专利名称：检测表皮生长因子受体19、21外显子突变的引物探针体系、方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种检测表皮生长因子受体19、21外显子突变的引物探针体系、方法及试剂盒。
背景技术：
肺癌(Lungcancer)尤其是非小细胞癌(Non-small cell lung cancer)是当前全球最为恶性的肿瘤之一。虽然传统的化学疗法不断提高，但是晚期患者的预后比较差。随着分子技术的水平的提高，以EGFR (表皮生长因子受体)为治疗靶点的靶向药物一络氨酸激酶抑制剂(TKI)在NSCLC治疗中日渐突出，其中吉非替尼和埃罗替尼治疗NSCLC已经广泛用于NSCLC治疗。随着临床数据的积累，在使用NSCLC的治疗中，有一部分人对TKI治疗有反应。通过对这些TKI治疗有效地患者的EGFR基因进行分析发现，几乎都存在EGFR基因突变。大量的研究表明肺癌患者EGFR基因突变主要发生在18 21外显子上，其中90%以上的突变为19外显子15个碱基缺少和21外显子L858R突变。这些突变与TKI的疗效相关，可能的原因是这些突变改变了 EGFR ATP-结合区的蛋白结构，使得该区域易于与TKI结合，从而提高了 TKI治疗的药效。因此临床上使用TKI治疗前检测患者EGFR基因突变，非常必要。由于在我国，EGFR基因突变主要集中在19外显子和21外显子。因此快速、准确的检测EGFR突变指导临床用药，提高我国个性化用药的进程非常重要。自PCR技术问世，该术被广泛应用于分子诊断中。基于PCR技术的突变检测技术得到了迅速的发展:PCR-RFLP, allele-sepecific PCR, TaqMan probe, ARMS, PNA-LNA clamp突光 PCR、Cycleave probe PCR, Nanofluidic Digital PCR Arrays,MassArray 和 DNA 芯片等等。PCR-RFLP是早期实验开发检测SNP分型技术，它依赖于巧妙地选择限制性内切酶切出用于识别突变位点的短片段长度多态，但是这种方法需要电泳分离酶消化之后的产物，这将严重限制反应的通量和操作的自动化。ARMS技术与allele-specific PCR大致相同，利用DNA聚合酶缺失3’ 5’的外切活性，3’端错配的引物低于正常引物的延伸速度，当错配数目达到一定的严谨程度时，3’端则无法延伸，如果PCR有条带，说明有相应的突变。ARMS技术敏感性和特异较高，已经成功应用于临床检测SNP。TaqMan探针是一种寡核酸探针,在探针的3’末端连接有突光报告基团,而5’末端连接有荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，当PCR扩增时，Taq酶的5’外切酶活性能将结合到靶DNA链上的探针的淬灭基团切除掉，使探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。通过使用不同的荧光报告基团，在同一个PCR中可以同时检测不同的酶切消化等位基因特异性探针。这种5’外切酶实验己经成功用来区分只有一个碱基差异的等位基因。Cycleave probe PCR, 技术原理类似Taqman探针,只是探针含有一个rNTP碱基于SNP互补，当存在突变是，rNTP与突变配对，RNase H识别并切割rNTP，使探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，荧光产生。
PNA-LNA-c I amp 技术，采用 NestPCR 技术和 PNA-LNA-clamp 探针，PNA-LNA-clamp探针特异性的封闭野生性SNP，阻止野性性模板扩增从而达到扩增突变的目的。虽然这项技术很灵敏，但经历两次PCR容易污染，探针设计也受到限制。尽管上述SNP检测技术敏感性和特异性很高，但是这些技术需要精密昂贵的控温和荧光检测设备。因此，开发出一种经济实用型的SNP检测方法有非常重要的意义。目前SNP突变检测技术，金标准还是“DNA测序”，但是DNA测序敏感性比较低，<20%的核酸突变比较难分辨，并且周期比较长。核酸恒温扩增技术如恒温酶切检测技术(3WJ, three way junction) invader技术逐渐被应用突变检测。3WJ是Amicarelli G等提出，其技术原理为:以两条探针PA和PB组成3WJ的核心部件，PB作为锚定探针与模板结合，PA作为分辨探针识别SNP，3’末端带有BHQ淬灭集团，酶切位点5’端上游带有荧光集团FAM ；PA和PB之间含有6 8个互补碱基，其中包含一个限制性内切酶切割位点(5’ -GTAC-3’)，当待检测SNP存在，PA和PB与靶序列形成稳定的“Y”型结构，限制内切酶如CviQl识别并切下淬灭集团-BHQ，荧光产生。尽管是JP和3WJ技术各自能够很好的分辨SNP多态性，但是其线性扩增效率，敏感度远远达不到检测临床样本DNA的能力，更重要的是其只能检测单链DNA。
发明内容
本发·明要解决的技术问题是提供了一种特异性强、灵敏的检测表皮生长因子受体19、21外显子突变的引物探针体系，并将不对称PCR与核酸恒温扩增、荧光检测技术进行结合设计出了一种快速、简单、特异、灵敏、稳定、低成本的检测表皮生长因子受体19、21外显子突变的方法，并根据该方法设计出了简单、实用的检测表皮生长因子受体19、21外显子突变的试剂盒。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
设计出一种检测表皮生长因子受体19、21外显子突变的引物探针体系，包括如下扩增EGFR 19外显子E746 A750del突变和EGFR 21外显子L858R突变的不对称PCR引物，以及与其引物相匹配的3WJ探针如下:
权利要求
1.一种检测表皮生长因子受体19、21外显子突变的引物探针体系，包括如下扩增EGFR19外显子E746 A750del突变和EGFR 21外显子L858R突变的不对称PCR引物，以及与其引物相匹配的3WJ探针:
2.一种检测表皮生长因子受体19、21外显子突变的方法，包括如下步骤: (O按常规方法进行待测样品处理； (2)PCR扩增:以权利要求1所述的检测19 DEL的上游引物A和下游引物B形成如下不对称PCR体系扩增EGFR19外显子Ε746 A750del:
3.—种检测表皮生长因子受体19、21外显子突变的试剂盒，至少包括如下试剂: (1)形成权利要求2所述扩增EGFR19外显子E746 A750del的不对称PCR体系所需要的2mM Mg2+、200nM dNtP、300nM上游引物、30nM下游引物、Taq酶，以及形成其所对应的3WJ探针体系所需要的1XBSA、限制内切酶、探针A和探针B ; (2)形成权利要求2所述 扩增21外显子L858R的不对称PCR体系所需要的2mMMg2+、.200nM dNtP、300nM上游引物、30nM下游引物、Taq酶，以及形成其所对应的3WJ探针体系所需要的1XBSA、限制内切酶、探针和探针B ^。
全文摘要
本发明涉及一种检测表皮生长因子受体19、21外显子突变的引物探针体系、方法及试剂盒。本发明方法将不对称PCR与核酸恒温扩增、荧光检测技术进行了有机的整合一方面应用不对称PCR扩增技术及特殊引物获得大量的单链DNA，弥补了3WJ(恒温酶切核酸检测技术)的低效率的线性扩增的不足；另一方面了应用了3WJ技术特异性和简便性，使反应温度可控制在30oC左右，而不用担心酶的活性降低，检测过程中不需要昂贵和精密的控温设备，特殊的探针设计使得只要简单的荧光检测仪器就可以分辨。本发明具有更快速、简单、特异、灵敏等优势。
文档编号C12N15/11GK103233064SQ20131009207
公开日2013年8月7日 申请日期2013年3月21日 优先权日2013年3月21日
发明者陈晓琦, 樊青霞, 赵亚敏, 郑玉玲, 王峰 申请人:陈晓琦