一种编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因的用途【专利摘要】一种编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因的用途。本发明披露了一种与十字花科黑腐病病菌致病相关的编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因在防治植物十字花科黑腐病病害中的用途，所述基因是编码序列表中序列2所示蛋白质的DNA序列，即序列表中序列1所示的DNA序列。本发明鉴定了十字花科黑腐病菌编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因与黑腐病致病相关，因而能够为防治十字花科植物黑腐病病害提供药物靶标。【专利说明】一种编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因的用途【
技术领域：
】[0001]本发明涉及植物病原细菌的致病相关基因及其用途，尤其是十字花科黑腐病病菌的致病相关基因及其用途。【
背景技术：
】[0002]植物病害一直是农作物减产、品质降低的主要因素之一。随着病原菌对药物抗性的增强，农药用量在不断增加，这不仅加剧了环境污染、药物残留，也大大增加了农业成本，因此，亟待研发新的防病治病策略和新型的无公害药物。弄清植物病原菌侵染寄主的遗传机制是开发新型药物和防病策略的关键。[0003]海藻糖是一种非还原糖,它由两单位葡萄糖通过α，α-1，1-糖苷键连接而成。这种糖除了非还原的特性外，还具有高亲水性、高化学稳定性及不形成内在氢键的特性。海藻糖广泛分布在包括细菌、真菌、酵母、昆虫、无脊椎动物、植物在内的各生物体里。目前在哺乳动物里还未发现海藻糖。由于海藻糖特殊的物理特性，在包括干燥、脱水、热击、冷冻及氧化在内的环境压力下，海藻糖能保护细胞的完整性。海藻糖具有高保水性，在脱水、干燥条件下维持细胞膜的流动性。在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，海藻糖的合成是由一个多组分复合体完成的，这复合体包含两个具催化活性的6-磷酸海藻糖合成酶(TPS,Trehalose-6-PhosphateSynthase)和6_憐酸海藻糖憐酸酶(TPP,Trehalose-6-PhosphatePhosphatase)。TPS催化UDP-葡萄糖和6_憐酸葡萄糖形成6_憐酸海藻糖，TPP催化6-磷酸海藻糖形成海藻糖。在大肠杆菌中，这两个酶的活性分别由基因OtsA和OtsB编码的酶负责；其中，基因OtsA负责TPS活性，基因otsB负责TPP活性。[0004]十字花科黑腐病菌(Xcc,Xanthomonascampestrispv.campestris)是一种能在全球范围内引起所有十字花科植物黑腐病的革兰氏阴性细菌。该菌能在寄主的任何生长期通过水孔、气孔或伤口侵入植物体内，引起十字花科黑腐病病害，寄主包括甘蓝、花椰菜、大白菜、萝卜以及油菜等。典型的黑腐病症状是在叶缘上形成V字形病斑。随着病斑的扩大，叶脉变黑，因而被称为黑腐病。黑腐病被认为是对十字花科植物危害最为严重的病害，尤其在热带和亚热带地区，温度和湿度都适宜于该菌的生长繁殖，因此发病更加严重。由于遗传稳定性和遗传可操作性，十字花科黑腐病菌一直被用作研究微生物与植物相互作用分子机理的模式细菌。因此，鉴定与十字花科黑腐病菌致病相关的基因，对防治植物病害具有显著的意义。[0005]目前，海藻糖生物合成在植物病原细菌中还未见有过报道。如果鉴定了十字花科黑腐病菌的致病相关基因，便能够为防治十字花科植物黑腐病病害提供药物靶标。[0006]参考文献[0007]1、Bell,ff.，Sun,ff.，Hohmann,S.，ffera,S.，Reinders,A.，DeVirgilio,C.,ffiemken,A.,Thevelein,J.M.CompositionandfunctionalanalysisoftheSaccharomycescerevisiaetrehalosesynthasecomplex.JournalofBiologicalChemistry.1998.273(50):33311-33319.[0008]Beringer,J.，Beynon，J.,Buchanan-Wollaston,A.，Johnston，A.Transferofthedrug-resistancetransposonTn5toRhizobium.Nature.1978.276:633-634.[0009]3、Chen,Q.，Haddad，G.G.Roleoftrehalosephosphatesynthaseandtrehaloseduringhypoxia:fromfliestomammals.JournalofExperimentalBiology.2004.207(18):3125-3129.[0010]4、Kaasen，1.，McDougalI,J.，Stra'm，A.AnalysisoftheotsBAoperonforosmoregulatorytrehalosesynthesisinEscherichiacoliandhomologyoftheOtsAandOtsBproteinstotheyeasttrehalose-6-phosphatesynthase/phosphatasecomplex.Gene.1994.145(1):9-15.[0011]5、Leslie，S.B.，Israeli，E.，Lighthart，B.，Crowe,J.H.，Crowe,LM.Trehaloseandsucroseprotectbothmembranesandproteinsinintactbacteriaduringdrying.AppliedandEnvironmentalMicrobiology.1995.61(10):3592-3597.[0012]6^Liu,Y.G.,Whittier,R.F.ThermalasymmetricinterlacedPCR-automatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromPlandYACclonesforchromosomewalking.Genomics.1995.25(3):674-681.[0013]7、Qian,W.，Jia，Y.，Ren,S.X.，He，Y.Q.，Feng,J.X.，Lu，LF.，Sun，Q.，Ying，G.，Tang,D.J.，Tang,H.ComparativeandfunctionalgenomicanalysesofthepathogenicityofphytopathogenXanthomonascampestrispv.campestris.GenomeResearch.2005.15(6):757-767.[0014]8、Sharma，S.，Signer，E.TemporalandspatialregulationofthesymbioticgenesofRhizobiummelilotiinplantarevealedbytransposonTn5-gusA.Genes&Development.1990.4(3):344-356.[0015]9、Staskawicz,B.，Dahlbeck，D.，Keen，N.，Napoli，C.Molecularcharacterizationofclonedavirulencegenesfromrace0andrace1fPseudomonassyringaepv.glycinea.JournalofBacteriology.1987.169(12):5789-5794.【
发明内容】[0016]本发明所要解决的技术问题是提供一种编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因的用途，通过鉴定该基因与十字花科黑腐病菌致病相关而为防治十字花科植物黑腐病病害提供药物靶标。[0017]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种与十字花科黑腐病病菌致病相关的编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因在防治植物十字花科黑腐病病害中的用途，所述基因是编码序列表中序列2所示蛋白质的DNA序列。[0018]优选地，该编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因是序列表中序列I所示的DNA序列。[0019]本发明鉴定了十字花科黑腐病菌编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因XC1078与黑腐病致病相关，因而能够为防治十字花科植物黑腐病病害提供药物靶标。【专利附图】【附图说明】[0020]图1为编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因的克隆酶切电泳图谱；[0021]图2为在编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因插入突变体237E11的PCR验证凝胶图；[0022]图3为编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因插入突变体237E11的抗渗透势检测；[0023]图4为编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因插入突变体237E11的致病性试验。【具体实施方式】[0024]以下结合附图和优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。应该理解，以下列举的实施例仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。[0025]本发明旨在提供与十字花科黑腐病菌致病相关的编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因XC1078。首先确定XC1078基因与十字花科黑腐病致病性的关系，并拟阐明海藻糖生物合成基因在Xcc中的抗渗透势的功能，由此得到编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因在防治植物十字花科黑腐病方面的用途。[0026]本发明在十字花科黑腐病菌致病变种Xcc8004的基因组中，发现编号为XC1078的开放阅读框(0RF,0penReadingFrame)编码的蛋白与大肠杆菌的otsB基因具有高度相似性。[0027]本发明所提供的编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因，是编码序列表中序列2所示蛋白质的DNA序列。[0028]编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因是序列表中序列I所示的DNA序列。[0029]目前，该编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因(以下简称XC1078基因)的序列已在美国国家生物技术信息中心(NCBI,NationalCenterofBiotechnologyinformation)公布，其基因组序列号为NC_007086，该基因编码蛋白序列号为YP242168。携带该基因的质粒(自命名PCXC1078)已在广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室保存。[0030]序列表中序列I的DNA是十字花科黑腐病菌8004菌株的编码6_磷酸海藻糖磷酸酶的基因，由1228个碱基组成，含完整的编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因，自5’端的第370位至第1125位核苷酸为该基因的0RF，自5’端的第370位至第372位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自5’端的第1126位至第1128位核苷酸为终止密码子TGA。[0031]序列表中序列2的蛋白质是由XC1078基因编码的6-磷酸海藻糖磷酸酶的蛋白产物，由252个氨基酸组成。该蛋白质预测分子量为26798.35道尔顿，等电点为5.44。[0032]本发明通过以下方法步骤鉴定编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因与十字花科黑腐病致病相关:[0033](一)十字花科黑腐病菌突变体库的构建[0034]以大肠杆菌和Xcc之间的穿梭质粒pLAFRl为载体,将转座子Tn5gusA5引入Xcc野生型菌株8004，然后通过引入不相容质粒pPHlJI驱赶pLAFRl，通过抗生素(卡那霉素)抗性标记筛选Xcc::Tn5gusA5插入突变体，结合Xcc全基因组序列和TAIL-PCR(ThermalAsymetrixInterlaced-PCR)技术,确定Tn5gusA5在基因组上的插入位置，并对插入位置进行PCR验证。[0035]通过考察突变体的致病性、胞外酶活性、胞外多糖合成等表型的变化，筛选十字花科黑腐病致病相关基因，本发明涉及其中一个致病相关基因，即XC1078基因，其插入的突变体的编号为237E11(该编号为自命名编号，即十字花科黑腐病菌突变体库的XC1078基因的插入突变体的编号)。[0036](二)XC1078基因的克隆及序列测定[0037]根据XC1078基因序列，设计引物(XC1078F:GGGGGTACCGAAGGGAAGAACACCGAGGCTAC和XC1078R:GGGTCTAGAACCAAAACTGCAATTGCCGATGACG)，以十字花科黑腐病菌8004菌株总DNA为模板，用PCR法扩增该基因全长序列，并将其克隆至克隆载体pGEM3Zf(+)中，用双脱氧核苷酸法在ABI377DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列。[0038]将测序验证正确的XC1078基因序列克隆至穿梭载体pLAFRJ中，获得了含该基因的重组质粒PCXC1078。对该质粒用Kpn1、XbaI酶切，除了一个22kb的载体条带外，还有一个1228bp的外源片段，请参见图1，其中，Ml=IOObp标准DNA(片段大小从大到小依次为:3kb，2kb，1.5kb,1.2kb,lkb，0.9kb，0.8kb，0.7kb等)；M2:λ/HindIII2标准DNA(片段大小从大到小依次为:23.lkb,9.4kb,6.6kb,4.4kb,2.4kb,2.0kb)；1:XC1078基因片段。[0039](三)在XC1078基因插入突变体237E11的验证[0040]对插入突变体237E11进行TAIL-PCR测序定位，发现其插在XC1078基因内。[0041]用转座子Tn5gusA5上gus侧的一条引物(TTGTAACGCGCTTTCCCACCAACGC)和上游基因XC1079的一条引物(CCCCACCCTTTCGGTTATCGG)配对进行PCR验证，产物预期大小3631bp，请参见图2，其中，1:100bp标准DNA;2:XC1078基因插入突变体237E11。[0042](四)XC1078基因插入突变体237E11后的抗渗透势检测[0043]海藻糖具有非还原性、高亲水性、高化学稳定性及不形成内在氢键的特性。由于海藻糖特殊的非还原性、高亲水性等物理特性，其在包括高渗、干燥、脱水、热击、冷冻及氧化在内的环境压力下能够保护细胞的完整性。编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因，由于基因的突变，使得6-磷酸海藻糖磷酸酶催化6-磷酸海藻糖形成海藻糖成为无源之本。[0044]将十字花科黑腐病菌致病变种Xcc野生型菌株8004，XC1078突变体菌株237E11和互补菌株C237E11(即在XC1078突变体中导入高表达的XC1078基因)过夜培养，将28°C摇床培养于NYGB培养基(每升含蛋白胨5.0g，酵母粉3.0g，甘油20.0g，PH7.0)中，调OD600^1.0，以2%的接种量转接到5ml含2%的NaCl的NYGB培养基中的28°C摇床培养，NYGB培养基培养24小时测0D_值(Xec菌株生长情况，即抗渗透势指标)。将该实验重复三次。[0045]结果表明，突变体237E11在含2%的NaCl的NYGB培养基中基本不生长，而野生型8004菌株和互补株C237E11都能生长，并且互补菌株C237E11生长与野生型8004菌株基本一致。由于编码的6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因XC1078突变体237E11不能合成海藻糖，突变体的对添加了2%的Nacl高渗势的培养基敏感，这说明XC1078与抗高渗有关，请参见图3，其中，A为野生型8004菌株；B为XC1078基因插入突变体237E11；C为XC1078基因插入突变体237E11的互补株。[0046](五)XC1078基因插入突变体237E11后的致病性检测[0047]实验所用寄主植物为萝卜苗(种名为RaphanussativusLvar.radiculusPers.)，所用的接种方法为剪叶法。将野生型8004菌株，XC1078突变体菌株237E11和互补菌株C237E11在28°C下进行液体培养，共培养15-18个小时。[0048]用NYGB稀释至OD6tltl=0.001，用灭菌剪刀在菌液中浸泡5秒钟后，在健康叶片距叶尖l-2cm垂直叶脉的方向剪到中轴处，停留5秒钟，被接种的植物在25-30°C培养一周后观察结果，正对照选用十字花科黑腐病菌8004菌株。[0049]上述致病实验表明，XC1078基因插入突变体237E11的致病性显著降低，请参见图4，而XC1078基因突变体的互补株C237E11能将降低的致病性很好的恢复到野生型8004菌株的水平。在图4中，对象A为野生型8004菌株，对象B为XC1078基因插入突变体237E11，对象C为XC1078基因插入突变体237E11的互补株。[0050]在本发明的上述方法步骤中所用到的材料包括:[0051]大肠杆菌(Escherichiacoli)株系JM109;[0052]载体pGEM_3Zf(+)，购自Promega公司；[0053]pLAFR3、pLAFRJ为本研究室保存的(参见参考文献9)柯斯质粒；[0054]限制性内切酶、修饰酶等试剂购自Promega、Stratagene>QIAGEN公司。[0055]XC1078基因序列表[0056]序列1:DNA序列[0057]GAAGGGAAGAACACCGAGGCTACCGCTTTAGCCCCTCTCCTGCGGGAGAGGGGTTGGGGTGAGGGTACGGAGCGAAGCCTTCGTGGCATTCCAACCGCACGAGGCTTTGCCCGTACCCGCATCCGCCCCTGCGGGGCACCTTCTCCCGAGGGGAGAAGGGAGAACACCGAGGCTACCGCTTTAGCCCCTCTCCTGCGGGAGAGGGGTTGGGGTGAGGGTACGGAGCGAAGCCCTCGTGGCGTTCCAACTGCACGAGGCTTTGCCCGTACCCTCATCCGCCCCTGCGGGGCACCTTCTCCCGACGGGAGAAGGGATGGCAGTCGCCGTTGCATAACCTGAATATCACATCGCTTTGCGCACACTAGCGCGATGGCAGACTTGCATTCCCCCCTTCCGTCGCCGCCATTGCTGGACGATGCCTGCGCATTGTTCCTGGACGTGGACGGCACCCTGATCGACTTTGCGCACACCCCCGAAGCAGTGCAGTTGCTGCCGGAGGTACGCGACGCAATCGCGCGCCTTAGCGAGCGCCTTGGCGGCGCCGTCGCCCTGGTCAGCGGGCGGCCGCTATCCCAACTGGACGCCCTGTTCGCACCCCTGCTGCTGCCGGCCGCCGGCCTGCACGGGCACGAGTTGCGCAGCGACGCAGCCGCACGCGCGGCAATGCCCCAAGACACCTCCGAATGGTTGCACGGCTTGCATAAACGCGCCGCTGCACTCACGCATCAACATCCTGGCGTGCTGGTCGAAGACAAAGGCGTCAGCGTCGCTCTGCATTGGCGCGCGCAACCACTTGCCGGCCCCGACGTACTCGCCTTCGCACAGCAGGAAATCGCGGCGCTGTCGGGTTACCGCCTACAGCCCGGCGATCACGTCGTTGAATTTGTTCCCGAAGGCAGCAACAAGGGCCTGGCGGTCGAGCAGCTGATGCAGCAGCCGGCATTTGCGGGCCGCACGCCGGTGTTTGTCGGCGACGACCTCACCGACGAATTCGGTTTCCAGGCGGCCAATCGCCTCGGCGGCTGGAGCGTGCTGGTCGGCGACCGCGCCCAGACCGACGCACGCTTCCGCGTGTCGGGCACCGCCGCCGTGCATGCCTGGTTGCAGCGCAGCGCGCACACCGCGTGAGCGCGTTACGCGCTCCCCATCGTTTTTCCCCCAAGACGTTACGCATTTCATGACCGAGTCTTCTCTGGATCTGGGCGTCATCGGCAATTGCAGTTTTGGT[0058]序列2:蛋白质序列[0059]MADLHSPLPSPPLLDDACALFLDVDGTLIDFAHTPEAVQLLPEVRDAIARLSERLGGAVALVSGRPLSQLDALFAPLLLPAAGLHGHELRSDAAARAAMPQDTSEWLHGLHKRAAALTHQHPGVLVEDKGVSVALHWRAQPLAGPDVLAFAQQEIAALSGYRLQP⑶HWEFVPEGSNKGLAVEQLMQQPAFAGRTPVFVGDDLTDEFGFQAANRLGGWSVLVGDRAQTDARFRVSGTAAVHAffLQRSAHTA。【权利要求】1.一种与十字花科黑腐病病菌致病相关的编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因在防治植物十字花科黑腐病病害中的用途，其特征在于，所述基因是编码序列表中序列2所示蛋白质的DNA序列。2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述编码6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因是序列表中序列I所示的DNA序列。【文档编号】C12N15/55GK103642899SQ201310265126【公开日】2014年3月19日申请日期:2013年6月28日优先权日:2013年6月28日【发明者】蒋国凤,唐纪良,姚裕群,姜伯乐,何勇强,梁晓夏,杭小红申请人:广西大学