菌的初步检测依据。分枝杆菌鉴定的传统方法包括染色特征、菌落型态、生理及生化特性等。分枝杆菌依生长速度区分为快速(七天以内可形成菌落)和慢速(七天以上形成菌落)生长菌，在此之后以传统方法鉴定还要花费2-4周不等，这也是造成分枝杆菌感染患者在诊疗上最大的困扰。
[0004]结核菌的临床诊断上，除了以抗酸性染色进行快速筛选外，分枝杆菌的培养与传统鉴定方法仍是临床鉴定的黄金标准，然而抗酸性染色结果虽然可以在24小时内得知，但染色的侦测极限与阳性预测率(positive predictive rate, PPV)均不到80%,而进行传统鉴定则需花费2-4周的时间，使得分子检测有了发展的空间。近年来，分子生物学发展快速，除了学术研究外，也开始应用在临床病原微生物检验上。因为分子生物技术拥有一些传统方法无法达到的特性，如，微量操作、快速、专一性与再现性高、可区分混合菌种等，让分子生物在各种鉴定方法中突显出优势的一面。随着分子技术的进步，核酸扩增反应(NAAT)与DNA杂交反应的技术可提升检测的侦测极限与准确性，然而目前进行分子检测的检体来源多来自做完抗酸性染色及接种培养后剩下的检体，其所含的菌数较低，当抗酸性染色的价数小于一价，或来自经过药物治疗的病患检体，甚至检体中含有的干扰物质，都会造成伪阴性的误判。另外，若直接以分子检测对消化去污染后的痰液或血液检体进行鉴定，将无法判断检体中的是为活菌或死菌，使得检验及医疗人员对其结果产生疑虑。
[0005]所有细菌的16S rRNA长度约为1.5Kb。在此长度中有高度保留区(highlyconserved region)以及因细菌种类的不同而发生变化的区域。相对于16S rRNA, 23S rRNA被定序的种类较少，其最主要原因是23S rRNA比较大，约为3Kb。而16S与23S核糖体核酸基因间间隔区(intergenic spacer region, ITS)的长度和序列在不同菌种间变化较大，其长度约在 60 至 1，529bp 之间，故 Giirtler 等人(Giirtler and Stanisich, 1996)认为此间隔区可用来作为鉴定菌株的工具。16S与23S核糖体核酸基因间间隔区序列除了少数几个菌种外，在种与种间(interspecies)的相似度不高,但同种内(intraspecies)的相似度却极高，而16S与23S核糖体核酸基因间间隔区序列很相似的菌种，通常可利用序列指纹(fingerprint sequence)加以辨识。相较于16S rRNA序列，16S与23S核糖体核酸基因间间隔区在长度上较短，仅需一次定序即可得到完整的序列(16S rRNA通常需要两次以上的定序)，且序列在种间的差异度(divergence)远大于16S rRNA(因为部份相近菌种相似度大于 99% ),因此 Kawamura 与 Patel 等人(Kawamuraet al., 1995 ；Patel et al., 1998)认为利用16S与23S核糖体核酸基因间间隔区序列有利于菌株的鉴定。
[0006]一般常用的分子检验技术为核酸扩增技术(nucleic acid amplificationtechniques ;NAAT),尤其以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction ;PCR)最为被广泛利用，而近年来生物芯片(biochip)的设计更是蓬勃发展，这类产品包括德国HainLifescience公司的Genotype CM/AS、中国台湾金车公司的人类乳突瘤病毒基因定型点墨EASYChip HPV Blot与中国台湾晶宇生物科技的结核分枝杆菌群检验试剂试剂盒DR.MTBCScreenTM IVD Kit。生物芯片又称为DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA microarray),乃衍生自北方墨点法(Northern blotting)或南方墨点法(Southern blotting)的一种应用技术，其原理是将与目标基因互补的单链DNA片段(又称为探针；pr0be)点制在载体，并以化学键结或紫外光方法固定于载体，载体材质可为玻璃片、陶瓷片、硝酸纤维膜(nitrocellulose membrane)或尼龙膜(nylon membrane);检测时通过PCR扩增目标基因片段，经过杂交反应(hybridization)与载体上的探针结合后，以酶呈色法显现讯号，再配合利用特殊的判读机器减少人为判读的误差。
[0007]目前，采用寡核苷酸芯片而成的生物芯片来鉴定分枝杆菌为主要发展趋势。所谓的寡核苷酸是采用合成的固定长度的具基因专一性序列的单链寡核苷酸代替PCR合成的DNA双链探针，并将之固定于固相支持物上。此一微小的变动却使寡核苷酸芯片比传统的cDNA芯片具有卓越的优点，例如，序列经过优化，减少非专一性杂交，能有效区分具有同源类似序列的基因；减少二级结构的发生；杂交温度均一，提高杂交效率；合成产物浓度均一，避免因待测样品浓度差异而造成点样量差异；无需扩增，防止因扩增失败影响鉴定结果。传统的cDNA芯片的固定方式可以通过简单且易于操作的紫外线交互链接反应(UVcross linkage)而固定于尼龙膜上。除前述专一'I"生序列之外，一般导入长度为15至20nt的聚合的胸腺嘧啶核苷酸尾端(poly T tail)作为用于将寡核苷酸探针固定于固相支持物的非专一性片段。又，于中国台湾专利申请1309262中提出，较短的寡核苷酸探针无法有效与固相支持物结合，因此其提出以长度为30至IOOnt的非专一性片段，可加强探针与固相支持物间的结合。然而，发明人经由密集的实验发现，过长的非专一性片段将造成探针无法牢固地固定于支持物上，进而使得鉴定结果不准确甚至无法呈现任合杂交反应。
[0008]鉴于传统技术中的寡核苷酸探针的缺点及用于鉴定分枝杆菌的方法操作复杂且耗时的缺点，且许多鉴定方法的准确度与灵敏度令人不甚满意，需发展一种有其临床的需要性及必要性的更快速且能准确鉴定分枝杆菌的鉴定探针及鉴定方法，让医师实时对患者进行适当医疗以遏止疾病传播。
【发明内容】
[0009]本发明的一个目的在于提供一种用于鉴定分枝杆菌的寡核苷酸探针。所述探针包括片段长度为15至50个核苷酸的待与目标核酸序列杂交的专一性片段及片段长度为O至30个核苷酸的非专一性片段。其中，所述专一性片段是位于所述寡核苷酸探针的3’端，且所述非专一性片段是连接至一固相支持物。如本【技术领域】一般技术人员所公知的，固相支持物可为玻璃片、陶瓷片、硝酸纤维膜或尼龙膜。
[0010]在上述寡核苷酸探针中，优选地，所述非专一性片段的长度为O至15个核苷酸。[0011 ] 在上述寡核苷酸探针中，优选地，所述目标核酸序列为分枝杆菌的16S与23S核糖体核酸基因间间隔区。
[0012]在上述寡核苷酸探针中，优选地，所述寡核苷酸探针更包含所述目标核酸序列的互补链。
[0013]在上述寡核苷酸探针中，优选地，所述分枝杆菌是选自由分枝杆菌群、结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌复合群、溃疡肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶然分枝杆菌组、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、土地分枝杆菌复合群及瘰疬分枝杆菌所组成的群组。
[0014]在上述寡核苷酸探针中，优选地，所述非专一性片段包含聚合的胸腺嘧啶核苷酸尾端。
[0015]本发明的另一目的在于提供一种用于鉴定分枝杆菌的生物芯片，其可鉴定包含鸟分支杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群、戈登分枝杆菌、土地分枝杆菌、偶然分枝杆菌、溃瘍肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌等9种分枝杆菌。
[0016]根据本发明的具体实施方案，于所述生物芯片上固定有多个本发明的寡核苷酸探针，其中，所述探针包 含:
[0017]至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针(SEQ IDN0.7)；
[0018]至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定结核分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针(SEQID N0.8)；
[0019]至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定鸟分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针(SEQ IDN0.1)；
[0020]至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定溃疡肿分枝杆菌的寡核苷酸探针(SEQ IDN0.13)；
[0021]至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定龟分枝杆菌的寡核苷酸探针(SEQ IDN0.14)；
[0022]至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定偶然分枝杆菌组的寡核苷酸探针(SEQ IDN0.12)；
[0023]至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定戈登分枝杆菌的寡核苷酸探针(SEQ IDN0.10)；
[0024]至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定堪萨斯分枝杆菌的寡核苷酸探针SEQ IDN0.4 ；
[0025]至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定土地分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针(SEQID N0.11);以及
[0026]至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定瘰疬分枝杆菌的寡核苷酸探针(SEQ IDN0.15)。[0027]所述探针具有以下表1所示的序列并包含其互补链。
[0028]由于结核分枝杆菌复合群在鉴定上需较严谨，因此设计了二种不同的探针加以辨识，判读时需二者皆呈现讯号才可判定为结核分枝杆菌复合群，此可减低伪阳性的误判。此外，由于鸟分枝杆菌复合群与堪萨斯分枝杆菌的基因多型性(polymorphism),因此针对这二种分枝杆菌，各制备三种不同的探针，以提高正确检出率。
[0029]根据本发明的【具体实施方式】，优选地，所述生物芯片包含二组呈镜像对称排列的用于鉴定结核分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针组。
[0030]在上述生物芯片中，优选地，所述二组呈镜像对称排列的用于鉴定结核分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针组的序列彼此不同(SEQ ID N0.8及SEQ ID N0.9)。
[0031]根据本发明的【具体实施方式】，优选地，所述生物芯片包含三组呈镜像对称排列的用于鉴定鸟分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针组。
[0032]在上述生物芯片中，优选地，所述三组呈镜像对称排列的用于鉴定鸟分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针组的序列彼此不同(SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2及SEQ ID N0.3)。
[0033]根据本发明的【具体实施方式】，优选地，所述生物芯片包含三组呈镜像对称排列的用于鉴定堪萨斯分枝杆菌的寡核苷酸探针组。
[0034]在上述生物芯片中，优选地，所述三组呈镜像对称排列的用于鉴定堪萨斯分枝杆菌的寡核苷酸探针组的序列彼此不同(SEQ ID N0.4及SEQ ID N0.5及SEQ ID N0.6)。
[0035]本发明的又一目 的在于提供一种用于鉴定分枝杆菌的方法，其包含以下步骤:自一待测菌株萃取其含16S-23S核糖体核酸基因间间隔区的DNA序列；利用一分枝杆菌通用引物扩增所述16S-23S核糖体核酸基因间间隔区的DNA序列；令所得的扩增的16S-23S核糖体核酸基因间间隔区的DNA序列与本发明的生物芯片进行杂合反应；以及通过观察所得的显示阳性杂合反应的图案来鉴定所述待测菌株。
[0036]在上述的方法中，优选地，所述分枝杆菌通用引物包含作为标帜的毛地黄素。
[0037]在上述的方法中，待测菌株是得自指定培养基上挑取的菌落，并从其中萃取DNA，可采用传统方法得到较纯的产物，或使用操作较为简单的商业化试剂盒(kit)。若为临床检体，则可采用更快的煮沸法。其后，在对应的分枝杆菌中以通用引物放大所欲的分枝杆菌的ITS区域。
[0038]通过本发明的鉴定分枝杆菌的探针及生物芯片，应用PCR和DNA杂交技术，以培养后所生长出的菌落进行9种临床细菌常见的分枝杆菌的菌种鉴定，具有快速分析、准确率闻及实时闻通量检测等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为快速生长分枝杆菌的系统化鉴定流程图。
[0040]图2为慢速生长分枝杆菌的系统化鉴定流程图。
[0041]图3A为本发明的生物芯片的各探针排列的示意图。
[0042]图3B为本发明的生物芯片的鉴定实施例的呈色反应图。
[0043]主要组件符号说明:
[0044]A1、G1:效能监视组
[0045]A2、G2:鸟分枝杆菌复合群3[0046]A3、G3:堪萨斯分枝杆菌3
[0047]A4、G4: 土地分枝杆菌
[0048]A5、G5:龟分枝杆菌
[0049]A6、B6、C6、D1、D2、D3、D4、G6:聚合的胸腺嘧啶核苷酸尾端
[0050]B1、C1、E1、F1:结核分枝杆菌复合群
[0051]B2、F2:鸟分枝杆菌复合群2
[0052]B3、F3:堪萨斯分枝杆菌2
[0053]B4、F4:瘰疬分枝杆菌
[0054]B5、F5:溃疡肿分枝杆菌
[0055]C2、E2:鸟分枝杆菌复合群I
[0056]C3、E3:堪萨斯分枝杆菌I
[0057]C4、E4:戈登分枝杆菌
[0058]C5、E5:偶然分 枝杆菌
[0059]D5:空白对照
[0060]D6:阴性控制组
[0061]E6、F6:分枝杆菌群探针
【具体实施方式】
[0062]以下配合附图而说明本发明的实施例以详细说明本发明，但其并不意味本发明仅局限于此类实施例所揭示的内容。
[0063]材料及方法
[0064]寡核苷酸探针的设计:本发明中所使用的寡核苷酸探针是全部位于细菌16S-23S核糖体核酸基因间间隔区(ITS)，经由与美国国家生物技术信息中心(NCBI)所公告的序列进行比对、经过菌种内(intraspecies)、菌属内(intragenus)、甚至菌属间(intergenus)序列比对后而设计了长度为15至40nt的具有菌种专一性鸟分支杆菌复合群(M.aviumcomplex) (3 种)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii) (3 种)、分枝杆菌(Mycobacterium spp.)、结核分枝杆菌复合群(MTB complex) (2种)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、土地分枝杆菌(M.terrae)、偶然分枝杆菌(M.fortuitum)、溃瘍肿分枝杆菌(M.abscessus) (2种)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)共9种细菌的15条寡核苷酸探针(包含寡核苷酸的互补链序列)(表1)。
[0065]表1、鉴定分枝杆菌的寡核苷酸探针
[0066]
【权利要求】
1.一种用于鉴定分枝杆菌的寡核苷酸探针，其包含: 片段长度为15至50个核苷酸的待与目标核酸序列杂交的专一性片段 '及 片段长度为O至30个核苷酸的非专一性片段； 其中所述专一性片段位于所述寡核苷酸探针的3’端，且所述非专一性片段连接至一固相支持物。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸探针，其中，所述非专一性片段的长度为O至15个核苷酸。
3.根据权利要求1所述的寡核苷酸探针，其中，所述目标核酸序列为分枝杆菌的16S与23S核糖体核酸基因间间隔区。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸探针，其中，所述寡核苷酸探针更包含所述目标核酸序列的互补链。
5.根据权利要求3所述的寡核苷酸探针，其中，所述分枝杆菌是选自由分枝杆菌群、结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌复合群、溃疡肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶然分枝杆菌组、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、土地分枝杆菌复合群及瘰疬分枝杆菌所组成的群组。
6.根据权利要求1所述的寡核苷酸探针，其中，所述非专一性片段包含聚合的胸腺嘧啶核苷酸尾端。
7.一种用于鉴定分枝杆菌的生物芯片，于所述芯片上固定有多个权利要求1-6任一项所述的寡核苷酸探针，其中，所述探针包含: 至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针(SEQ IDN0.7)； 至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定结核分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针(SEQ IDN0.8)； 至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定鸟分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针(SEQ IDN0.1)； 至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定溃疡肿分枝杆菌的寡核苷酸探针(SEQ IDN0.13)； 至少一组呈镜像对称配 置的用于鉴定龟分枝杆菌的寡核苷酸探针(SEQ ID N0.14)； 至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定偶然分枝杆菌组的寡核苷酸探针(SEQ IDN0.12)； 至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定戈登分枝杆菌的寡核苷酸探针(SEQ ID N0.10)； 至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定堪萨斯分枝杆菌的寡核苷酸探针(SEQ IDN0.4)； 至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定土地分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针(SEQ IDN0.11);以及 至少一组呈镜像对称配置的用于鉴定瘰疬分枝杆菌的寡核苷酸探针(SEQ ID N0.15)。
8.根据权利要求7所述的生物芯片，其中，所述生物芯片包含二组呈镜像对称排列的用于鉴定结核分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针组。
9.根据权利要求8所述的生物芯片，其中，所述二组呈镜像对称排列的用于鉴定结核分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针组的序列彼此不同(SEQ ID N0.8及SEQ ID N0.9)。
10.根据权利要求7所述的生物芯片，其中，所述生物芯片包含三组呈镜像对称排列的用于鉴定鸟分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针组。
11.根据权利要求10所述的生物芯片，其中，所述三组呈镜像对称排列的用于鉴定鸟分枝杆菌复合群的寡核苷酸探针组的序列彼此不同(SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2及SEQID N0.3)。
12.根据权利要求7所述的生物芯片，其中，所述生物芯片包含三组呈镜像对称排列的用于鉴定堪萨斯分枝杆菌的寡核苷酸探针组。
13.根据权利要求12所述的生物芯片，其中，所述三组呈镜像对称排列的用于鉴定堪萨斯分枝杆菌的寡核苷酸探针组的序列彼此不同(SEQ ID N0.4及SEQ ID N0.5及SEQ IDN0.6)。
14.一种用于鉴定分枝杆菌的方法，包含: 自一待测菌株萃取其含16S-23S核糖体核酸基因间间隔区的DNA序列； 利用一分枝杆菌通用引物扩增所述16S-23S核糖体核酸基因间间隔区的DNA序列； 所得的扩增的16S-23S核糖体核酸基因间间隔区的DNA序列与权利要求7_13任一项所述的生物芯片进行杂合反应；以及 通过观察所得的显示阳性杂合反应的图案来鉴定所述待测菌株。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述分枝杆菌通用引物包含作为标帜的毛地黄素。
【文档编号】C12N15/11GK103773835SQ201210407028
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月23日 优先权日:2012年10月23日
【发明者】蔡岳廷, 何耿德, 林函颐, 杨士杰, 谢贤修 申请人:启新生物科技有限公司