专利名称：一种猪瘟病毒特异性抗原蛋白gp55特定位点原核表达方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒特异性抗原蛋白gp55特定位点原核表达方法。
背景技术：
猪瘟(CSF)是猪的一种重要的传染病，给养猪业造成严重的经济损失。国际兽疫局将猪瘟列入A类法定传染病之一，自1833年首次在美国发现后，此病便遍及全世界，虽然很多国家目前已经消灭了猪瘟，但猪瘟仍然是我国养猪业的第一大传染病。猪瘟病毒(CSFV)属于黄病毒科，瘟病毒属。该病毒是一种有囊膜的正链RNA病毒，电镜下，猪瘟病毒粒子的形态呈圆形，直径约为70nm。其中内部是电子致密的核心，直径约为40nm，有时呈六角形，外有包膜包裹。表面有6-8nm的流苏样结构，外包宿主细胞源的脂质囊膜，内部呈二十面体对称的核衣壳，脂蛋白囊膜上，存在着病毒基因组编码的囊膜糖蛋白EO、El和E2，组成核衣壳蛋白的C蛋白与病毒基因组相连，以维持核酸的稳定性。猪瘟病毒(CSFV)囊膜糖蛋白E2 (即gp55蛋白)是目前研究最为清楚的一种结构蛋白，在猪瘟病毒(CSFV)编码的蛋白中，E2是最容易发生结构变异的一种蛋白，但又是猪瘟病毒(CSFV)的主要保护性抗原结构域蛋白，能诱导机体产生中和抗体。E2蛋白有ORF编码的370个氨基酸残基组成，在感染细胞中，其分子量为56kD，主要以同源二聚体或异源二聚体的形式存在于感染细胞或病毒粒子的表面，这主要是因为E2蛋白的羧基端有一段长达约40个疏水性氨基酸残疾的跨膜区。利用这个E2蛋白的各种单抗，人们已经鉴定出猪瘟病毒(CSFV) E2蛋白具有四个主要抗原结构域A、B、C和D，其中A、B、C含有中和性抗原表位，这些抗原结构域位于E2蛋白近N端的1/2部分，且处于两个相对独立的抗原结构单位。人们的这些研究 为以后制备猪瘟抗原提供了方便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪瘟病毒特异性抗原蛋白gp55特定位点原核表达方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种猪瘟病毒特异性抗原蛋白gp55特定位点原核表达方法，所用合成基因如SEQ IDN0.1所示。上述方法，包括以下步骤:
第一步，给合成基因加上基因引物得目的基因，PCR扩增后产物回收；
第二步，将目的基因导入载体中，形成重组载体；
第三步，重组载体导入原核细菌中进行表达。步骤(I)中所用基因引物为BamHI酶切位点和Hind III酶切位点，其中在5’端加上BamHI酶切位点，3’端加上Hind III酶切位点。
步骤(2)中所用载体为质粒pET28a，所用原核细菌为大肠杆菌，较好的选用大肠杆菌BL21。本发明对现有的猪瘟病毒E2基因的主要抗原区进行了整合，并针对不同株型的特异性进行兼并性分析，同时避开大肠杆菌中的稀有密码子，以此合成全序列长度为360bp的xE2核苷酸序列(即合成的基因序列)。采用传统的方法进行表达，方法操作简单，方便，所得抗原蛋白具有强的特异免疫原活性，为今后开发基因工程亚单位疫苗、诊断检测猪瘟抗体和制备检测猪痕病的单克隆抗体的研究提供了良好的基础。
图1为诱 导表达猪瘟E2蛋白SDS-PAGE电泳图，图中，第一泳道为MarkerProteinRuler I，第二泳道CK为未诱导的大肠杆菌BL21菌株的全蛋白，1、2、3分别是用IPTG诱导后的大肠杆菌BL21全蛋白序列。CK中无目的条带，1、2、3在15KD左右有明显的目的条带；
图2为N1-NTA亲和层析柱纯化后猪瘟E2蛋白SDS-PAGE电泳图，图中，第I泳道为洗脱柱子时收集的第I毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图;第2泳道为洗脱柱子时收集第2毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图；第3泳道为洗脱柱子时收集第3毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图；第4泳道为洗脱柱子时收集第4毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图；第5泳道为洗脱柱子时收集第5毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图；第6泳道为洗脱柱子时收集第6毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图；第7泳道为洗脱柱子时收集第7毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图；第8泳道为洗脱柱子时收集第8毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不仅限于此。实施例1
1、用DNAMAN软件对GenBank中18株E2基因进行比对分析，选取猪瘟病毒E2基因的主要抗原区，其中涵盖了 E2基因A、B、C、D所有的抗原区，并针对不同株型的特异性进行兼并性分析，同时避开大肠杆菌中的稀有密码子，以此合成全序列长度为360bp的xE2核苷酸序列(即合成的基因序列)。2、根据合成的基因序列设计引物:5’端加上BamHI酶切位点5’ -TTTGGATCCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGA-3’ ；3’ 端加上 Hind III酶切位点 5’-CCCAAGCTTACCGTTCAACAAGGTTG-3’。所得基因为目的基因，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒(购自Axygen公司)进行PCR扩增后进行产物回收，接着对回收产物进行双酶切，酶切体系=BamHI和Hind III各I微升，回收产物 30 微升，Buffer Tango (购自 Thermo Scientific 公司,Lot:00097285) 4微升，无菌双蒸水4微升，酶切三个小时。3、对质粒pET28a用BamHI和Hind III进行双酶切，酶切体系=BamHI和Hind III各I微升，质粒 10 微升，Buffer Tango (购自 Thermo Scientific 公司，Lot:00097285) 4 微升，无菌双蒸水24微升，酶切三个小时。并与上述双酶切产物进行连接，酶连体系为:目的基因4微升，质粒I微升，T4连接酶I微升，10*T4连接酶Buffer (购自北京全式金生物技术有限公司，Lot:G20924)l微升，无菌双蒸水3微升。16°C，反应0.5小时，得到重组新载体 pET28a_xE2。4、重组质粒pET28a_xE2转入大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS表达菌株中。取I微升重组质粒pET28a-xE2加入到100微升大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS感受态细胞中，冰上放置30min, 42°C水浴90s热激，冰上放置2min，加入Iml LB液体培养基，37°C，220r/min培养Ih0之后室温25°C,8000r/min离心2min,弃上清留100微升液体,混勻,涂布在100 μ g/ml卡那霉素的固体LB平板上。5、37°C倒置培养12h_16h，用10微升无菌枪头挑取平板上单菌落加入到还有Iml含100 μ g/ml卡那霉素的液体LB培养基中，37°C，220r/min培养5h.取500微升菌液测序(华大基因负责测序)分析。6、确定为阳性的转化子进行扩大培养,在200ml 100 μ g/ml卡那霉素液体LB培养基上进行接种，接种量为2%，37°C 200r/min培养至菌体浓度为0.20D_，然后用浓度
0.4mmol/L的IPTG诱导5h表达。诱导表达猪瘟E2蛋白SDS-PAGE电泳图如图1所示。7、诱导结束后室温25°C、10000r/min离心IOmin弃去上清液，然后用IOml生理盐水复悬，用35%强度，间隔5s超声波对菌体进行30min破碎，将破碎并离心(25 °C，10000r/min离心IOmin)后的上清液进行SDS-PAGE鉴定，在15kD，有目的蛋白。N1-NTA亲和层析柱纯化后猪瘟E2蛋白SDS-PAGE电泳图如图2所示。实施例2
1、用DNAMAN对GenBank中18株E2基因进行比对分析，选取猪瘟病毒E2基因的主要抗原区，其中涵盖了 E2基因A、B、C、D所有的抗原区，并针对不同株型的特异性进行兼并性分析，同时避开大肠杆菌中的稀有密码子，以此合成全序列长度为360bp的xE2核苷酸序列(即合成的基因序列)。2、根据合成的基因序列设计引物:5’端加上BamHI酶切位点5’ -TTTGGATCCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGA-3’ ；3’ 端加上 Hind III酶切位点 5’-CCCAAGCTTACCGTTCAACAAGGTTG-3’。所得基因为目的基因，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒(购自Axygen公司)进行PCR扩增后进行产物回收，接着对回收产物进行双酶切，酶切体系=BamHI和Hind III各I微升，回收产物 30 微升，Buffer Tango (购自 Thermo Scientific 公司，Lot:00097285) 4微升，无菌双蒸水4微升，酶切三个小时。3、对质粒pET30a用BamHI和Hind III进行双酶切，酶切体系=BamHI和Hind III各I 微升，质粒 10 微升，Buffer Tango (购自 Thermo Scientific 公司，Lot:00097285) 4 微升，无菌双蒸水24微升，酶切三个小时。并与上述双酶切产物进行连接(酶连体系:目的基因4微升，质粒I微升，T4连接酶I微升，10*T4连接酶Buffer (购自北京全式金生物技术有限公司，Lot:G20924)l微升，无菌双蒸水3微升。16°C，反应0.5小时)，得到重组新载体 pET30a-xE2o4、重组质粒pET30a_xE2转入大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌株中。取I微升重组质粒pET30a-xE2加入到100微升大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中，冰上放置30min，42°C水浴90s热激，冰上放置lmin，加入Iml LB液体培养基，37°C 220r/min培养lh。室温8000r/min离心2min,弃上清留100微升液体,混勻,涂布在100 μ g/ml卡那霉素的固体LB平板上。5、37°C倒置培养12h_16h ，用10微升无菌枪头挑取平板上单菌落加入到还有Iml含100 μ g/ml卡那霉素的液体LB培养基中，37°C，220r/min培养5h.取500微升菌液测序(华大基因负责测序)分析。6、确定为阳性的转化子进行扩大培养，在200ml 100 μ g/ml卡那霉素液体LB培养基上进行接种，接种量为2%，37°C 200r/min培养至菌体浓度为0.20D_，然后用浓度
0.4mmol/L 的 IPTG 诱导 5h 表达。7、诱导结束后室温25°C，10000r/min离心IOmin弃去上清液，然后用1Oml生理盐水复悬，用35%强度，间隔5s超声波对菌体进行30min破碎，取破碎并离心(室温25°C，10000r/min离心1Omin)后的上清液进行SDS-PAGE鉴定。在15kD，有目的蛋白。
权利要求
1.一种猪瘟病毒特异性抗原蛋白gp55特定位点原核表达方法，其特征在于，所用合成基因如SEQ ID N0.1所示。
2.如权利要求1所述一种猪瘟病毒特异性抗原蛋白gp55特定位点原核表达方法，其特征在于，包括以下步骤: 第一步，给合成基因加上基因引物得目的基因； 第二步，将目的基因导入载体中，形成重组载体； 第三步，重组载体导入原核细菌中进行表达。
3.如权利要求2所述一种猪瘟病毒特异性抗原蛋白gp55特定位点原核表达方法，其特征在于，第一步中所述基因引物为BamHI酶切位点和Hind III酶切位点，其中5’端加上BamHI酶切位点，3’端加上Hind III酶切位点。
4.如权利要求2所述一种猪瘟病毒特异性抗原蛋白gp55特定位点原核表达方法，其特征在于，第二步中所用载体为质粒pET28a，所用原核细菌为大肠杆菌。
5.如权利要求4所述一种猪瘟病毒特异性抗原蛋白gp55特定位点原核表达方法，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21。
全文摘要
本发明公开了一种猪瘟病毒特异性抗原蛋白gp55特定位点原核表达的方法，该方法合成全序列长度为360bp的xE2核苷酸序列(即合成的基因序列)，合成基因如SEQIDNO.1所示，给合成基因加上基因引物得目的基因，PCR扩增后产物回收；将目的基因导入载体中，形成重组载体；然后把重组载体导入原核细菌中进行表达，本发明方法操作简单，方便，所得抗原蛋白具有强的特异免疫原活性，为今后开发基因工程亚单位疫苗、诊断检测猪瘟抗体和制备检测猪瘟病的单克隆抗体的研究提供了良好的基础。
文档编号C12N15/70GK103146718SQ20131009258
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月21日 优先权日2013年3月21日
发明者孙强, 鲁龙, 曾小宇, 任宝红, 王朋, 李慧英, 王真, 何宏轩, 路纪琪, 张如民, 赵林萍 申请人:郑州中道生物技术有限公司