专利名称：一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备固定化脂肪酶的方法，特别是涉及一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法。
背景技术：
脂肪酶(EC.3.1.1.3)是一类特殊的酰基水解酶，为应用最广泛的酶催化剂之一，除了能够催化甘油酯类化合物的水解之外，还可以用于在非水相中催化酯交换、高聚物合成、多肽合成、立体异构拆分和手性药物的合成等。南极假丝酵母脂肪酶(CandidaAntarctic lipase B，CALB)是一种重要的脂肪酶，在水解和有机合成反应中具有高度的立体选择性，对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性。近年的研究成果表明，CALB在多种类型的反应中都显示了较其它脂肪酶更为出色的催化性能。脂肪酶价格昂贵，虽然游离酶催化反应技术成熟，但酶不能重复使用，难以实现过程的连续化，工业化成本高而难以推广。固定化脂肪酶，是非水相催化中的常用形式，可以克服游离酶催化的缺点。应用于非水相中的固定化脂肪酶目前多采用吸附法制备，如诺维信公司生产的Novozyme 435 (吸附固定于大孔丙烯酸树脂的CALB),但即使在非水相中仍然存在酶从载体上脱落的问题。共价结合法具有酶与载体结合牢固，可长时间连续重复使用的优点，符合工业化应用的要求。构建性能优良的载体往往是酶固定化成功与否的关键。研究表明，载体表面接枝手臂分子有利于提高固定化酶活性[Barbara Krajewska.Application of chitin—and chitosan—based materials for enzyme immobilizations:a review.Enzyme and Microbial Technology，2004，25:126-139]，具适当疏水表面的载体比具亲水表面的载体更适于用作脂肪酶固定化载体[Petkar M, Lali A, Caimi P,Daminati M.1mmobilization of lipases for non—aqueous synthesis.J Mol CatalB Enzym, 2006，39:83-90]。但 Blanco 等[Blanco R M, Terreros P, Munoz N, et al.Ethanol improves lipase immobilization on a hydrophobic support.Journal ofMolecular Catalysis B: Enzymatic, 2007, 47: 13-20]指出疏水性太强的载体也并不一定是最好的，疏水性太强的表面在与水分子接触时，其接触角往往大于90°，导致水相不能进入到内部，因而载体只能在其外部吸附一些酶蛋白，减少了载体的载酶量。壳聚糖是一种性质优良的固定化载体，生物相容性好、无毒、具有许多可供改性且亲水的氨基和羟基。然而，目前采用壳聚糖特别是改性壳聚糖微球载体共价固定化脂肪酶的报道还很少，这些研究或未将壳聚糖制备成可大量生产的微米级微球，或是制备的壳聚糖微球未连接手臂分子，也没考虑到给微球表面提供适当的疏水区，这必然影响到制备高活力的固定化脂肪酶，所以开发性能优良的壳聚糖基脂肪酶固定化载体仍很有必要。基于此，我们以反相悬浮交联法制备微米级壳聚糖微球树脂作为固定化载体基体，将壳聚糖微球基质C2位苯甲醛化，引入疏水相互作用基团，再用环氧氯丙烷活化C6位羟基，偶联四乙烯五胺，制备兼具疏水作用苯基和亲水性多胺手臂分子的壳聚糖微球，经偶联戊二醛后作为酶的共价固定化载体。采用该载体对南极假丝酵母脂肪酶进行固定化，提高固定化酶活力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，以反相悬浮交联法制备微米级壳聚糖微球树脂作为固定化载体基体，疏水性基团和亲水性手臂分子的引入，极大提高了壳聚糖微球对脂肪酶的固定化效率。本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，所述方法包括:
a.制备两亲性壳聚糖微球载体:该载体基质为微米级壳聚糖微球，将壳聚糖微球基质C2位苯甲醛化，引入疏水相互作用基团，再用环氧氯丙烷活化C6位羟基，偶联四乙烯五胺，制备兼具疏水作用苯基和亲水性多胺手臂分子的壳聚糖微球，具体制备过程如下:
⑴壳聚糖微球基质的制备:将质量分数为5%的壳聚糖溶液与PEG2000充分混合，PEG2000在溶液中的质量百分含量分别为3%，再加入与壳聚糖溶液等体积的液体石蜡及乳化剂span-80，高速搅拌30min使体系成乳液状，然后加入0.12倍壳聚糖溶液体积的甲醛，搅拌Ih后将乳液倒入10 % Na OH/无水乙醇(V(NaOH): V (无水乙醇)=1:1)的混合液中静置lh，用二甲苯、乙醇、去离子水充分洗涤，得到粒径lOOlOOym的壳聚糖微球作为基质；⑵基质微球的基团修饰:称取壳聚糖微球于甲醇中，滴加苯甲醛，苯甲醛与微球质量比3飞，60°C恒温振荡反应l(Tl6h，再加入硼氰化钠室温反应12h，抽滤洗涤后将微球浸泡在氢氧化钠水溶液中、缓慢加入环氧氯丙烷，环氧氯丙烷与微球质量比6 12，50°C振荡反应5h，抽滤洗涤后将环氧化微球置于乙醇中，加入氢氧化钠水溶液和四乙烯五胺，四乙烯五胺与微球质量比1(T15，55°C反应6h，抽滤，用蒸馏水充分洗涤，干燥，得两亲性壳聚糖微球载体；
⑶戊二醛活化:取两亲性壳聚糖微球置于烧瓶中，按5倍氨基摩尔数的量加入戊二醛溶液，以乙醇作为反应介质60°C反应1.5h，抽滤，然后用蒸馏水、pH7.5的磷酸缓冲液洗涤，真空干燥，得戊二醛活化载体。b.制备固定化脂肪酶:将戊二醛活化载体分散于磷酸缓冲液中，室温下，力口入脂肪酶，脂肪酶与载体的质量比为0.02、.15:1，固定化温度为20 401:，固定化时间为2飞h，固定化pH7.5^8.0，在摇床中振荡2飞h，吸去酶液，用磷酸缓冲液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放于4°C冰箱中保存即可。所述的一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，所述的疏水作用基团为苯基，亲水性手臂分子为多胺。所述的一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，所述两亲性壳聚糖微球载体的粒径为IOOlOOiI m。所述的一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，所述苯基密度为1.5-2.2mmol / g载体，氨基密度为2.8_3.6mmol / g载体。本发明的优点与效果是:
本发明制备了一种改性壳聚糖微球作为脂肪酶的共价固定化载体。该载体兼具疏水性基团和亲水性手臂分子，即疏水性苯基和亲水性多胺手臂分子。利用该载体对脂肪酶固定化后大大提高了壳聚糖微球对脂肪酶的固定化效率，所得到的固定化酶活力回收率高达197%，活力为481.6U/g，是采用未改性聚糖微球的固定化水平的14.8倍。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下通过实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不限于此。实施例中所用脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶，采用PNPP法测定脂肪酶的活性，以37°C、pH7.5时，每分钟产生I U mo I的对硝基苯酚(pNP)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。实施例中所用南极假丝酵母脂肪酶活力600(T7000U/g。实施例1.两亲性壳聚糖微球载体的制备:
将120ml质量分数为5%的壳聚糖溶液与3.5gPEG2000充分混合，再加入120ml液体石腊，18滴span-80,高速搅拌30min使体系成乳液状,然后加入14ml甲醒,搅拌Ih后将乳液倒入10 % NaOH/无水乙醇(V(NaOH): V(无水乙醇)=1:1)的混合液中静置lh，用二甲苯、无水乙醇、去离子水充分洗涤，筛分得到粒径lOOlOOym的壳聚糖微球作为基质；
称取5gCS微球于IOOmL甲醇中，滴加苯甲醛30mL，60°C恒温振荡反应16h，再加入硼氰化钠室温反应12h，抽滤洗涤后将微球浸泡在适量氢氧化钠水溶液中、缓慢加入65mL环氧氯丙烷，50°C振荡反应5h，抽滤洗涤后将环氧化微球置于IOOmL乙醇中，加入IOOmL四乙烯五胺、适量氢氧化钠水溶液，55 °C反应6h，抽滤，用蒸馏水充分洗涤，干燥，得终产品多胺化苯甲基壳聚糖微球，即两亲性壳聚糖微球载体。以酸碱滴定法测定微球的氨基含量为3.3mmol/g0称取上述两亲性壳聚糖微球置于烧瓶中，加入50%戊二醛溶液20mL，以乙醇作为反应介质60V反应1.5h，抽滤，然后用蒸馏水、pH7.5的磷酸缓冲液洗涤，真空干燥。实施例2.固定化脂肪酶的制备:` 向装有0.15g戊二醛活化载体的50mL具塞三角瓶中加入10mLpH7.5的磷酸缓冲液，再加入6mg南极假丝酵母脂肪酶B，室温下，在摇床中反应3h，吸去酶液，用磷酸缓冲液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放于4°C冰箱中保存。该固定化脂肪酶活力481 U/g，活力回收率197%。实施例3.固定化脂肪酶的制备:
向装有0.15g戊二醛活化载体的50mL具塞三角瓶中加入10mLpH7.5的磷酸缓冲液，再加入12mg南极假丝酵母脂肪酶B，室温下，在摇床中反应3h，吸去酶液，用磷酸缓冲液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放于4°C冰箱中保存。该固定化脂肪酶活力509U/g,活力回收率130%。实施例4.固定化脂肪酶的制备:
向装有0.15g戊二醛活化载体的50mL具塞三角瓶中加入10mLpH7.5的磷酸缓冲液，再加入18mg南极假丝酵母脂肪酶B，室温下，在摇床中反应3h，吸去酶液，用磷酸缓冲液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放于4°C冰箱中保存。该固定化脂肪酶活力535U/g，活力回收率99.6%。实施例5.固定化脂肪酶的制备:
向装有0.15g戊二醛活化载体的50mL具塞三角瓶中加入10mLpH7.5的磷酸缓冲液，再加入22.5mg南极假丝酵母脂肪酶B，室温下，在摇床中反应3h，吸去酶液，用磷酸缓冲液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放于4°C冰箱中保存。该固定化脂肪酶活力433 U/g，活力回收率 71%。
权利要求
1.一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法包括: a.制备两亲性壳聚糖微球载体:该载体基质为微米级壳聚糖微球，将壳聚糖微球基质C2位苯甲醛化，引入疏水相互作用基团，再用环氧氯丙烷活化C6位羟基，偶联四乙烯五胺，制备兼具疏水作用苯基和亲水性多胺手臂分子的壳聚糖微球，具体制备过程如下: ⑴壳聚糖微球基质的制备:将质量分数为5%的壳聚糖溶液与PEG2000充分混合，PEG2000在溶液中的质量百分含量分别为3%，再加入与壳聚糖溶液等体积的液体石蜡及乳化剂span-80，高速搅拌30min使体系成乳液状，然后加入0.12倍壳聚糖溶液体积的甲醛，搅拌Ih后将乳液倒入10 % NaOH/无水乙醇(V(NaOH): V (无水乙醇)=1:1)的混合液中静置lh，用二甲苯、乙醇、去离子水充分洗涤，得到粒径lOOlOOym的壳聚糖微球作为基质； ⑵基质微球的基团修饰:称取壳聚糖微球于甲醇中，滴加苯甲醛，苯甲醛与微球质量比3飞，60°C恒温振荡反应10~l6h，再加入硼氰化钠室温反应12h，抽滤洗涤后将微球浸泡在氢氧化钠水溶液中、缓慢加入环氧氯丙烷，环氧氯丙烷与微球质量比6 12，50°C振荡反应5h，抽滤洗涤后将环 氧化微球置于乙醇中，加入氢氧化钠水溶液和四乙烯五胺，四乙烯五胺与微球质量比1(T15，55°C反应6h，抽滤，用蒸馏水充分洗涤，干燥，得两亲性壳聚糖微球载体； ⑶戊二醛活化:取两亲性壳聚糖微球置于烧瓶中，按5倍氨基摩尔数的量加入戊二醛溶液，以乙醇作为反应介质60°C反应1.5h，抽滤，然后用蒸馏水、pH7.5的磷酸缓冲液洗涤，真空干燥，得戊二醛活化载体； b.制备固定化脂肪酶:将戊二醛活化载体分散于磷酸缓冲液中，室温下，加入脂肪酶，脂肪酶与载体的质量比为0.02 0.15:1,固定化温度为2(T40°C，固定化时间为2飞h，固定化pH7.5~8.0，在摇床中振荡2飞h，吸去酶液，用磷酸缓冲液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放于4 °C冰箱中保存即可。
2.根据权利要求1所述的一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述的疏水作用基团为苯基，亲水性手臂分子为多胺。
3.根据权利要求1所述的一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述两亲性壳聚糖微球载体的粒径为10~300 u m。
4.根据权利要求1所述的一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述苯基密度为1.5-2.2mmol / g载体,氨基密度为2.8_3.6mmol / g载体。
全文摘要
一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，涉及一种制备固定化脂肪酶的方法，以反相悬浮交联法制备微米级壳聚糖微球树脂作为固定化载体基体，将壳聚糖微球基质C2位苯甲醛化，引入疏水相互作用基团，再用环氧氯丙烷活化C6位羟基，偶联四乙烯五胺，制备兼具疏水作用苯基和亲水性多胺分子的壳聚糖微球，经偶联戊二醛后作为脂肪酶的共价固定化载体。采用该载体对南极假丝酵母脂肪酶B进行固定化，疏水性基团和亲水性手臂分子的引入提高了壳聚糖微球对脂肪酶的固定化效率。当每克干载体投加的酶质量为40mg，室温，pH7.5的条件下固定南极假丝酵母脂肪酶3h，所得到的固定化酶活力回收率达197％，活力为481.6U/g。
文档编号C12N11/10GK103074322SQ20131000160
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月4日 优先权日2013年1月4日
发明者朱建星, 王红艳 申请人:沈阳化工大学