专利名称：一种成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法
技术领域：
本发明属于基因技术领域，尤其涉及一种成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法。
背景技术：
肺纤维化是一种危害人民健康的严重疾病，死亡率高，目前尚无有效的治疗方法。目前研究表明，肺纤维化发生中，上皮_间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是其重要的病理生理过程，而成纤维细胞生长因子II型受体(fibroblast growthfactor receptor 2,FGFR2) IIIb剪切体，即角质细胞生长因子受体(Keratinocyte GrowthFactor Receptor, KGFR)，其表型的丢失是EMT发生的关键。目前，还缺乏成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，为肺纤维化提供基因治疗的方法。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，旨在解决目前还缺乏成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，不能为肺纤维化提供基因治疗的方法的问题。本发明实施例是这样实现的，一种成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤FGFR2 IIIc表达载体的获得与测序鉴定；FGFR2 IIIb 3-11外显子片段的获得；FGFR2 IIIb腺病毒表达载体的构建；FGFR2 IIIb腺病毒的包装。进一步，所述FGFR2 IIIc 的插入位点为 5’XbaI/3’Hind III ;采用 Xba/Hind III从pRK5中切下FGFR2I He,同样酶切位点插入pBluescriptll-SK质粒；采用通用引物T3、T7对FGFR2 IIIc进行了测序分析，通过与Pubmed公布的基因序列进行比对，证明目的基因片段确为FGFR2 IIIc0进一步，所述FGFR2 IIIb 3_11外显子片段的获得方法依据Pubmed公布的基因序列,通过对FGFR2 IIIb及IIIc mRNA表达序列的分析，可以得知Pst I与Nhe I两个唯一的酶切位点分别位于FGFR2的外显子3与11上，SK载体上的Pst I已在FGFR2 IIIc片段插入时消失；取小鼠肺提取总RNA,采用引物 Pl (forward) 5’ -ttg tac tgc age tag gacgg-3’与引物 P2 (Reverse) 5，-aac tea tac tcg gag acc cc_3，进行 RT-PCR扩增出 FGFR2 exon3至exonll之间的片段。通过胶回收法，提取目的片段；采用TA-Clone法扩增目的片段，扩增结果通过酶切法鉴定；在TA-Clone的PUC19载体上有一个EcoR V酶切位点， 而在FGFR2外显子3到11片段上，仅在外显子9上有一个EcoRV酶切位点，因此，扩增产物如有2条带即为FGFR2IIIc部分，如只有一条带，即为FGFR2IIIb ；用Pst I与Nhe I从PUC19上切取FGFR2 IIIb外显子3到11片段，并取代SK载体上的FGFR2 IIIc上的外显子3到11片段，从而得到完整的FGFR2 IIIb表达载体；该FGFR2 IIIb表达载体同样采用通用引物T3、T7对外显子3_11部分进行了测序分析，并与前述FGFR2 IIIc测序结果进行了比对分析，证实了我们所得载体确为FGFR2IIIb表达载体。进一步，载体内FGFR外显子3至外显子11的序列测序结果如下
权利要求
1.一种成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤 FGFR2 IIIc表达载体的获得与测序鉴定； FGFR2 IIIb 3-11外显子片段的获得； FGFR2 IIIb腺病毒表达载体的构建； FGFR2 IIIb腺病毒的包装。
2.如权利要求1所述的成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，其特征在于，所述FGFR2 IIIc的插入位点为5’XbaI/3’Hind III ;采用Xba/Hind III从pRK5中切下FGFR2 IIIc，同样酶切位点插入pBluescriptll-SK质粒；采用通用引物T3、T7对FGFR2 IIIc进行了测序分析，通过与Pubmed公布的基因序列进行比对，证明目的基因片段确为 FGFR2 IIIc0
3.如权利要求1所述的成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，其特征在于，所述FGFR2 IIIb 3-11外显子片段的获得方法 依据Pubmed公布的基因序列，通过对FGFR2 IIIb及IIIc mRNA表达序列的分析，可以得知Pst I与Nhe I两个唯一的酶切位点分别位于FGFR2的外显子3与11上，SK载体上的Pst I已在FGFR2 IIIc片段插入时消失； 取小鼠肺提取总 RNA,采用引物 Pl (forward) 5’-ttg tac tgc age tag gacgg-3’与引物 P2 (Reverse) 5，-aac tea tac tcg gag acc cc_3，进行 RT-PCR 扩增出 FGFR2 exon3 至exonll之间的片段。通过胶回收法，提取目的片段； 采用TA-Clone法扩增目的片段，扩增结果通过酶切法鉴定；在TA-Clone的PUC19载体上有一个EcoR V酶切位点，而在FGFR2外显子3到11片段上，仅在外显子9上有一个EcoRV酶切位点，因此，扩增产物如有2条带即为FGFR2IIIC部分，如只有一条带，即为FGFR2IIIb ； 用Pst I与Nhe I从PUC19上切取FGFR2 IIIb外显子3到11片段，并取代SK载体上的FGFR2 IIIc上的外显子3到11片段，从而得到完整的FGFR2 IIIb表达载体； 该FGFR2 IIIb表达载体同样采用通用引物T3、T7对外显子3-11部分进行了测序分析，并与前述FGFR2 IIIc测序结果进行了比对分析，证实了我们所得载体确为FGFR2IIIb表达载体。
4.如权利要求3所述的成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，其特征在于，载体内FGFR外显子3至外显子11的序列测序结果如下
5.如权利要求1所述的成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，其特征在于，为使FGFR2 IIIb能成功进入生物体内进行表达，必须构建FGFR2 IIIb腺病毒表达载体；应用Xba/Hind III酶切位点从pSK-FGFR2 IIIb上切下FGFR2 IIIb片段，并转入AdTrack-CMV载体中，构建成含FGFR2_IIIb的腺病毒载体； pAdTrack-FGFR2_IIIb 载体构建完成后，米用引物 Pl (forward) 5’ -ttg tactgc agetag gac gg_3，与引物 P2 (Reverse) 5，-aac tea tac tcg gag acc cc_3，进行了 PCR 及酶切鉴定； pAdEasy-1被存储在BJ5183细菌中，参照分子克隆手册制备AdEasy感受态细胞；将AdTrack-FGFR2-1IIb质粒经Pme I酶切线形化后，转染AdEasy感受态细胞，线形化的AdTrack-FGFR2-1IIb 与 AdEasy-1 进行同源重组形成 AdEasy-FGFR2_IIIb ； 提取AdEasy-FGFR2-1IIb质粒进行直接电泳和PCR鉴定，PCR鉴定时的正向引物位于第8外显子上，结果表明pAdEasy-FGFR2-1IIb载体构建正确。
6.如权利要求1所述的成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，其特征在于，FGFR2 IIIb腺病毒的包装方法为将pAdEasy-FGFR2-1IIb感染293细胞，21天后收获了原代的FGFR2-1IIb腺病毒(KGFR/AAV)。
7.如权利要求1所述的成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，其特征在于，FGFR2 IIIb (KGFR)/AAV扩增后首先进行了滴度测定与A549细胞感染率的检测，并从mRNA水平、蛋白水平对KGFR/AAV病毒的KGFR表达进行鉴定，鉴定方法为 步骤1，FGFR2 IIIb/AAV的滴度测定，采用96孔板荧光计数法检测了 Ad-KGFR病毒原液的滴度为3 X 106PFU/mL ; 采用流式细胞仪阳性荧光细胞计数法检测了 Ad-KGFR病毒对A549细胞与小鼠胚胎成纤维细胞感染的阳性率；感染72小时后，Ad-KGFR病毒原液对A549细胞的感染的阳性率为.95. 5%，对小鼠胚胎成纤维细胞感染的阳性率为92. 8%。
步骤2，FGFR2 IIIb腺病毒在A549细胞中的表达，将收获的KGFR/AAV感染A549细胞，两天即可见阳性感染细胞；步骤3，KGFR-AAV病毒颗粒的电镜观察，透射电镜观察可见直径约90微米的病毒颗粒; 步骤4，KGFR腺病毒表达KGFR的双荧光鉴定，将KGFR腺病毒转染小鼠成纤维细胞，阳性感染细胞有绿色荧光表达，在此基础上，采用KGFR抗体作为一抗、罗丹明标记的IgG作为二抗，证明了小鼠成纤维细胞上KGFR的存在，未转染细胞为阴性； 步骤5，KGFR腺病毒表达KGFR的mRNA水平与蛋白水平鉴定，KGFR腺病毒转染A549细胞72小时后，提取细胞mRNA与蛋白质，采用RT-PCR与Western Blot的方法，对KGFR腺病毒表达载体转染A549细胞后的表达功能进行了鉴定；采用KGFR腺病毒转染小鼠成纤维细胞72小时后，提取细胞mRNA，进行了 RT-PCR鉴定。
全文摘要
本发明一种成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，包括以下步骤FGFR2 IIIc表达载体的获得与测序鉴定；FGFR2 IIIb 3-11外显子片段的获得；FGFR2 IIIb腺病毒表达载体的构建；FGFR2 IIIb腺病毒的包装。利用本发明构建的成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体，采用昆明白小鼠进行实验表明，博莱霉素60mg/kg体重气管内灌注在第3-4周能引起较明显的肺纤维化发生；采用前述构建的KGFR腺病毒表达载体，通过96孔板荧光计数法检测Ad-KGFR病毒原液的滴度为3 106PFU/mL。以该滴度的KGFR腺病毒300ml与博莱霉素(60mg/kg体重)共同气管内灌注，分别于1，2，3，4周后HE染色观察肺纤维化发生情况。结果表明，KGFR的表达增强后，博莱霉素作用后不同时间肺纤维化的发生有较明显的减轻。
文档编号C12N15/861GK103060375SQ20121042533
公开日2013年4月24日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者王建民, 陈菁, 刘斌剑, 陈魁君, 许川, 陈志强, 李冠桦, 苟元彬 申请人:王建民