一种检测牛fanci基因缺失的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测牛FANCI基因缺失的方法及试剂盒。本发明所提供的试剂盒中含有由引物对A和引物对B组成的引物对组，所述引物对A由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成，所述引物对B由序列表中的序列3和序列4所示的两条单链DNA组成。实验证明，利用本发明所提供的引物对组，可快速快速、准确、高效的鉴定牛短脊柱综合征（BS）遗传缺陷。本发明为BS奶牛遗传缺陷基因的分子筛查提供参考和借鉴，为在今后的育种工作中有计划地降低BS遗传缺陷基因频率提供技术支撑，为奶牛场进行科学的选种选配提供依据。
【专利说明】-种检测牛FANCI基因缺失的方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种用于检测牛FANCI基因缺失的方法及试剂 盒，特别涉及一种用于检测与牛短脊椎综合征相关的FANCI基因是否缺失的诊断试剂盒。
【背景技术】
[0002] 随着基因组学研究的深入，人们逐渐认识到几乎每一个动物都会携带一些隐性有 害基因，当它们纯合时，表现出不同类型的患病症状。在奶牛育种中，由于后裔测定、基因组 选择等现代育种技术的应用，在极大地提高了选择准确性的同时，也潜在地提高了选择强 度；同时又因为人工授精（Al)等繁殖生物技术的应用，使个别优秀种公牛得到广泛使用， 增加了群体的近交系数，降低了有效群体含量。2010年，加拿大奶牛网站（CDN)报道加拿大 荷斯坦牛平均近交系数已达到5. 87%，娟姗牛为5. 92%。在这种情况下，隐性有害基因纯合 的概率增大，遗传缺陷也随之发生，因此每隔几年就会有一种新的遗传缺陷出现在某些牛 品种中。如在荷斯坦群体中，1990年以来就相继报道了瓜氨酸血症（CN)、牛尿苷酸合酶缺 乏症（DUMPS)牛白细胞粘附缺陷症（BLAD)、牛脊柱畸形综合征（CVM)等奶牛遗传缺陷。
[0003] 2006年，牛短脊柱综合征（Brachyspina syndrome, BS)在丹麦荷斯坦牛群中被首 次报道，患病牛临床表现为胚胎早期流产、发育迟缓、四肢细长、颈椎和胸椎严重缩短、内脏 异常等综合症状，并被初步推断BS可能是新出现的一种隐性遗传缺陷。该遗传缺陷基因 的发现引起了各国奶牛育种协会和工作者的广泛关注，随后，2008年意大利、2010年德国、 2010年加拿大又相继报道了 2、1、1头BS患病死胎。对欧洲共发现的7个BS患病死胎进 行系谱分析，发现均可追溯到一头共同祖先Sweat Haven Tradition (USAM1682485)，也进 一步证明了 BS不仅存在于欧洲荷斯坦牛群体中，同样存在于北美群体中，另外考虑到BS患 病个体涉及到的主要育种家系，可以推断出BS扩散范围和影响程度很大。直到2012年，BS 遗传缺陷才被成功的定位在BTA21的FANCI基因上。
[0004] BS的分子遗传机制是牛21号染色体（BTA21)上FANCI (Fanconi anemia complementation-group I)基因上的一段3329bp的缺失突变，导致25、26、27外显子的丢 失，在877位氨基酸位点处发生了结构变化：原本C末端的451个氨基酸的肽链被仅含26个 氨基酸的残肽所取代。目前，BS致病基因可以追溯到一头著名的美国种公牛Sweet Haven Tradition (USAM1682485)，出生于 1974 年，但主要通过其两个儿子 Bis-May Tradition Cleitus (USAM1879085)和 Rothrock Tradition Leadman (USAM1983348)进行了扩散。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于检测牛短脊椎综合征的引物对组。
[0006] 本发明所提供的用于检测牛短脊椎综合征的引物对组，具体由引物对A和引物对 B组成，所述引物对A由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成，所述引物对B 由序列表中的序列3和序列4所示的两条单链DNA组成。
[0007] 在本发明中，所述检测牛短脊椎综合征具体为：检测待测牛的基因组中FANCI基 因 （GenBank :AC_000178. 1 的第 9701-74362 位，具体网址如下：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/AC_000178. l?report=genbank&from=21124257&to=21208316)是否存在 3329bp的大片段缺失。若采用所述引物对A扩增所得产物的核苷酸序列如序列表中序列6 所示，则所述待测牛的基因组中FANCI基因存在3329bp的大片段缺失，这说明所述待测牛 为牛短脊椎综合征隐性携带者或牛短脊椎综合征纯合子。牛短脊椎综合征纯合子在胚胎早 期多数致死，在牛群中很少出现，而且BS纯合子表型存在畸形，不需任何检测手段即可进 行识别。本发明的目的就是筛查牛群中短脊椎综合征隐性携带者。
[0008] 所述引物对组中的四条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔比为1 :1 :1 :1。
[0009] 在本发明的一个实施例中，所述引物对组中的每条单链DNA在多重PCR反应体系 中的终浓度均为240pM。
[0010] 其中，序列1由25个核苷酸组成；序列2由27个核苷酸组成；序列3为20个核苷 酸组成；序列4由20个核苷酸组成；序列5由3738个核苷酸组成；序列6由409个核苷酸 组成。
[0011] 含有所述引物对组的试剂盒也属于本发明的保护范围。
[0012] 本发明的再一个目的是提供一种制备所述引物对组的方法。
[0013] 本发明所提供的制备所述引物对组的方法，具体包括将所述引物对组中的四条单 链DNA分别单独包装的步骤。
[0014] 本发明的还一个目的是提供一种制备所述试剂盒的方法。
[0015] 本发明所提供的制备所述试剂盒的方法，具体包括如下步骤：将所述引物对组中 的四条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应 缓冲液、DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶，具体如TaKaRa生物工程(大连）有限公司生产的 TaKaRa Taq聚合酶，其货号为：R001B)和4种dNTP。
[0016] 所述引物对组，或所述试剂盒在制备检测待测牛的基因组中FANCI基因是否缺失 的产品中应用也属于本发明的保护范围。
[0017] 本发明的另一个目的是提供一种检测待测牛的基因组中FANCI基因是否缺失的 方法。
[0018] 本发明所提供的检测待测牛的基因组中FANCI基因是否缺失的方法，具体可包括 如下步骤：
[0019] (al)以待测牛的基因组DNA为模板，以所述的引物对组进行多重PCR扩增，获得 PCR产物；
[0020] (a2)检测步骤（al)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测牛的基因组 中FANCI基因是否缺失：在PCR产物中含有大小为269bp的DNA片段(说明PCR反应本身没 有问题，结果可信)的前提下，若所述PCR产物中含有大小为409bp的DNA片段，则所述待测 牛的基因组中FANCI基因存在缺失，表明所述待测牛为牛短脊椎综合征隐性携带者或牛短 脊椎综合征纯合子；若所述PCR产物中不含有大小为409bp的DNA片段，则所述待测牛的基 因组中FANCI基因中不存在缺失，表明所述待测牛为正常个体，并非牛短脊椎综合征隐性 携带者或牛短脊椎综合征纯合子。
[0021] 在实际应用中，判断PCR产物中是否含有目的DNA片段时，可通过将PCR产物进行 琼脂糖凝胶电泳，看电泳图谱上是否含有目的条带：电泳图谱上含有目的条带，则PCR产物 中含有目的DNA片段；反之，则PCR产物中不含有目的DNA片段。
[0022] 在上述应用或方法中，所述缺失具体为缺失所述FANCI基因中序列5的第 231-3559 位。
[0023] 进一步，所述大小为409bp的DNA片段具体为序列表中序列6所不的DNA片段；所 述大小为269bp的DNA片段具体为序列表中序列7所示的DNA片段。
[0024] 在上述方法中，以所述引物对组进行多重PCR扩增的退火温度具体为60°C。
[0025] 更加具体的，所述多重PCR的反应条件是：94°C预变性5min ;94°C变性30s，60°C 退火45s，72°C延伸45s，进行35个循环；72°C延伸IOmin。
[0026] 在本发明中，以上所有的所述待测牛均为奶牛，具体为荷斯坦牛，更加具体如北京 地区的荷斯坦公牛和荷斯坦母牛。
[0027] 实验证明，利用本发明所提供的引物对组，采用价格低廉的普通DNA聚合酶(如 Taq DNA聚合酶）即可快速、准确、高效的鉴定牛短脊柱综合征（BS)遗传缺陷。本发明为BS 奶牛遗传缺陷基因的分子筛查提供参考和借鉴，为在今后的育种工作中有计划地降低BS 遗传缺陷基因频率提供技术支撑，为奶牛场进行科学的选种选配提供依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1为利用实施例1制备的试剂盒，通过多重PCR扩增，检测牛FANCI基因是否缺 失的琼脂糖凝胶电泳图谱。其中，泳道M为pBR322DNA/MSPI ladder Marker ;泳道1、3、4和 5为正常牛(非BS遗传缺陷牛）；泳道2为BS遗传缺陷携带者。
[0029] 图2为基于LA-Taq聚合酶的BY-F/BY-R引物（即文中所述的引物对A)单重PCR 检测牛FANCI基因是否缺失的琼脂糖凝胶电泳图谱。其中，泳道Ml为pBR322DNA/Mspl ;泳 道M2为Ikb DNA Ladder ;泳道AA为正常牛（非BS遗传缺陷牛）;泳道AB为BS遗传缺陷携 带者。
【具体实施方式】
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 实施例1、用于检测牛短脊椎综合征的试剂盒的制备
[0033] 本实施例中所提供的用于检测牛短脊椎综合征的试剂盒，为多重PCR检测试剂 盒，含有用于检测牛FANCI基因缺失的引物对A和内参引物对B、PCR反应缓冲液、Taq DNA 聚合酶，以及4种dNTP。其中，用于检测牛FANCI基因的引物对组具体如下：
[0034] 1、BY-F/BY-R 引物
[0035] 依据 GenBank上牛的 FANCI 基因序列（GenBank :AC_000178. 1 的第 9701-74362 位， GenBank :AC_000178. 1 的具体网址参见如下：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/AC _000178.1?r印ort=genbank&from=21124257&to=21208316)，并参考 Carole et al (2012) 针对FANCI基因设计的引物序列，确定了检测BS遗传缺陷牛的特异性引物BY :
[0036] 上游引物 BY-F (序列 1):5' -GCTCAAGTAGTTAGTTGCTCCACTG-3'（序列 5 的第 1-25 位）；
[0037] 下游引物 BY-R (序列 2) :5' -ATAAATAAATAAAGCAGGATGCTGAAA-3'（序列 5 的第 3712-3738位的反向互补序列）。
[0038] 当待测牛为健康牛（非BS遗传缺陷牛）时，采用用如上引物对进行PCR扩增，理论 上目标产物为3738bp (序列5)，但由于目标产物过大，采用普通DNA聚合酶(如Taq DNA聚 合酶）进行PCR扩增，不能实现扩增，即无扩增产物。当待测牛为BS携带者时，采用如上引 物对进行PCR扩增，会得到大小为409bp的目的DNA片段(序列6)。
[0039] 2、mtATP-F/mtATP-R 引物
[0040] 依据牛的线粒体基因序列（NO :HQ184035. 1)，设计了内标上下游引物：
[0041] 上游引物 mtATP-F (序列 3) :5' -TAAGTTAGAGATTGAGAGCC-3'（序列 7 的第 1-20 位）；
[0042] 下游引物 mtATP-R (序列 4):5'-GATAAGGGTTACGAGAGGGA-3'（序列 7 的第 250-269 位的反向互补序列）。
[0043] 以待测牛的基因组DNA为模板，采用以上引物对进行PCR扩增，其扩增片段长度为 269bp，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。
[0044] 实施例2、用实施例1制备的试剂盒检测牛短脊椎综合征
[0045] 一、实施例1制备的试剂盒的多重PCR反应体系和反应程序的优化
[0046] 1、牛总DNA的提取
[0047] 选择北京市种公牛站的荷斯坦公牛(包括潜在BS遗传缺陷携带者，即通过美国荷 斯坦协会网站进行系谱查证的BS携带者的后代）为实验材料，从新鲜离体血液中提取总 DNA，用作PCR扩增模板。当然总DNA不仅可以从血液(例如，新鲜或冷冻的)中提取，也可以 从精液(例如，新鲜或冷冻的)、组织样品（如耳组织等）或含有毛囊的牛毛样品中提取、分离 和纯化。
[0048] 2、BY-F/BY-R 引物单重 PCR 扩增
[0049] 本发明的发明人采用实施例1制备的试剂盒进行BY-F/BY-R引物单重PCR(TaqDNA 聚合酶)，并对反应程序进行了优化。
[0050] 反应体系（25μ l):dNTP 混合物（4X2. 5mmol/L)2. 0μ I ;10X 扩增缓冲液(含 Mg2+) 2·5μ1;上游引物 BY-F (20pmol/L)0.3yl;下游引物 BY-R (20pmol/L)0.3yl;Taq DNA 聚合酶（3υ/μ 1) 0· 5μ 1 ;模板 DNA (30ng/y I) L 0μ I ;ddH20补足至 25μ 1。
[0051] 反应程序：94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，55±l(TC退火 30s，72°C延伸 30s，进 行35个循环；72°C延伸7min，然后4°C保存。
[0052] 结果显示：采用实施例1制备的试剂盒进行BY-F/BY-R引物单重PCIUTaq DNA聚 合酶）的退火温度以58°C为宜。
[0053] 3、mtATP-F/mtATP-R 引物引物单重 PCR 扩增
[0054] 本发明的发明人采用实施例1制备的试剂盒进行mtATP-F/mtATP-R引物单重PCR (Taq DNA聚合酶)，并对反应程序进行了优化。
[0055] 反应体系（25μ l):dNTP 混合物（4X2. 5mmol/L)2. 0μ I ;10X 扩增缓冲液(含 Mg2+) 2·5μ1;上游引物 BY-F (20pmol/L)0.3yl;下游引物 BY-R (20pmol/L)0.3yl;Taq DNA 聚合酶（3υ/μ 1) 0· 5μ 1 ;模板 DNA (30ng/y I) L 0μ I ;ddH20补足至 25μ 1。
[0056] 反应程序：94°C预变性5min ;94°C变性30s，55±8°C退火30s，72°C延伸30s，进行 35个循环；72°C延伸7min，然后4°C保存。
[0057] 结果显示：采用实施例1制备的试剂盒进行mtATP-F/mtATP-R引物单重PCR (Taq DNA聚合酶）的退火温度以56°C为宜。
[0058] 4、多重PCR扩增条件优化
[0059] 本发明的发明人采用实施例1制备的试剂盒进行引物对组的多重PCR (Taq DNA 聚合酶)，并对反应体系和反应程序进行了优化，最终确定如下反应体系和反应程序：
[0060] 多重 PCR 反应体系（25μ I) :dNTP 混合物（4X2. 5mmol/L) 2· 0μ I ;10X 扩增缓冲 液（含 Mg2+) 2· 5 μ I ;引物 BY-F (20pmol/L) 0· 3 μ I ;引物 BY-R (20pmol/L) 0· 3 μ I ;引物 mtATP-F (20pmol/L)0.3yl;引物 mtATPR (20pmol/L)0.3yl;Taq DNA 聚合酶（3U/yl) 〇· 5μ I ;模板DNA (30ng/y I) L Ομ I ;ddH20 补足至 25μ 1。
[0061] 多重PCR反应条件为：94°C预变性5min ;94°C变性30s，60°C退火45s，72°C延伸 45s，进行35个循环；72°C延伸lOmin，然后4°C保存。
[0062] 二、实施例1制备的试剂盒的多重PCR反应扩增结果判定
[0063] 实施例1制备的多重PCR检测试剂盒中，mtATP-F/mtATP-R引物作为内标引物， 对PCR反应本身起到质控作用，当扩增得到大小为269bp (序列7)的DNA片段时，实验结 果可信。因此，对采用实施例1制备的试剂盒进行引物对组的多重PCR (Taq DNA聚合酶)， 结果判定标准如下：若PCR扩增得到大小为409bp的DNA片段(序列6)和269bp (序列7) 的DNA片段，则待测牛为BS遗传缺陷基因携带者，（即基因组中FANCI基因缺失序列5的第 231-3559位）；若扩增没有得到大小为409bp的DNA片段(序列6)，但存在269bp (序列7) 的DNA片段时，则待测牛为正常牛（即基因组中FANCI基因不缺失)。
[0064] 简言之，待测牛基因型判定如下：
[0065] 健康牛(非BS遗传缺陷牛）：基因型为AA型，仅出现269bp内标电泳带；
[0066] BS隐性携带者：基因型为AB型，即出现269bp内标带和409bp电泳带。
[0067] BS纯合子在胚胎早期多数致死，在牛群中很少出现，本发明筛查隐性遗传缺陷基 因 BS的目的就是找出BS隐性携带者。
[0068] 三、用实施例1制备的试剂盒检测牛短脊椎综合征的实际应用
[0069] 待测牛：北京地区的206头荷斯坦公牛和136头荷斯坦母牛。
[0070] 1、实施例1制备的试剂盒的多重PCR检测
[0071] 提取待测牛的基因组DNA，以其为模板，利用实施例1制备的试剂盒，按照步骤一 4 的优化后反应体系（DNA聚合酶为TaKaRa生物工程(大连)有限公司生产的TaKaRaTaq聚合 酶，是一种普通Taq酶，其货号为：R001B)和反应程序进行多重PCR扩增。反应结束后，取 5μ I PCR产物用2%琼脂糖电泳检测，并按照步骤二所述标准对结果进行判定。
[0072] 结果显示：有10头公牛和3头母牛经多重PCR扩增同时得到大小为269bp和 409bp的两个目的条带，判定这13头牛为BS隐性携带者，计算公牛和母牛的BS携带率分别 为4. 85%、2. 21%。部分待测牛的PCR扩增结果如图1所示。对所得到的269bp和409bp的 目的条带分别进行序列测定，结果409bp的目的条带的核苷酸序列正如序列6所示，269bp 的目的条带的核苷酸序列正如序列7所示。
[0073] 2、系谱验证
[0074] 通过系谱追踪发现，经步骤1鉴定为BS隐性携带者的10头公牛的共同祖先是 Sweet Haven Tradition (USAM1682485)(及其儿子 Cleitus (USA1879085)，与国际上报道 的共同祖先一致，更加证实了所建立方法的准确性。
[0075] 3、基于LA-Taq聚合酶的BY-F/BY-R引物单重PCR检测
[0076] 为了进一步证实本发明所提供的多重PCR检测方法的准确可靠，本发明的发明人 又同时对作为待测牛的206头荷斯坦公牛和136头荷斯坦母牛进行了基于LA-Taq聚合酶 的BY-F/BY-R引物单重PCR检测。其中，LA-Taq聚合酶购自TaKaRa生物工程(大连）有限 公司，货号为：RR02MA，为一种扩增长片段的DNA聚合酶，采用该DNA聚合酶进行PCR扩增， 若待测牛为健康牛（非BS遗传缺陷牛）可扩增得到与理论大小相符的3738bp的目的条带 (序列5的第1-3738位)，若待测牛为BS隐性携带者则扩增得到409bp目的条带(序列6)。
[0077] 反应体系（25μ I) :dNTP 混合物（4X2.5mmol/L)4.0y I ;10XLA PCR 缓冲液(含 Mg2+)2. 5μ 1 ;上游引物 BY-F(20pmol/L)0. 5μ 1 ;下游引物 BY-R(20pmol/L)0. 5μ I ;LA-Taq 0嫩聚合酶（5"4 1)0.3以1;模板0嫩（30叩/^1)1.(^1;(1(1!120补足至25 4 1。
[0078] 反应程序：94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，58°C退火 lmin，72°C延伸 2. 5min，进 行35个循环；72°C延伸lOmin，然后4°C保存。
[0079] 结果显示：经步骤1鉴定为BS隐性携带者的10头公牛和3头母牛经以上单重PCR 扩增均得到了大小为409bp的目的条带，而其余牛则仅得到大小为3738bp的目的条带。部 分待测牛的PCR扩增结果如图2所示。
[0080] 综合以上1-3中三方面的结果，可见本发明利用实施例1制备的试剂盒采用多重 PCR检测待测牛是否为BS遗传缺陷携带者，其实验结果可靠，且不必依赖于特殊的DNA聚合 酶--TaKaRa LA-Taq聚合酶。另外，本发明对我国荷斯坦牛进行了 BS遗传缺陷基因的分 子诊断，并证实BS遗传缺陷在我国荷斯坦牛群中存在一定比例，因此有必要对我国荷斯坦 牛群进行大规模的筛查，标识或淘汰BS遗传缺陷基因携带者，降低BS新遗传缺陷带来的潜 在危害。
【权利要求】
1. 用于检测牛短脊椎综合征的引物对组，由引物对A和引物对B组成，所述引物对A由 序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成，所述引物对B由序列表中的序列3和 序列4所示的两条单链DNA组成。
2. 根据权利要求1所述的引物对组，其特征在于：所述引物对组中的四条单链DNA在 PCR反应体系中的摩尔比为1 :1 :1 :1。
3. 含有权利要求1或2所述引物对组的试剂盒。
4. 制备权利要求1或2所述引物对组的方法，包括将所述引物对组中的四条单链DNA 分别单独包装的步骤。
5. 权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：将所述引物对组中的四条单链 DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA 聚合酶和4种dNTP。
6. 权利要求1或2所述引物对组，或权利要求3所述试剂盒在检测待测牛的基因组中 FANCI基因是否缺失的产品中应用。
7. -种检测待测牛的基因组中FANCI基因是否缺失的方法，包括如下步骤： (al)以待测牛的基因组DNA为模板，以权利要求1-3任一中所述的引物对组进行PCR 扩增，获得PCR产物； (a2)检测步骤（al)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测牛的基因组中 FANCI基因是否缺失：在PCR产物中含有大小为269bp的DNA片段的前提下，若所述PCR产 物中同时含有大小为409bp的DNA片段，则所述待测牛的基因组中FANCI基因存在缺失，若 所述PCR产物中不含有大小为409bp的DNA片段，则所述待测牛的基因组中FANCI基因不 存在缺失。
8. 根据权利要求6所述的应用或权利要求7所述的方法，其特征在于：所述缺失为缺 失所述FANCI基因中序列5的第231-3559位。
9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述大小为409bp的DNA片段为序 列表中序列6所示的DNA片段；所述大小为269bp的DNA片段为序列表中序列7所示的DNA 片段。
10. 根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：以所述引物对组进行PCR扩增 的退火温度为60°C。
【文档编号】C12Q1/68GK104419752SQ201310381613
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月28日 优先权日:2013年8月28日
【发明者】李艳华, 朱玉林, 乔绿, 张胜利, 房灵昭, 刘林, 杜欣悦, 王海浪, 薛建华, 吕小青, 吴瑞杰, 刘振君 申请人:北京奶牛中心