一个来源于苜蓿的蛋白质及其编码基因的新用途

一个来源于苜蓿的蛋白质及其编码基因的新用途
【专利摘要】本发明公开了一个来源于苜蓿的蛋白质及其编码基因的新用途。本发明所提供的一种新用途是利用MtWRKY76的编码核酸分子培育结瘤能力高和/或耐逆性高的转基因结瘤植物的方法。本发明所提供的培育结瘤能力高和/或耐逆性高的转基因结瘤植物的方法，包括向受体结瘤植物中导入MtWRKY76基因得到结瘤能力和/或耐逆性高于所述受体结瘤植物的转基因结瘤植物的步骤；所述MtWRKY76是如下a）或b）的蛋白质：a）氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示的蛋白质；b）将SEQ?ID?No.2中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与结瘤植物结瘤能力和/或耐逆性相关的由a）衍生的蛋白质。本发明对于培育耐盐耐旱及增强结瘤能力的转基因豆科作物具有重要价值。
【专利说明】一个来源于苜蓿的蛋白质及其编码基因的新用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一个来源于苜蓿的蛋白质及其编码基因的新用途。

【背景技术】
[0002] 豆科植物与根瘤菌共生互作的结果是产生了一个新的植物器官-根瘤。根瘤的形 成不仅涉及共生双方的分子对话与调控，同时也与环境因素有关，如水分、矿质营养元素、 温度、重金属、钠盐、C0 2、土壤类型以及pH等。但迄今为止，人们对豆科植物的结瘤固氮过 程的调控机制的分子机理的认识还知之甚少，因此发掘豆科植物结瘤固氮途径中的关键基 因并熟悉其功能，是解决豆科植物结瘤固氮能力的重要手段。
[0003] 截型苜蓿具有基因组小、染色体数为2X8(2n=16)、生长期短、自花授粉、根瘤固 氮、遗传转化效率高等特点，并且与豆科主要作物亲缘关系较近，所以被选作豆科模式植 物。研究表明，某些非生物胁迫，例如盐胁迫，会直接影响植物的结瘤固氮，因此截型苜蓿的 一些转录因子可能同时参与非生物胁迫和结瘤，这一点与拟南芥存在很大差异。基于以上 特点，截型苜蓿成为研究豆科植物的热点。苜蓿是很重要的优质牧草，因此研究苜蓿的抗逆 性及结瘤固氮提高苜蓿品质，挖掘出抗逆性及结瘤固氮相关的基因对于培育优质高产苜蓿 新品种，具有重要的生物学意义和经济价值。


【发明内容】

[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供来源于截型苜猜（Medicago truncatula)的一 个蛋白质MtWRKY76及编码核酸分子的新用途。
[0005] 其中，SEQ ID No. 2由285个氨基酸残基组成。
[0006] 本发明所提供的一种新用途是利用MtWRKY76的编码核酸分子培育结瘤能力高和 /或耐逆性高的转基因结瘤植物的方法。
[0007] 本发明所提供的培育结瘤能力高和/或耐逆性高的转基因结瘤植物的方法，包括 向受体结瘤植物中导入MtWRKY76基因得到结瘤能力和/或耐逆性高于所述受体结瘤植物 的转基因结瘤植物的步骤；
[0008] 所述MtWRKY76是如下a)或b)的蛋白质：
[0009] a)氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的蛋白质；
[0010] b)将SEQ ID No. 2中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与 结瘤植物结瘤能力和/或耐逆性相关的由a)衍生的蛋白质。
[0011] 所述结瘤植物是指根被固氮微生物(根瘤菌和/或弗兰克氏菌)感染后能形成根瘤 的植物，包括豆科植物和非豆科植物，其中非豆科植物指木本植物的棺木、木麻黄、杨梅、胡 颓子、沙棘等。
[0012] 所述豆科植物具体可为苜蓿，所述苜蓿可为截型苜蓿，如medicago truncatula A17，medicago truncatula R-108。在本发明的实施例中，所述苜猜为截型苜猜medicago truncatula R-108 或 medicago truncatula A17〇
[0013] 本发明所提供的另一种新用途是利用MtWRKY76的编码核酸分子培育培育耐逆性 高的转基因植物的方法。
[0014] 本发明所提供的培育耐逆性高的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入 MtWRKY76基因得到耐逆性高于所述受体植物的转基因植物的步骤；
[0015] 所述MtWRKY76是如下a)或b)的蛋白质：
[0016] a)氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的蛋白质；
[0017] b)将SEQ ID No. 2中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与 植物耐逆性相关的由a)衍生的蛋白质。
[0018] 其中，所述受体植物为可为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物可为拟南 芥或结瘤植物，所述结瘤植物可为豆科植物和非豆科植物，所述豆科植物可为苜蓿，所述苜 猜可为截型苜猜，如medicago truncatula A17，medicago truncatula R-108。在本发明的 实施方式中，所述苜猜为截型苜猜medicago truncatula R-108或medicago truncatula A17,所述拟南芥为Columbia生态型拟南芥。
[0019] 其中所述MtWRKY76基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表 达效果：
[0020] 1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所 偏爱的密码子，在保持本发明所述MtWRKY76基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符 合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地 实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35%、多于45%、多于50%或多于约 60% ；
[0021] 2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已 知的有效的序列进行修饰；
[0022] 3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括 组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的 选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性 表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多 启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于 双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
[0023] 4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于 CaMV的tml，来源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发 明基因进行连接；
[0024] 5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列 (例如来源于TMV, MCMV和AMV)。
[0025] 上文中，所述MtWRKY76基因的编码序列具体可为SEQ ID No. 1的第74-931位核 苷酸。
[0026] 所述MtWRKY76基因可通过MtWRKY76基因表达盒或含有所述MtWRKY76基因表达 盒的MtWRKY76基因表达载体导入目的植物。
[0027] 本发明中所述MtWRKY76基因表达盒均可含有所述MtWRKY76基因和启动所述 MtWRKY76基因转录的启动子。本发明中所述MtWRKY76基因表达盒均指能够在宿主细胞中 表达SEQ ID No. 2所示的MtWRKY76的DNA，该DNA不但可包括启动所述MtWRKY76基因转 录的启动子，还可包括终止所述MtWRKY76基因转录的终止子。进一步，所述MtWRKY76基 因表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组 织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶 病毒的组成型启动子35S;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶（"LAP"，Chao 等人（1999)Plant Physi〇1120:979-992);来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关 1 (PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯）诱导）；西红柿蛋白酶抑制 剂II启动子（PIN2)或LAP启动子（均可用茉莉酮酸曱酯诱导）；热休克启动子（美国专 利5,187, 267);四环素诱导型启动子（美国专利5,057, 422);种子特异性启动子，如谷子 种子特异性启动子pF128(CN101063139B (中国专利200710099169. 7))，种子贮存蛋白质特 异的启动子（例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和大豆beta conglycin的启动子（Beachy 等人（1985)EMB0 J. 4:3047-3053))。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录 终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（N0S终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S 终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例 如：0(1611等人（1985)似1：11代313:810;1?〇86油6找等人（1987)66116,56:125;61161'；[116311等 人（1991)Mol. Gen. Genet, 262:141;Proudfoot(1991)Cell，64:671;Sanfacon 等人 Genes 06￥.，5:141;1\108611等人（1990)?13111:0611，2:1261;]\111111'〇6等人（1990)66116,91:151; Ballad 等人（1989)Nucleic Acids Res. 17:7891 ;Joshi 等人（1987)Nucleic Acid Res.，15:9627)。在本发明的实施例中，所述MtWRKY76基因表达盒中启动所述MtWRKY76基 因转录的启动子为花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S，终止所述MtWRKY76基因转录的终 止子为N0S。
[0028] 可用现有的植物表达载体构建含有所述MtWRKY76基因表达盒的重组表达载体。 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如PR0KII、 pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa 或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻 译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚 腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导（Ti)质粒基 因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具 有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或 转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与 编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的 来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结 构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、 萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因， 赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对 methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基 因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
[0029] 在本发明的实施例中，所述选择标记基因为赋予对抗生素潮霉素抗性的潮霉素 B磷酸转移酶（hph)基因 hyg。在本发明的实施例中，所述MtWRKY76基因通过含有所述 MtWRKY76基因表达盒的MtWRKY76基因表达载体导入目的植物。所述MtWRKY76基因表达载 体是在PCAMBIA1302的多克隆位点插入SEQ ID No. 1的第74-931位核苷酸所示的MtWRKY76 编码序列得到的重组表达载体。
[0030] 所述MtWRKY76基因表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转 化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach, 1998, Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp. 411-463;Geiserson and Corey,1998, Plant Molecular Biology (2nd Edition)。
[0031] 当所述受体植物为结瘤植物时，所述转基因植物具有如下1) -3)中的特性：1)结 瘤能力和耐逆性均高于受体结瘤植物；2)结瘤能力高于受体结瘤植物；3)耐逆性高于受体 结瘤植物。
[0032] 当所述受体植物为非结瘤植物时，所述转基因植物的耐逆性高于受体植物。
[0033] 上文中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代 转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育 种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包 括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0034] 本发明所提供的另一种新用途是MtWRKY76或与其相关的生物材料在调控结瘤植 物的结瘤能力和/或调控植物的耐逆性中的应用。
[0035] 该新用途具体可为Bl) -B4):
[0036] Bl) MtWRKY76在调控结瘤植物的结瘤能力和/或调控植物的耐逆性中的应用；
[0037] 所述MtWRKY76是如下a)或b)的蛋白质：
[0038] a)氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的蛋白质；
[0039] b)将SEQ ID No. 2中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与 结瘤植物结瘤能力和/或植物耐逆性相关的由a)衍生的蛋白质；
[0040] B2)编码所述MtWRKY76的核酸分子在调控结瘤植物的结瘤能力和/或调控植物的 耐逆性中的应用；
[0041] B3)含有编码所述MtWRKY76的核酸分子的表达盒在调控结瘤植物的结瘤能力和/ 或调控植物的耐逆性中的应用；
[0042] B4)含有编码所述MtWRKY76的核酸分子的载体在调控结瘤植物的结瘤能力和/或 调控植物的耐逆性中的应用。
[0043] 该新用途中所有术语的定义同上文。
[0044] 上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子 也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。所述编码MtWRKY76的核酸分子具体可为编码MtWRKY76 的基因，所述编码MtWRKY76的基因的编码序列具体可为SEQ ID No. 1的第74-931位核苷 酸。
[0045] 其中，SEQ ID No. 1由938个核苷酸组成，编码区为序列1的自5'末端的第74-931 位核苷酸，自5'末端的第1-7位核苷酸是Bgl II酶切位点和保护碱基，第8-73位核苷酸是 3*f lag标签序列，第932-938位核苷酸是BstE II的酶切位点。
[0046] 上述应用中，B3)所述的表达盒具体可为上述MtWRKY76基因表达盒，B4)所述的载 体具体可为上述MtWRKY76基因表达载体。
[0047] 上述方法和上述应用中提到的所述MtWRKY76基因表达盒或所述MtWRKY76基因表 达载体也属于本发明的保护范围。
[0048] 导入上文所述MtWRKY76基因表达盒的重组微生物或导入上文所述MtWRKY76基因 表达载体的重组微生物也属于本发明的保护范围。
[0049] 其中，所述重组微生物具体可为细菌，酵母，藻和真菌。其中，细菌可来自埃希 氏菌属（Escherichia),欧文氏菌（Erwinia),根癌农杆菌属（Agrobacterium)、黄杆菌属 (Flavobacterium),产喊菌属（Alcaligenes),假单胞菌属（Pseudomonas),芽胞杆菌属 (Bacillus)等。
[0050] 上文中，所述根长可为主根长。
[0051] 所述生物量是指整个植株（由地上部分和地下部分组成）的生物量；所述生物量以 鲜重或干重表示。
[0052] 实验证明，导入本发明MtWRKY76基因的转基因苜蓿的结瘤能力高于受体苜蓿，转 基因苜蓿的根瘤数目是受体苜蓿的1.7-1. 9倍，转基因苜蓿的根瘤的重量是受体苜蓿的 1. 65-1. 82倍。而且导入本发明MtWRKY76基因的转基因苜蓿的耐盐性和耐旱性明显高于 受体苜蓿，在盐胁迫下，导入本发明MtWRKY76基因的转基因苜蓿的主根长度是受体苜蓿的 1. 7倍，植株干重是受体苜蓿的1. 3倍；在干旱胁迫下，导入本发明MtWRKY76基因的转基因 苜蓿的存活率是受体苜蓿的2. 7-3. 3倍。另外导入本发明MtWRKY76基因的转基因拟南芥 耐盐性高于受体拟南芥。本发明对于培育耐盐耐旱及增强结瘤能力的转基因豆科作物具有 重要价值。

【专利附图】

【附图说明】
[0053] 图1为载体pCAMBIA1302-MtWRKY76的结构示意图。
[0054] 图2为T2代转基因拟南芥的分子水平检测。
[0055] 1，17 :lkb DNA ladder，由下到上分别为 250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp， 2000bp ;2 :阴性对照，H20 ;3 :阳性对照；4 :阴性对照；5-9、11、12、14-16、18、19和21-28: PCR鉴定阳性植株；10、13和20 :PCR鉴定阴性植株。
[0056] 图3为了3代批1服￥3转基因拟南芥〇^2，1^5，1^8，1^10和1^13)与野生型拟南芥在 150mM，180mM，190mM，200mM，210mM，220mM NaCl 胁迫下的萌发率统计图。
[0057] 图4为农杆菌转化截型苜蓿R-108叶片再生植株的获得。
[0058] a :诱导的愈伤组织；b :抗性苗的形成；c :再生苗的形成；d :转基因苗种植在花 盆。
[0059] 图5为转基因截型苜蓿R-108的PCR鉴定。
[0060] 1，19 :lkb DNA ladder，由下到上分别为 250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp， 2000bp ;2 :阴性对照，H20 ;3 :阳性对照；4 :阴性对照；5、7、10-18、21、23-27、29-34、35、37 和39 :PCR鉴定阳性植株；6、8、9、20、22、28、36和38 :PCR鉴定阴性植株。
[0061] 图6为转基因截型苜蓿L2和L4与对照（WT，未转基因苜蓿)在不含有与含有100mM NaCl上根长差异的图片。
[0062] 左图为不含NaCl，右图为含有lOOmM。
[0063] 图7为转基因截型苜蓿L2和L4与对照（WT，未转基因苜蓿）在与含有lOOmMNaCl 上根长的差异。
[0064] 左图：转基因截型苜蓿L2和L4与对照（WT，未转基因苜蓿)在FN培养基上根长统 计图，右图：转基因截型苜蓿与对照（WT，未转基因苜蓿)在100mM NaCl的FN培养基上根长 统计图。
[0065] 图8为转基因截型苜蓿L2和L4与对照（WT，未转基因苜蓿）在lOOmM NaCl上单 株干重的差异。
[0066] 左图：转基因玉截型苜蓿育期L2和L4与对照（WT，未转基因苜蓿)在FN培养基上 单株干重统计图；右图：转基因截型苜蓿L2和L4与对照在含有lOOmM NaCl的FN培养基上 单株干重统计图。
[0067] 图9为转基因截型苜蓿L2和L4与对照（WT，未转基因苜蓿）干旱处理的图片。
[0068] 上图为正常浇水管理对照组；下图为干旱处理组。
[0069] 图10为转基因截型苜蓿L2和L4与对照（WT，未转基因苜蓿）干旱处理后存活率 的统计图。
[0070] 图11为转基因截型苜蓿株系L2和L4与对照（WT，未转基因苜蓿）在接种根瘤菌 培养30天后的图片。
[0071] 图12为转基因截型苜蓿株系L2和L4与对照（WT，未转基因苜蓿）在接种根瘤菌 30天后结瘤数目的差异。
[0072] 图13为转基因截型苜蓿株系L2和L4与对照（WT，未转基因苜蓿）在接种根瘤菌 30天后地下部分鲜重的差异。

【具体实施方式】
[0073] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的定量实验，均设置重复实验，结果取平 均值。
[0074] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0075] 下述实施例中的生物材料如下：
[0076] 截型苜猜 A17 (Medicago truncatula A17)和 R-108 (Medicago truncatula R-108):由自法国 INRA BRC-MTR (Biological Resource Centre for the model species Medicago truncatula L.)赠予。该生物材料记载在下述文献中：de Lorenzo L,Merchan F,Blanchet S.Differential expression of the TFIIIA regulatory pathway in response to salt stress between Medicago truncatula genotypes. Plant Physiol. 2007Dec; 145(4) : 1521-32。Columbia生态型拟南芥(哥伦比亚生态型拟南芥 (Columbia stain of Arabidopsis thaliana as genetic background):购自 salk 公司。
[0077] 根癌农杆菌EHA105记载在下述文献中：抗生素抑制农杆菌的效果及对条斑紫菜 生长发育的影响，王萍等，水产科学，2009, 28 (7)，公众可从中国农业大学获得，以重复本申 请实验。。
[0078] 根瘤菌 Sinorhizobium melilotil021 :由法国 CNRS-INRA_Universit6de Nice Sophia Antipolis赠予。该生物材料记载在下述文献中：Frendo P, Harrison J, Norman C.Glutathione and homoglutathione play a critical role in the nodulation process of Medicago truncatula. Mol Plant Microbe Interact. 2005Mar;18(3):254-9〇
[0079] 实施例1、MtWRKY76基因的克隆
[0080] 1、设计特异性引物对（MtWRKY76 _ 5' 和 MtWRKY76 _ 3'），由 Invitrogen 公司合 成。
[0081] P1F ：5,-
[0082] AGATCTAGATTACAAAGATCATGATGGTGACTATAAGGACCACGACATCGATTAC AAAGATGATGATG ATAAAATGGAATCAACATGCGTGGAT-3,；
[0083] P1R : 5，-GGTGACCTCACCATTTGTCCTTATTAG-3，。
[0084] 2、提取截型苜猜A17 (Medicago truncatula)整株植物的RNA，反转录为cDNA ;
[0085] 3、以步骤2的cDNA为模板，用步骤1的特异性引物对P1F和P1R进行PCR扩增， 回收PCR扩增产物。
[0086] 4、将步骤3的PCR扩增产物进行测序。
[0087] 测序结果为，该PCR产物的基因的序列为序列表中的序列1，序列1由938个核苷 酸组成，编码区为序列1的自5'末端的第74-931位核苷酸，自5'末端的第1-7位核苷酸 是Bgl II酶切位点和保护碱基，第8-73位核苷酸是3*f lag标签序列，第932-938位核苷酸 是BstE II的酶切位点。将该基因命名为MtWRKY76,该基因编码的蛋白命名为MtWRKY76,该 蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2所示，序列2由285个氨基酸残基组成。
[0088] 5、将上述PCR产物插入pMD18T-simple载体(购自TaKaRa生物工程公司），得到载 体 pMD18T-simple-MtWRKY76,测序结果表明 pMD18T-simple-MtWRKY76 含有 MtWRKY76 (序 列表中的序列1)。
[0089] 实施例2、转基因拟南芥的获得和功能研究
[0090] 一、转基因拟南芥的获得
[0091] 1、重组载体（pCAMBIA1302-MtWRKY76)的构建
[0092] (1)用限制性内切酶Bgl II和BstE II双酶切载体pMD18T-simple-MtWRKY76,回收 小片段。
[0093] (2)用限制性内切酶BglII和BstEII双酶切pCAMBIA1302(购自Centerforthe Application of Molecular Biology to International Agriclture, www. cambia. org), 回收载体骨架。
[0094] (3)将步骤（1)的小片段与步骤（2)的载体骨架连接，得到连接产物，将该连接 产物转化大肠杆菌DH5 α，得到转化子，提取该转化子的质粒，测序，将测序结果表明在 PCAMBIA1302的Bgl II和BstE II酶切位点之间插入序列表中的序列1得到的重组载体命名 为 pCAMBIA1302-MtWRKY76 (图 1)。
[0095] 2、转基因拟南芥的获得
[0096] ( 1)根癌农杆菌感受态细胞的制备
[0097] 挑取根癌农杆菌EHA105单菌落接种于lOOmlYEB液体培养基中，220rpm、28°C振荡 培养至〇D6(i(i=0. 5 ;转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清，加入10ml预冷的0. 15M的 CaCl2水溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min ;4°C、5000rpm离心5min，去上清，加入4ml预 冷的含10%甘油(体积百分含量)和0. 15M CaCl2的水溶液，轻轻悬浮；得到根癌农杆菌悬浮 液（EHA105感受态细胞)，分装于无菌eppendorf管中，每管200μ 1，于液氮中速冻lmin，冻 存于-70°C。
[0098] (2) pCAMBIA1302-MtWRKY76 转化根癌农杆菌 EHA105
[0099] 取1 μ g上述得到的pCAMBIA1302-MtWRKY76质粒加入200 μ 1根癌农杆菌EHA105 感受态细胞中，混匀，静止5min ;液氮中速冻lmin，37°C水浴5min，加入lml ΥΕΒ液体培养 基，28°C、150rpm振荡培养4h ;5000rpm离心3min，弃上清，加入0. lml YEB液体培养基，重 新悬浮细胞；涂布于含50 μ g/ml卡那霉素和50 μ g/ml利福平的YEB固体平板上，28°C培养 约48h，得到转化子。将该转化子进行菌液PCR鉴定，鉴定所用引物如下：
[0100] P2F :5, -ATGGAATCAACATGCGTGGAT-3,；
[0101] P1R :5' -GGTGACCTCACCATTTGTCCTTATTAG-3'。
[0102] 结果显示得到约860bp的片段，证明pCAMBIA1302-MtWRKY76已经成功转入根癌农 杆菌EHA105中。再将PCR鉴定阳性的转化子提取质粒，测序，结果表明
[0103] pCAMBIA1302-MtWRKY76 中含有 SEQ ID No. 1 的第 74-938 位核苷酸序 列。将含有pCAMBIA1302-MtWRKY76的农杆菌转化子命名为重组农杆菌EHA105/ pCAMBIA1302-MtWRKY76。
[0104] (3)转化拟南芥
[0105] ①将重组农杆菌 EHA105/pCAMBIA1302-MtWRKY76 接种于 10ml 含 50 μ g/ml 卡那霉 素和50 μ g/ml利福平的YEB液体培养基中，28°C、200rpm振荡培养过夜；
[0106] ②转化前一天以1:50比例(体积比)接种于200ml含相同抗生素的YEB培养基中， 扩大培养至0D600为1. 2-1. 6, 5, OOOrpm、15min离心集菌，重悬于渗入缓冲液（由蔗糖、表面 活性剂L-77和水组成；蔗糖的质量百分含量为5%，L-77的体积百分含量为0. 05%)，稀释至 0D600 约为 0. 8,即为重组农杆菌 EHA105/pCAMBIA1302-MtWRKY76 菌液；
[0107] ③采用Foral dip法将农杆菌转化花蕾期的拟南芥：在Columbia生态型拟南芥 (Columbia stain of Arabidopsis thaliana as genetic background)抽苔 4_5cm 时剪 去顶端花序，使腋生花序生长，剪时伤口应位于最高的茎生叶上方，约4-5天后进行转化， 转化前要使土壤充分湿透且将已开花的花蕾去掉，只保留未开放的小花蕾；转化时将拟南 芥整株与花盆一起倒扣在盛有200ml重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1302-MtWRKY76菌液的 容器中浸泡2-3min，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开 塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获?\代转MtWRKY76拟南芥种子（?\代转 pCAMBIA1302-MtWRKY76 拟南芥种子)。
[0108] (4)转基因拟南芥的筛选和分子鉴定
[0109] ①转基因拟南芥的筛选
[0110] ?\代转MtWRKY76拟南芥种子播种于含80mg/L潮霉素的MS固体平板上，4°C春化 3天，置22°C光照培养箱中培养7天，转化体表现为真叶呈深绿色，根深长至培养基中，将转 化体移至不含抗生素的MS培养基中，6天后将绿色的幼苗转到土壤中繁种，收获的种子即 为T 2代转MtWRKY76拟南芥种子。
[0111] ②DNA水平检测
[0112] 将T2代转MtWRKY76拟南芥种子培育成植株，提取的T2代转MtWRKY76拟南芥株系 的基因组DNA为模板，以质粒pCAMBIA1302-MtWRKY76为阳性对照，Columbia生态型拟南芥 (野生型）的基因组DNA为阴性对照，用如下引物进行PCR扩增：
[0113] P2F : 5，-ATGGAATCAACATGCGTGGAT-3，；
[0114] P1R : 5 ' -GGTGACCTCACCATTTGTCCTTATTAG-3 '。
[0115] PCR 体系（25. 0μ l):10XEx Taq PCR Buffer2. 5μ l，dNTP (25mM)2. 0μ 1，5,引物 (5pmol/ μ 1) 1·0μ 1，3，引物（5pmol/ μ 1) 1· 0 μ 1，ExTaq 酶（5U/ μ 1) 1· 0 μ 1，模板（1 μ g/ μ 1) 1· Ομ 1，ddH2016. 5μ 1。
[0116] PCR 程序为：第一轮：94°C变性 5min ;第二轮：94°C变性 30sec，50°C 复性 30sec， 72°C延伸lmin，30个循环；第三轮：72°C延伸lOmin。
[0117] 反应结束后，1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图2所示，图2为PCR 扩增产物电泳图，1，17为lkb DNA ladder，由下到上分别为250bp、500bp、750bp、1000bp、 1500bp、2000bp，3 为阳性对照，2,4 为阴性对照，5-9、11、12、14-1618、19 和 21-28 为 PCR 阳性植株，1〇、13和20为PCR阴性植株；可以看出，能扩增出MtWRKY76基因特异条带(约 860bp)的植株为PCR鉴定阳性T 2代转MtWRKY76拟南芥植株，得到20个PCR鉴定阳性T2代 转MtWRKY76拟南芥植株，其中五个株系命名为L2, L5, L8, L10和L13株系（Τ2代转MtWRKY76 拟南芥)。
[0118] 将L2, L5, L8, L10和L13株系进行自交，得到T3代种子，将其培育为T3代转 MtWRKY76 拟南芥植株 L2, L5, L8, L10 和 L13。
[0119] 二、转基因拟南芥的耐逆性鉴定
[0120] 分别将L2, L5, L8, L10和L13株系拟南芥（T3代转MtWRKY76拟南芥种子）和 Columbia生态型拟南芥(野生型）种子进行盐胁迫实验，实验设三次重复，每次重复每个株 系60粒种子。具体方法如下：
[0121] 将各个株系的拟南芥种子分别种于含有150mM, 180mM, 190mM，200mM，210mM，220mM NaCl的MS培养基上，4°C春化72hr，光照培养7天，每天光照时间为16小时，光照强度为 ΙΟΟμπιοΙ πΓΥ1，进行萌发率计算（以根长1mm为萌发标准)。统计结果表明随着盐浓度的增 力口，转MtWRKY76拟南芥和Columbia生态型拟南芥的萌发率都降低，但是在相同的盐浓度下 转MtWRKY76拟南芥比空载体对照和野生型的萌发率要高。例如在210mM NaCl的MS培养 基上，Columbia生态型拟南芥（wt)种子的萌发率是33. 3%，L2种子的萌发率为63. 3%，L5 种子的萌发率为61. 1%，L8种子的萌发率为71. 1%，L10种子的萌发率为75. 6%，L13种子的 萌发率为83. 4% (图3)。转MtWRKY76拟南芥各个株系的种子的萌发率显著高于Columbia 生态型拟南芥，表明过表达MtWRKY76增强了拟南芥的抗盐能力。
[0122] 实施例3、转基因截型苜蓿的获得和功能研究
[0123] 一、转基因截型苜蓿的获得
[0124] ( 1)真空叶盘转化法转化截型苜蓿
[0125] 采用实施例2的重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1302-MtWRKY76侵染截型苜蓿R-108 的叶片，通过体细胞胚胎再生的途径，采用抽真空叶盘转化法转化截型苜蓿R-108。
[0126] ①截型苜蓿材料的准备
[0127] 选取饱满种子的截型苜蓿R-108在浓硫酸中浸泡约25min(每隔5min，轻轻摇晃)， 至种子表面出现小斑点，用大量蒸馏水清洗7次，保证种子表面覆盖一层水膜，放至4°C春 化2d。在大培养皿中放上一层滤纸，用蒸馏水润湿，将春化后的种子转移到滤纸上，室温培 养l-2d，至根长2cm，转移至营养土 (营养土 ：蛭石=1 :3)培养。
[0128] 截型苜蓿R-108生长条件：每天16hr光照/8hr黑暗，60%相对湿度，22°C白天 /16°C夜间，200μΕ/πι2Λ，生长4-6w eeks，用消毒的剪刀剪下叶片，自来水清洗表面杂质， 5%NaC10表面消毒40min，用灭菌蒸馏水清洗2-3次，除去NaCIO,切掉叶柄，将叶片切成 5mm X 5mm小块，用于转化实验。
[0129] ②叶片的准备与侵染
[0130] 将切好的叶片进入侵染液中，充分混合，抽真空，-0. lpka (> 0. 09pka)，30min ; 28°C，50rpm，共培养 2h。
[0131] ③共培养
[0132] 将切片取出，在灭菌的滤纸上尽可能除去切片表面的农杆菌，然后转移到含 100 μ Μ 乙醜丁香酮的 SH3a 固体培养基（Medicago truncatula handbook, Transformation and regeneration of R108-1(c3)via somatic embryogenesis(Cosson et a 1. , 2007) 上，保证叶片正面朝上，暗培养3天。
[0133] ④愈伤组织的形成
[0134] 将共培养后的叶片转移到含有10mg/L潮霉素和400mg/L羧苄青霉素的SH3a固体 培养基(保证叶片正面朝上)，暗培养5-6周，每2周转接一次。转板时羧卞青霉素300mg/ L-200mg/L，逐渐降低。
[0135] ⑤胚的形成
[0136] 待愈伤组织成熟，转移到不含激素的SH9培养基（Medicago truncatula handbook, Transformation and regeneration of R108-1(c3)via somatic embryogenesis (Cosson et a 1.，2007)上，并转移到光照条件下，进行培养，每3周转一次 板，至形成前期胚胎；大约20-30天，前期胚胎发育成真正的胚胎。
[0137] ⑥植株的发育
[0138] 2-3周后，胚胎开始发育成小植株；将小植株转移到1/2MS培养基上，进行生根。
[0139] ⑦转移到温室中
[0140] 将植株转移到温室中，进行培养，收获?；代(转pCAMBIA1302-MtWRKY76当代，也即 转MtWRKY76当代）植株（图4)所结的种子（?\代种子)。
[0141] (2)转基因截型苜蓿的的分子鉴定
[0142] 将?\代转pCAMBIA1302-MtWRKY76截型苜蓿种子培育成植株，提取?\代转 pCAMBIA1302-MtWRKY76截型苜蓿株系的基因组DNA为模板，以质粒pCAMBIA1302-MtWRKY76 为阳性对照，截型苜蓿R-108 (野生型）的基因组DNA为阴性对照，利用上游引物(在35S启 动子ATG上游150bp位置处)和下游引物(在WRKY76的3-末端)，PCR扩增特异的一段约为 1000bp的目的基因片段。用如下引物进行PCR扩增：
[0143] 5,引物：5, -GACGCACAATCCCACTATCC-3,；
[0144] 3 ' 弓丨物：5 ' -GGTGACCTCACCATTTGTCCTTATTAG-3 '。
[0145] PCR 体系（25. 0μ l):10XEx Taq PCR Buffer2. 5μ l，dNTP (25mM)2. 0μ 1，5,引物 (5pmol/ μ 1) 1·0μ 1，3，引物（5pmol/ μ 1) 1· 0 μ 1，ExTaq 酶（5U/ μ 1) 1· 0 μ 1，模板（1 μ g/ μ 1) 1· 0μ 1，ddH2016. 5μ 1。
[0146] PCR 程序为：第一轮：94°C变性 5min ;第二轮：94°C变性 30sec，50°C 复性 30sec， 72°C延伸lmin，30个循环；第三轮：72°C延伸lOmin。
[0147] 反应结束后，1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图5所示，1，19为 lkb DNA ladder，由下到上分别为 250bp、500bp、750bp、lOOObp、1500bp、2000bp，3 为阳性对 照，2,4 为阴性对照，5、7、10-13、14-18、21、23-27、29-34、35、37 和 39 为 PCR 阳性植株，6、 8、9、20、22、28、36和38为PCR阴性植株；可以看出，能扩增出MtWRKY76基因特异条带(约 lOOObp)的植株为PCR鉴定阳性?\代转MtWRKY76截型苜蓿植株，得到25个PCR鉴定阳性 ?\代转MtWRKY76即截型苜蓿植株，随机挑选2个PCR鉴定阳性株系命名为L2和L4株系（T2 代转MtWRKY76截型苜蓿）进行下述步骤二和步骤三的实验。
[0148] 二、转基因截型苜蓿的耐逆性鉴定
[0149] 1、分别将截型苜蓿R-108 (即野生型截型苜蓿代转MtWRKY76截型苜 蓿（L2和L4)进行盐胁迫实验：
[0150] ①根长实验：
[0151] 将野生型截型苜蓿的种子与?\代转MtWRKY76截型苜蓿的L2和L4株系?\代种子 先0. 1%的水琼脂（10mg/L潮霉素）上萌发，4°C春化2天转到25°C黑暗培养20h，之后转到 不含与含有 lOOmMNaCl FN 培养基(溶质及浓度为 MgS04. 7H200. 5mM, KH2P040. 7mM, Na2HP04. 2 H200. 8mM, FeEDTAO. 5 μ M, NH4N030. 5mM, CaCl2lmM, MnS040. lmg/L, CuS040. lmg/L, ZnS040. lmg/ L，H3B030. lmg/L，Na2M〇040. lmg/L，溶剂为水）上培养7天，记录下初始主根长及培养7天后 主根长，计算其在不含与含有lOOmMNaCl筛选压下主根的生长长度（图6)。经过4次重复实 验，每次实验每个株系20粒种子，初步统计出其数据如图7所示，结果表明在正常生长条件 下，野生型截型苜蓿与转基因截型没有差别，但是在l〇〇mM NaCl条件下，?\代转MtWRKY76 截型苜蓿的L2和L4株系明显比野生型根的生长量要长，主根长度是野生型截型苜蓿的1.7 倍，其数据如下：野生型截型苜蓿的主根长为1. 365cm，L2的主根长为2. 365cm，L4的主根 长为2. 275cm。此结果表明过表达MtWRKY76基因增加了截型苜蓿R-108的抗盐能力。
[0152] ②干重实验：
[0153] 将野生型截型苜蓿的种子与?\代转MtWRKY76截型苜蓿的L2和L4株系?\代种子 先在0. 1%的水琼脂（10mg/L潮霉素）上萌发，4°C春化2天后转到25°C黑暗培养20h，这时 萌发的种子会长出约1厘米的根，转到不含与含有l〇〇mM NaCl FN培养基上培养15天后， 单株采样60°C烘干48h称取干重。经过3次重复实验，每次实验每个株系20粒种子，统计 出其数据如图8。结果表明在正常生长条件下，野生型与转基因截型苜蓿的干重没有差别； 但在lOOmM NaCl条件下，?\代转MtWRKY76截型苜蓿的L2和L4株系明显比野生型的生物 量要多，植株干重是野生型截型苜蓿的1. 3倍，数据如下：野生型为4. 15mg，L2为5. 52mg， L4为5. 30mg。此结果表明MtWRKY76基因增强了截型苜蓿R-108的抗盐能力。
[0154] 2、分别对截型苜蓿R-108 (即野生型截型苜蓿代转MtWRKY76截型苜 蓿（L2和L4)进行干旱胁迫实验：
[0155] 将野生型截型苜蓿的种子与?\代转MtWRKY76截型苜蓿的L2和L4株系?\代种子 先0. 1%的水琼脂（10mg/L潮霉素）上萌发，4°C春化2天转到25°C黑暗培养20h，转移到培 养土中（营养土 ：蛭石（v/v)=l :3)，正常生长两周后，干旱处理14天后，定量浇水300mL，再 干旱14天，反复三次，最后一次复水3天后拍照（图9)。同时设置正常浇水管理的对照组。 并计算存活率(干旱处理组的存活株数/对照组的存活株数)。同时设置正常浇水管理的对 照组。实验设三次重复，每次重复每个株系24粒种子。统计出其数据如图10所示，野生 型截型苜蓿的存活率为26. 7% ;而转MtWRKY76截型苜蓿L2为88. 9%，L4为73. 3%。导入本 发明MtWRKY76基因的转基因苜蓿的存活率是野生型截型苜蓿的2. 7-3. 3倍。说明过表达 MtWRKY76提高了截型苜蓿抗旱的能力。
[0156] 三、转基因截型苜蓿的结瘤实验鉴定
[0157] 1、根瘤菌 Sinorhizobium melilotil021 的活化及准备
[0158] 将在-80°C保存的根瘤菌 Sinorhizobium melilotil021 菌种在含 100 μ g/ml 硫 酸链霉素 TY固体培养基（胰蛋白胨5g，酵母粉3g，CaCl20. 6g，，琼脂粉15g，用水定容至 1000ml，调pH至7. 0)上划线，在28°C培养箱里生长两天后，挑取单菌落到含100 μ g/ml硫 酸链霉素 TY液体培养基，28°C，240rpm震荡培养三天，按照1 :100转接到新的含100 μ g/ml 硫酸链霉素 TY培养基（50mL)直至菌液的0D_为0. 8,用生理盐水稀释至0D_为0. 5,备 用。
[0159] 2、蛭石管的准备
[0160] 将蛭石用低氮培养基搅拌直均匀，装入大试管，约为管长的2/3,封口膜包好， 121°C高压灭菌2小时，降至室温后每个蛭石管加入灭菌的蒸馏水30mL。
[0161] 3、截型苜蓿的结瘤实验
[0162] 将截型苜蓿R-108 (即野生型截型苜蓿（WT))的种子与?\代转MtWRKY76截型苜蓿 的L2和L4株系?\代种子在0. 1%的水琼脂（10mg/L潮霉素）上萌发，4°C春化2天后转到 25°C黑暗培养20h，萌发的种子长出约1厘米的根时种到准备好的蛭石管里，每个蛭石管里 接种步骤1稀释好的根瘤菌Sinorhizobium melilotil021 (0D6Q(i为0. 5)500 μ L，光照培养 30天，每天光照时间为16小时，光照强度为200 μ mol πΓΥ1，进行结瘤数目计算（图11)。实 验设三次重复，每次重复每个株系15粒种子。统计结果如图12所示，可以看出，接种根瘤 菌Sinorhizobium melilotil021的转MtWRKY76截型苜猜比野生型的结瘤数目增多。统计 出其数据是野生型截型苜蓿为7. 5个；而转MtWRKY76的两个株系L2和L4分别为13. 9个， 12. 4个，转基因苜蓿的根瘤数目是受体苜蓿的1. 7-1. 9倍。地下部分鲜重为野生型51. 8mg， 而转MtWRKY76的两个株系L2和L4分别为85. 7mg，94. 5mg (图13)，转基因苜蓿的根瘤的 重量是受体苜蓿的1. 65-1. 82倍。表明MtWRKY76参与了截型苜蓿结瘤过程，并且增强结瘤 固氮能力。
[0001] I'"!"*- T~| 1 1 序列我 <110>中国农业大学 <120〉 -个来源于苜蓿的蛋白质及其编码基因的新用途 <130> CGGNAR132242 <160> 2 <170> PaLentln version 3. 5 <210> 1 <211> 938 <212〉 DNA <213〉截型苜猜（/IfeoVcago irw?caiy/a ) <220> <221〉 CDS <222〉 (74).. (931) <?00> 1 agatetagat tacaaagatc atgatggtga ctataaggac cacgacatcg attacaaaga 60 tgatgatgat aaaatggaat caacatgcgt ggataettea ctcaatctta acgttaatgc 120 ttettetata ctcaaggacg aagttttggt tgaagagtta catcgtctta gttctgaaaa 180
[0002] 序列表 caagaggcta aatgaaacat tgaccaacat gtgtgagaac tatgacacta tgcaaaagca 240 attgaatcaa ttgatgaatc aaaattttga aaaccaaaca caacaatcaa ggaaaagaaa 300 agctgagagt gagagttgca tcaatatgtt tggtactgtt agaggcatta atattattaa 360 taataataat gagtgcagca ctgttactga tgaagaalca ttaatcaaaa ggccatgtag 420 ggatatttca tcacctaagg cttataaggt tcttgtgaag acagaagcat ctagtaatag 480 cttatatgtg atggatggat atcaatggag gaaatatggt cagaaggtta ctagagataa 540 cccctctcct agagcttatt ttaggtgctc atatgctcca agctgcccag ttaaaaagaa 600 ggtgcaaaaa agtglagaag accctactat actagttgca acatatgaag gagagcacaa 660 ccatggtcat gagaaagctg aaatatcaat gatatcaagc caaagtgaag aagctccttt 720 aggttcagtt catgttactt cacctcaaca aattattcaa agaacatgtt caaccatgaa 780 gcttgataat gttccaaaat catctatcca gcaatttttg gttcaacaaa tggctacttc 840 tttgacaaat gatcctaatt tcactgcagc acttgccact gctatttctg gaagaatttt 900 ggaccatact tctaataagg acaaatggtg aggtcacc 938 <210> 2 <211> 285 <212> PRT <2Yi> 藏辕 iMedicago truncatula } <400〉 2 Met Glu Ser Thr Cys Val Asp Thr Ser Leu Asn Leu Asn Val Asn Ala 15 10 15
[0003] 序列表 Ser Ser lie Leu Lys Asp Glu Val Leu Val Glu Glu Leu His Arg Leu 20 25 30 Ser Ser Glu Asn Lys Arg Leu Asn Glu Thr Leu Thr Asn Mel Cys Glu 35 40 45 Asn Tyr Asp 丁hr Met Gin Lys Gin Leu Asn Gin Leu Met Asn Gin Asrt 50 55 60 Phe Glu Asn Gin Thr Gin Gin Ser Arg \,ys Arg Lys A1a Glu Ser Glu 65 70 75 80 Ser Cys He Asn Met Phe Gly Thr ￥al Arg Gly lie Asn lie lie Asn 85 90 95 Asn Asn Asn Glu Cys Ser Thr Val Thr Asp Glu Glu Ser Leu lie Lys 1UU 105 110
[0004] 序列表 Arg Pro Cys Arg Asp lie Ser Ser Pro Lys Ala Tyr Lys Val Leu ￥al 115 120 125 Lys Thr Glu Ala Ser Ser Asn Ser Leu Tyr Val Met Asp Gly Tyr Gin 130 185 140 Trp Arg Lys Tyr Gly Gin Lys Val Thr Arg Asp Asn Pro Ser Pro Arg 145 150 155 160 Ala Tyr Phe Arg Cys Ser Tyr Ala Pro Ser Cys Pro Val Lys Lys Lys 165 170 175 Val Gin Lys Ser Val Glu Asp Pro Thr lie Leu Val Ala Thr Tyr Glu 180 185 190 Gly Glu His Asn His Gly His Glu Lys Ala Glu lie Ser Met lie Ser
[0005] Ι"-- "K|i -4- Ιψ f1}衣 195 200 205 Ser Gin Ser Glu Glu Ala Pro Leu Gly Ser Val His Val Thr Ser Pro 210 215 220 Gin Gin lie lie Gin Arg Thr Cys Ser Thr Met Lys Leu Asp Asn Val 225 230 235 240 Pro Lys Scr Scr lie Gin Gin Phc Leu Val Gin Gin Met Ala Thr Ser 245 250 255 Leu Thr Asn Asp Pro Asn Phe Thr Ala Ala Leu Ala Thr Ala lie Ser 260 265 270 Gly Arg lie Leu Asp His Thr Ser Asn Lys Asp Lys Trp 275 280 285
【权利要求】
1. 培育结瘤能力高和/或耐逆性高的转基因结瘤植物的方法，包括向受体结瘤植物中 导入MtWRKY76基因得到结瘤能力和/或耐逆性高于所述受体结瘤植物的转基因结瘤植物 的步骤； 所述MtWRKY76是如下a)或b)的蛋白质： a) 氣基酸序列如SEQ ID No. 2所不的蛋白质； b) 将SEQ ID No. 2中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与结瘤 植物结瘤能力和/或耐逆性相关的由a)衍生的蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述转基因结瘤植物为转基因豆科植物， 所述受体结瘤植物为豆科植物。
3. 培育耐逆性高的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入MtWRKY76基因得到耐 逆性高于所述受体植物的转基因植物的步骤； 所述MtWRKY76是如下a)或b)的蛋白质： a) 氣基酸序列如SEQ ID No. 2所不的蛋白质； b) 将SEQ ID No. 2中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物 耐逆性相关的由a)衍生的蛋白质。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述受体植物为双子叶植物或单子叶植 物。
5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐 旱性。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述耐盐性体现为下述Al)、A2)和A3) 中的全部或部分： A1)盐胁迫下，植物种子的萌发率高于所述受体结瘤植物或所述受体植物； A2)所述耐逆性体现为盐胁迫下，根的长度高于所述受体结瘤植物或所述受体植物； A3)所述耐逆性体现为盐胁迫下；生物量高于所述受体结瘤植物或所述受体植物。
7. 根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述MtWRKY76基因的编码序列 是SEQ ID No. 1的第74-931位核苷酸。
8. 下述Bl)-B4)中的应用； Bl) MtWRKY76在调控结瘤植物的结瘤能力和/或调控植物的耐逆性中的应用； 所述MtWRKY76是如下a)或b)的蛋白质： a) 氣基酸序列如SEQ ID No. 2所不的蛋白质； b) 将SEQ ID No. 2中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与结瘤 植物结瘤能力和/或植物耐逆性相关的由a)衍生的蛋白质； B2)编码所述MtWRKY76的核酸分子在调控结瘤植物的结瘤能力和/或调控植物的耐逆 性中的应用； B3)含有编码所述MtWRKY76的核酸分子的表达盒在调控结瘤植物的结瘤能力和/或调 控植物的耐逆性中的应用； B4)含有编码所述MtWRKY76的核酸分子的载体在调控结瘤植物的结瘤能力和/或调控 植物的耐逆性中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。 10. C1-C4中的至少一种生物材料： C1、含有编码MtWRKY76的核酸分子的表达盒，所述MtWRKY76是如下a)或b)的蛋白 质： a) 氣基酸序列如SEQ ID No. 2所不的蛋白质； b) 将SEQ ID No. 2中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与结瘤 植物结瘤能力和/或植物耐逆性的由a)衍生的蛋白质； C2含有编码所述MtWRKY76的核酸分子的载体； C3、含有C1所述表达盒的MtWRKY76基因表达载体或导入所述MtWRKY76基因表达载体 的重组微生物。
【文档编号】C12N1/15GK104059937SQ201310085151
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月18日 优先权日:2013年3月18日
【发明者】王涛, 刘丽平, 董江丽 申请人:中国农业大学