专利名称：一种检测狗钩端螺旋体核酸的荧光定量pcr引物、探针及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及致病性狗钩端螺旋体诊断的荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒。此发明敏感、特异、快速的扩增感染狗的致病性钩端螺旋体(Leptospira interrogansCanicola CanicolajL.1nterrogans Icterohemorrhagiae IcterohemorrhagiaejL.1nterrogans Pomona Pomona, ^BLkerschneri Grippotyphosa Grippotyphosa)，而不扩增非致病性的钩端螺旋体(L.biflexa)的核酸。
背景技术：
钩端螺旋体能引起多种动物和人发病的重要人畜共患病。钩端螺旋体感染的主要现有实验室诊断技术包括:1)临症诊断。钩端螺旋体引起的临症症状不特异，在临床诊断的价值有限；2)病原体分离:此发需要的时间长，而且需要经过特殊训练的专业人才；3)血清学实验检测抗钩端螺旋体的抗体。此技术的局限性是不能对钩端螺旋体进行早期诊断，而且不能有效区别诊断区分钩端螺旋体的感染者、感染后的康复者和接受了疫苗接种者；3)PCR技术检测钩端螺旋体的核酸。钩端螺旋体现有16个种、约38个血清组、超过250个血清型，感染多种宿主。此外，钩端螺旋体的基因的流动性很大，不同株之间的基因序列差异较大。因此，很难有一个单一的PCR方法精确、敏感、快速的检测所有株的钩端螺旋体。现有的PCR方法不能对狗的钩端螺旋体感染起到快速、有效的分子诊断。尤其重要的是，钩端螺旋体的患者的血液、尿液中的钩端螺旋体的数量低，而现在市场上的诊断技术的灵敏度不够。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、特异性强、灵敏度高、适合临床使用的检测的感染狗的致病性钩端螺旋体的定量 PCR检测技术，包括检测引物、探针和试剂盒。本发明的原理和最核心的技术关键是科学地设计扩增和检测狗致病性钩端螺旋体的特异、高效的引物和探针。在保证设计的引物高效扩增致病性狗钩端螺旋体、设计的探针特异检测致病性狗钩端螺旋体的同时，确保此引物和探针不扩增和检测非致病性的钩端螺旋体。从GenBank (www.ncb1.nlm.nih.gov)获取如下致病性狗钩端螺旋体的LigA基因序列，并用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法对所有序列进行对齐。相关的
息见表_1:表-1.致病性狗钩端螺旋体。
权利要求
1.一种检测狗钩端螺旋体核酸的荧光定量PCR的引物和探针，其特征在于所述引物和探针的如下: 引物: 上游引物:5 ’ -GCTACWGGGATCTACTCTGACAACTC-3，; 下游引物:5’ -GGACTACTTACYTTTCCGAATGTGGCT-3’ ； 探针: 6-FAM 探针: 5，-ATTTCAAACGCCMAAAAAAATCAAGGAAACKCTTA- (6-FAM) -3，; LCRed640 探针: 5 ‘ - (LCRed640) -GGAGCAGCTACAGGARCAACGGATATT-(磷酸建)_3 ’。
2.一种检测狗钩端螺旋体核酸的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒包括5 XFRET-qPCR Stock 22微升，以及22微升的5 x的Oligo混合物，所述Oligo混合物中含浓度为5 μ M的上游引物、5 μ M下游引物、I μΜ的6-FAM探针、I μ M的LCRed640探针。
全文摘要
本发明涉及一种检测狗钩端螺旋体核酸的荧光定量PCR的引物、探针及试剂盒，所述引物和探针如SEQIDNO.1-4所示，所述试剂盒包括5xFRET-qPCRStock22微升,以及22微升的5x的Oligo混合物，所述Oligo混合物中含上述引物和探针。采用本发明的引物和探针可以快速、特异、灵敏地检测致病性狗钩端螺旋体。
文档编号C12R1/01GK103205502SQ20131014690
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月24日 优先权日2013年4月24日
发明者王成明 申请人:扬州大学