专利名称：制备二肽基肽酶iv抑制剂的方法及用于该制备方法的中间体的制作方法
技术领域：
本申请要求2004年4月14日提交的美国临时申请N0.60/561，986的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。本发明涉及一种制备(CiS)-C1-〔〔1，1-二甲基乙氧基)羰基〕-氨基〕-3-羟基三环〔3.3.1.13’7〕癸烷-1-乙酸的方法，该酸可用作中间体以制备二肽基肽酶(dip印tidylpeptidase) IV的基于环丙基稠合的吡咯烷的抑制剂，该抑制剂可用来治疗糖尿病和其并发症、高糖血症、症候群X、高胰岛素血症、肥胖症及动脉粥样硬化和相关疾病，以及免疫调制性疾病与慢性炎性肠病。
背景技术：
二肽基肽酶IV为经膜结合的非经典丝氨酸氨基肽酶，其存在于多种组织之中，包括，但不限于，肠、肝、肺和肾之中。此酶也位于循环T-淋巴细胞之上，在其中称为CD-26。二肽基肽酶IV负责内源性肽酶GLP-1 (7-36)和胰高血糖激素的活体内(in vivo)代谢性切断且对其它肽类例如GHRH、NPY、GLP-2和VIP展现出体外蛋白水解活性。GLP-1 (7-36)为一种衍生自胰高血糖激素在小肠内的后转译处理的29个氨基酸肽酶。此肽酶在活体内具有多种作用。例如，GLP-1 (7-36)可刺激胰岛素分泌及抑制胰高血糖激素分泌。此肽酶可促进饱食及减缓胃排空。通过连续注输从外面投予GLP-1 (7-36)业经证明对糖尿病患者有 效用。不过，外源肽对于连续治疗用途而言降解太快速。二肽基肽酶IV抑制剂业经开发出以加强GLP-1 (7，36)的内源含量。给Hamann etal.的美国专利第6，395，767号公开了二肽基肽酶IV的基于环丙基稠合的吡咯烷的抑制齐U。化学合成这些抑制剂所用方法公开于美国专利第6，395，767号及文献中。例如，可参阅Sagnard et al.Tet-Lett.1995 36:3148-3152 ；Tverezovsky et al.Tetrahedron 199753:14773-14792 ;及 Hanessian et al.Bioorg.Med.Chem.Lett.1998 8:2123-2128。在美国专利第6，395，767号中公开的一优选抑制剂为(1S，3S, 5S)_2_〔(2S)_2_氨基-2-(3-羟基三环〔3.3.1.13’7〕癸-1-基)-1_酮基乙基〕-2-氮杂双环〔3.1.0〕己烷-3-甲腈((IS,3S, 5S) -2- [ (2S) -2-amino-2- (3-hydroxytricyclo [3.3.1.13,7] dec-l-yl) -1-oxoethyI] -2-azabicyclo [3.1.0]hexane-3-carbonitrile)，如式 M，所不,
权利要求
1.一种制备式2结构的胺的方法，
2.权利要求1的方法，其中进行调节反应混合物的pH的步骤以将反应混合物的pH维持在约7.0至约8.6。
3.权利要求1的方法，其中进行调节反应混合物的pH的步骤以将反应混合物的pH维持在 8.0±0.2。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中以这样的量添加甲酸铵，以提供约1.9:1至约2.5:1的范围内的甲酸铵:式I酸的摩尔比例。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中以这样的量添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，以提供约500:1至约1500:1的范围内的NAD:式I酸的摩尔比例。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中步骤c的反应混合物维持在约25°C至45°C的范围内的温度。
7.权利要求1的方法，其中将该3-羟基-α-酮基三环[3.3.1.13，7]癸烷_1_乙酸、甲酸铵、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、二硫苏糖醇及部分纯化的苯丙氨酸脱氢酶/甲酸脱氢酶的水溶液加热到约35至约40°C的温度且将其pH维持在约7.8至约8.2的范围内达约24至约48小时，以制备该胺。
8.一种制备式3结构的经BOC-保护的胺的方法
9.权利要求8的方法，其中该(aS) - α -氨基-3-羟基-三环[3.3.1.13，7]癸烷_1_乙酸的水溶液和二碳酸二叔丁酯的混合物的PH维持在约8.5至约12.5的范围内。
10.权利要求8的方法，其进一步包括从该反应混合物中离析该经BOC-保护的胺且对该经BOC-保护的胺进行结晶的步骤。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中部分纯化的苯丙氨酸脱氢酶/甲酸脱氢酶(PDH/FDH)是通过包括下述的方法制备的: a.制备能够产生苯丙氨酸脱氢酶和/或甲酸脱氢酶的微生物的发酵培养液； b.对该培养液进行微流体化以从所得的细胞中释放出活性且形成含有TOH及/或FDH酶的微流体化的培养液； c.经由使用絮凝剂处理该培养液以凝结细胞碎屑而澄清该培养液，并除去DNA和不需要的蛋白质； d.过滤该澄清的培养液'及 e.浓缩该培养液以得到具有对于PDH为至少约400IU/毫升和对于FDH为至少约20IU/毫升的roH/FDH活性的经纯化的酶浓缩物。
12.权利要求11的方法，其中在保持该培养液的温度低于约40°C的同时对该培养液进行微流体化。
13.权利要求12的方法，其中保持该培养液的温度在约4°C至约30°C的范围内。
14.权利要求1-10中任一项的方法，其中部分纯化的苯丙氨酸脱氢酶/甲酸脱氢酶(TOH/FDH)是通过包括下述的方法制备的: a.制备能够产生苯丙氨酸脱氢酶及/或甲酸脱氢酶的大肠杆菌(Escherichiacoli)的发酵培养液； b.在8000至30，OOOpsi范围内的压力下对该培养液进行微流体化，同时保持该培养液的温度在4至30°C的范围内，以从所得的细胞中释放出活性且形成含有苯丙氨酸脱氢酶及/或甲酸脱氢酶的微流体化培养液； c.经由使用絮凝剂处理该培养液以凝结细胞碎屑并除去DNA和不需要的蛋白质而澄清该培养液； d.过滤该澄清的培养液；及 e.浓缩该培养液以得到具有对于苯丙氨酸脱氢酶为至少约400IU/毫升和对于甲酸脱氢酶为至少约20IU/毫升的苯丙氨酸脱氢酶及甲酸脱氢酶活性的部分纯化的酶浓缩物。
15.权利要求11-14中任一项 的方法，其中在约12,000至约20，OOOpsi范围内的压力下对该培养液进行微流体化。
16.权利要求11-14中任一项的方法，其中该苯丙氨酸脱氢酶得自芽孢八迭球菌属(Sporosarcina)或热放线菌属(Thermoactinomyces)。
17.权利要求11-14中任一项的方法，其中该苯丙氨酸脱氢酶得自中间型嗜热放线菌(Thermoactinomyces intermedius)。
18.权利要求11-14中任一项的方法，其中该苯丙氨酸脱氢酶得自中间型嗜热放线菌ATCC33205，其在大肠杆菌或巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)中表达。
19.权利要求11-14中任一项的方法，其中该苯丙氨酸脱氢酶是在大肠杆菌中表达的中间型嗜热放线菌ATCC33205的苯丙氨酸脱氢酶，且该甲酸脱氢酶是在大肠杆菌中表达的巴斯德毕氏酵母ATCC20864的甲酸脱氢酶。
20.权利要求11-14中任一项的方法，其中所述微生物是包含质粒pBMS2000-PPDFDH-PDH-mod 的大肠杆菌 JMl 10。
21.权利要求11-16中任一项的方法，其中该澄清的培养液是经超滤的。
全文摘要
本发明涉及制备二肽基肽酶IV抑制剂的方法及用于该制备方法的中间体，具体涉及提供一种制备二肽基肽酶IV的基于环丙基稠合的吡咯烷的抑制剂的方法，其采用具有结构3的经BOC-保护的胺，该经BOC-保护的胺如下制备使用甲酸铵、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、二硫苏糖醇及部分纯化的苯丙氨酸脱氢酶/甲酸脱氢酶的酶浓缩物(PDH/FDH)处理结构1的酸，使该酸进行还原胺化反应，且在不离析的情况下使用二碳酸二叔丁酯处理所生成的结构2的胺，以形成经BOC-保护的胺。
文档编号C12P15/00GK103215320SQ20131008930
公开日2013年7月24日 申请日期2005年4月13日 优先权日2004年4月14日
发明者迈克尔.波利蒂诺, 马修.M.卡丁, 保罗.M.斯科尼兹尼, 贾森.G.陈 申请人:布里斯托尔-迈尔斯.斯奎布公司