专利名称：用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法
技术领域：
本发明涉及ー种水产药物的筛选方法，具体涉及ー种用四氯化碳(CCl4)诱导鲤鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法。
背景技术：
以肝损伤为主要特征的鱼类肝胆综合症是目前水产养殖中日趋严重的病害，其发病范围广，死亡率高，给水产养殖业造成极大的经济损失。鱼类肝胆综合症属非传染性疾病，常用的抗生素和抗病毒等药物不能有效地控制鱼类肝胆综合症，该病目前还没有有效的治疗方法。中国专利201110260881.7公开了ー种用四氯化碳(CCl4)诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法。该方法将受试药物添加到饲料中对实验鱼进行1-2个月的喂养，然后用CCl4损伤肝脏造模，再将大量的实验鱼屠宰取样。该方法虽然直观地反映了受试药物的保肝效果，但是实验周期长，对实验动物和受试药物的需求量大，需要花费大量的人力、物カ和财力。因此不适用于保肝药物的初步筛选，尤其是早期的大規模筛选。基于细胞的体外药物筛选具有所需实验动物和受试药物用量少、药物作用机制明确，可实现大规模筛选等特点，已被广泛应用于人类药物的筛选。原代细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大，是检测药物很好的实验对象。中国专利201010169846.x公开了ー种用肝原代细胞作为载体的高通量药物筛选的方法。但基于原代肝细胞培养的体外药物筛选目前还没有应用到鱼类保肝药物的筛选中
发明内容
`本发明所要解决的技术问题是针对水产养殖中日趋严重的以肝损伤为主要特征的鱼类肝胆综合症，克服现有技术的不足，提供一种用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法。为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为:一种用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，具体包括以下步骤:(I)分离鲤鱼原代肝细胞，用L-15培养基将原代肝细胞的细胞浓度进行调整，将所述原代肝细胞种于细胞培养板上并进行培养，将所述原代肝细胞随机分为正常对照组、CCl4模型对照组、受试药物组；(2)所述原代肝细胞贴壁后，更换培养基，正常对照组和CCl4模型对照组继续用L-15培养基培养，受试药物组用含不同浓度受试药物的L-15培养基培养；2-6小时后，弃上清液，正常对照组加L-15培养基，其余各组加含4-16mMCCl4的L-15培养基；2_6小时后，收集上清液，检测该上清液中的GPT、GOT和LDH水平，根据GPT、GOT和LDH的变化评价受试药物保护肝细胞的药效。作为本发明所述用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法的一种优选方案，其中步骤(I)中用胰酶消化法分离鲤鱼原代肝细胞，所述L-15培养基中FBS的含量为10%，用含10%FBS的L-15培养基将原代肝细胞的细胞浓度调整为2*105/mL，按照600 y L/孔将所述原代肝细胞种于所述细胞培养板上，培养24小吋。作为本发明所述用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法的一种优选方案，其中步骤(2)中的造模浓度为8mM的CC14。因为CCl4的浓度如果太高，会对肝细胞造成严重的毒性，导致肝细胞的死亡，从而使造模失败；如果CCl4的浓度如果太低，不足以造成对肝细胞的损伤，也不能得到符合要求的肝细胞损伤模型，本发明通过对不同浓度的CCl4浓度进行筛选，以上清液中的GPT、GOT和LDH水平为指标，得出最佳造模所需的CCl4浓度为8mM。作为本发明所述用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法的一种优选方案，其中步骤(2)所述的造模时间为4小时，因为如果造模时间短，肝细胞培养上清液中的GPT、GOT和LDH没有发生显著变化，不符合造模要求，但是如果造模时间太长，肝细胞培养上清液中的GPT、G0T和LDH也没有显著差异，同样不符合造模要求，本发明通过对不同的造模时间进行筛选，确定CCl4造模的最佳时间为4小时。作为本发明所述用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法的一种优选方案，其中步骤(2)受试药物包括多种，每种受试药物设3-5个剂量梯度，每种受试药物的每个剂量对应ー个受试药物组，对每一个受试药物组用对应剂量的受试药物与肝细胞共培养。作为本发明所述用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法的一种优选方案，其中步骤(2)所述的受试药物中草药、其提取物或其提取物复方。作为本发明所述用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法的一种优选方案，其中所述受试药物包括黄芪多糖和甘草提取物。本发明提供的用鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法和现有技术相比具有以下优点:(I)细胞来源一致、培养环境可控，因此可重复性強。(2)细胞数量可根据需要进行分离，可满足多种药物的同批次筛选，可比性強。(3)所需屠宰的实验动物少，所需受试药物的量少。(4)周期短，可大大节约药物筛选所需时间和成本。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的物料配比、エ艺条件及其结果仅用于本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例一、急性鲤鱼原代肝细胞损伤造模筛选实验1、诱导鲤鱼急性原代肝细胞损伤模型所用CCl4浓度的选择用胰酶消化法分离鲤鱼原代肝细胞，用含10% (v/v)FBS (FetalBovineSerum，胎牛血清)的L-15培养基(或称培养 液)将细胞浓度调整为2*105个/mL，按照600 u L/孔将原代肝细胞种于24孔板(其为细胞培养板的ー种)上，随机分为对照组和不同浓度CCl4组。培养24小时后，此时所述原代肝细胞已经贴壁，更换培养基，对照组用L-15培养基继续培养，其他各组用含CCl4浓度分别为2、4、8、16、32mM(mM表示毫摩尔/升)的L-15培养基培养。4小时后，收集上清液(或简称为上清)。用南京建成生物技术有限公司生产的试剂盒检测上清液中的GPT (肝功能指数的ー种)、GOT (肝功能指数的ー种)和乳酸脱氢酶(LDH)水平。具体结果如表I所示。表I不同浓度CCl4对鲤鱼原代肝细胞培养上清液中GPT、GOT和LDH影响(平均值土 S.D.,样本数n=4)
权利要求
1.一种用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于，其包含: (1)分离鲤鱼原代肝细胞，用L-15培养基将原代肝细胞的细胞浓度进行调整，将调整浓度后的原代肝细胞种于细胞培养板上并进行培养，将所述原代肝细胞随机分为正常对照组、CCl4模型对照组、受试药物组； (2)所述原代肝细胞贴壁后，更换培养基，正常对照组和CCl4模型对照组继续用L-15培养基培养，受试药物组用含不同浓度受试药物的L-15培养基培养；2-6小时后，弃上清液，正常对照组加L-15培养基，其余各组加含4-16mMCCl4的L-15培养基；2_6小时后，收集上清液，检测该上清液中的GPT、GOT和LDH水平，根据GPT、GOT和LDH的变化评价受试药物保护肝细胞的药效。
2.根据权利要求1所 述的用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于:步骤(I)中用胰酶消化法分离鲤鱼原代肝细胞，所述L-15培养基中FBS的含量为10%，用含10%FBS的L-15培养基将原代肝细胞的细胞浓度调整为2*105/mL，按照600 y L/孔将所述原代肝细胞种于所述细胞培养板上，培养24小吋。
3.根据权利要求1或者2所述的用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于:步骤(2)中最佳造模浓度为8mM的CC14。
4.根据权利要求1或者2所述的用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于:步骤(2)中最佳造模时间为4小吋。
5.根据权利要求1或者2所述的用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在干:在步骤(2)中，受试药物包括多种，每种受试药物设3-5个剂量梯度，每种受试药物的姆个剂量对应ー个受试药物组，对姆一个受试药物组用对应剂量的受试药物与肝细胞共培养。
6.根据权利要求1或者2所述的用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于，步骤(2)所述的受试药物包括中草药、其提取物或其提取物复方。
7.根据权利要求6所述的ー种用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于:所述受试药物包括黄芪多糖和甘草提取物。
全文摘要
本发明公开了一种用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其包含(1)将所述原代肝细胞随机分为正常对照组、CCl4模型对照组、受试药物组；(2)所述原代肝细胞培养完成后，正常对照组和CCl4模型对照组继续用L-15培养基培养，受试药物组用含不同浓度受试药物的L-15培养基培养；2-6小时后，弃上清液，正常对照组加L-15培养基，其余各组加含4-16mMCCl4的L-15培养基；2-6小时后，收集上清液，检测该上清液中的GPT、GOT和LDH水平，根据GPT、GOT和LDH的变化评价受试药物保护肝细胞的药效。这样，可在短时间内对多种药物进行高通量快速筛选，大大缩短药物开发所需的时间，且可重复性强，成本低，应用范围广，效率高。
文档编号C12Q1/02GK103088106SQ20131002863
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者殷国俊, 曹丽萍, 杜金梁, 贾睿 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心