定点突变获得的谷氨酸脱羧酶突变体基因及其编码蛋白质和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶突变体，酶活性中心附近的酸性氨基酸谷氨酸突变为中性氨基酸，其DNA序列分别为SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2，该突变体蛋白的氨基酸序列分别为SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4。本发明利用DNA定点突变技术，对野生型谷氨酸脱羧酶GadB1编码基因进行分子改造，得到了两种突变体酶GadB1E312S和GadB1E91Q，相对野生酶其有效pH作用范围得到一定的扩展，尤其在偏中性pH条件下仍具有较好的活性。随着有效pH作用范围的拓宽，突变酶在pH5.5～6.5条件下，仍然具有较高的催化活性，因此解决了谷氨酸脱羧酶催化GABA生物合成时，在pH5.5～6.5时，催化能力低的问题，为利用该酶及其编码基因来生物合成GABA创造好的条件。
【专利说明】定点突变获得的谷氨酸脱羧酶突变体基因及其编码蛋白质和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及两种谷氨酸脱羧酶突变体基因及其应用，属于分子生物学的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]定点突变(site-directed mutagenesis)属于理性设计,是指在目的DNA片段的指定位点引入特定的碱基对，从而改变其编码的氨基酸序列的技术(图2)。它是研究蛋白质结构与功能之间的复杂关系的强有力的工具，也是实验室常用的基因改造的手段。对某个已知的基因的特定喊基进行定点改造、缺失、或者插入，可以改变对应氣基酸序列和蛋白质的结构和功能特征，有助于了解蛋白质结构和功能的关系。
[0003]谷氛酸脱竣酶(glutamatedecarboxylase,简称 GAD ；EC4.1.1.15)以 PLP 作为辅酶，催化谷氨酸发生不可逆的α-脱酸反应，过程中消耗一个质子，生成Υ-氨基丁酸(Y-aminbutyric，简称GABA)。GAD广泛存在于动物、植物、微生物中，但是在它们的机体里面的功能各不相同。其中在动物中主要是产生GABA，一种中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，因此具有重要的生理功能；在植物中，GAD系统可以抵抗多种压力，如骤然高温、缺氧、钙离子骤增等；在微生物中，特别是一些肠道细菌，如大肠杆菌、乳酸菌等，主要与机体耐酸机制有关，它们的最适PH—般在4~5，在此范围之外酶活力会大幅降低，尤其是当pH大于6时基本失去活性，这使得利用该酶生物合成GABA受到体系pH值的严重限制，因此需要拓宽GAD酶的pH作用范围，使其在偏中性条件下，仍具有较好的活性，解决谷氨酸脱羧酶催化GABA生物合成时，在pH5.5~6.`5时，催化能力低的问题，为利用该酶及其编码基因来生物合成GABA创造好的条件。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种谷氨酸脱羧酶突变体，其酶活性中心附近的酸性氨基酸谷氨酸突变为中性氨基酸。
[0005]所述谷氨酸脱羧酶突变体为第312位谷氨酸突变为丝氨酸，核苷酸序列如SEQ IDN0.1，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2。
[0006]所述谷氨酸脱羧酶突变体为第91位谷氨酸突变为谷氨酰胺，其核苷酸序列如SEQID N0.3，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4。
[0007]本发明还提供了一种获得所述谷氨酸脱羧酶突变体的方法，其特征在于:在中国专利CN201110020606.8中公布的gadBl基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点分别为第312位的谷氨酸和第91位的谷氨酸。
[0008]上述任一突变体基因及其所编码的酶在生物合成GABA的应用均属于本发明要求保护的范围。
[0009]本发明还提供一种生产上述谷氨酸脱羧酶突变体的方法，将SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列以pET28a或能表达该酶的质粒为表达载体，以大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现突变体基因gadBIe312s 和 gadBIe91q 的高效表达。
[0010]本发明中表达单元的启动子为常用的T7启动子，在T7启动子的作用下，突变体酶可以直接在宿主细胞E.coli BL2KDE3)中，完成胞内的可溶性表达。
[0011]本发明所用的谷氨酸脱羧酶的基因gadBl来自产Y-氨基丁酸的短乳杆菌，该菌株已于2010年12月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉、武汉大学，保藏编号:CCTCC NO:M2010367，分类学命名短乳杆菌 Lb85 (Lactobacillus brevis Lb85),gadBl的测序结果在中国专利CN201110020606.8中已经公布，序列见SEQ ID N0.5。
[0012]本发明提供的突变体酶在偏中性条件下，酶活有明显的提高，解决了野生型的谷氨酸脱羧酶在偏中性PH条件下催化活性低的问题，为利用该酶催化GABA生物合成创造好的条件。
[0013]本发明通过比较野生酶GadBl和突变酶GadBlE312S、GadBIe91q的有效作用pH范围和体外的催化能力，结果发现在PH6.5下，突变体酶GadBlE91Q将L-谷氨酸转变成GABA的转化率为野生型的5.7倍；突变体酶GadBlE312S将L-谷氨酸转变成GABA的转化率为野生型的
3.6 倍。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为重组质粒pET28a(+)-gadBl的构建图谱: [0015]图2为定点突变的原理示意图:
[0016]图3为野生型和突变型酶纯化后的SDS-PAGE图谱:
[0017]图4为野生和突变酶的最适pH变化图:
【具体实施方式】
[0018]以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。材料和试剂:
[0019]所用的限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR试剂等均购于TaKaRa宝生物公司；质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、琼脂糖纯化试剂盒、大肠杆菌JM109、BL21(DE3)菌株购于天跟生物公司；引物购于上海捷锐公司；SDS-PAGE试剂盒购于碧云天生物公司；其他试剂均为国内或者国外购买的分析纯试剂。
[0020]实施例一:重组质粒的构建
[0021]将L.brevis Lb85培养至指数生长中期,取3mL菌液12000rpm离心Imin弃上清，溶菌酶处理0.5h，然后按照试剂盒说明提取基因组DNA。
[0022]设计如下的引物来用于gadBl的扩增:
[0023]gadB1-F:5’ -GACCGCTCATATGGCTATGTTGTATGGAAAAC-3>
[0024]gadB1-R: 5，~CGTGAATTCTTAGTGCGTGAACCCGTATT~3，
[0025]其中上游引物酶切位点为NdeI CgadBl-F中下划线部分)，下游引物酶切位点为EcoRI (gadBl-R中下划线部分)。
[0026]PCR扩增条件:94°C变性 5min，34个循环(95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s)，最后 72°C延伸IOrnin0
[0027]扩增产物纯化后，用NdeI和EcoRI对PCR产物和载体pET28a进行双酶切，两者的回收产物，用T4连接酶22°C下连接4h，化学转化到JM109细胞中，待平板上长出转化子之后，挑取转化子液体培养，提取质粒，通过酶切和PCR验证获得重组质粒pET28a-gadBl (图1)，然后将重组质粒转到BL21 (DE3)细胞，得到BL21 (DE3)/pET28a-gadBl工程菌。
[0028]实施例二:定点突变
[0029]定点突变原理:点突变质粒的构建采用Dpn I法(图2)。根据待突变的氨基酸位点来设计PCR点突变引物，以pET-28a-gadBl质粒为模板，以设计的相关的正向引物及其互补引物(反向引物)，通过PCR扩增出产物。
[0030]E91Q-正向引物:CGCCATCGATAAATCCCAGTATCCTCGGACCGCT[0031 ] E9IQ-反向引物:GCGGTAGCTATTTAGGGTCA TAGGAGCCTGGCGA
[0032]E312S-正向引物:AGCTACTTGGGTGGTAGTCTACCTACGATGGCC
[0033]E312S-反向引物:GGCCATCGTAGGTAGACTACCACCCAAGTAGCT ；
[0034]其中下划线部分分别代表突变体基因编码的91位谷氨酰胺和312位丝氨酸所对应的密码子。PCR扩增体系为:质粒DNA0.5 μ L，5XPrimer star Buffer5 μ L，引物各
0.5 μ L，dNTP2 μ L, Primer star0.25 μ L, ddH20 补至 25 μ L, PCR 扩增条件 95°C变性 lmin,循环 18 次(95°C 40s, 500C 15s,68°C 6min30s), 72°C IOmin0
[0035]PCR产物用Dpn I酶在37°C处理3h，去除模板DNA，消化产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，得到相关突变株的转化子，提取质粒，经过EcoRI单酶切和突变基因PCR扩增、测序，得到正确突变株，将构建成功的重组质粒转入大肠杆菌BL21 (DE3)，得到待表达的突变株。
[0036]实施例三:野生酶和突变酶的表达纯化
[0037]表达:BL21(DE3)/pET28a-gadBl、BL21 (DE3)/pET28a_gadBlE91Q、BL21 (DE3) /pET28a-gadBIe312s接种于含有30mg/L卡拉霉素的LB液体培养基中，37°C、200rpm培养至OD600至3.0~5.0，将其转接种到含有30mg/L卡拉霉素的装液量为500mL LB液体培养基的2L三角瓶中，控制初始OD6tltl为0.02，在37°C、200rpm下培养至OD6tltl在0.7~0.9范围内，加入ImM IPTG进行诱导，然后28°C、200rpm诱导表达培养8h。
[0038]提取:菌液在AOOOrpnufC的条件下,离心20min,弃上清液；然后加入40mL、pH8.0裂解缓冲液吹打混匀菌体，之后在4000rpm、4°C离心20min，倒掉上清液，重复2次。称量菌体的湿重，加入菌体湿重10倍体积的裂解缓冲液，超声破碎15min，向破碎液中加入l%Triton X-100 (把膜上的目的蛋白分离下来)和ImM PMSF (防止目的蛋白分解)，在冰上放置Ih后，在4°C、12000rpm离心60min，收集上清即为粗酶液，最后用孔径0.22 μ m水系膜过滤，即得Ni柱上样样品。
[0039]纯化:采用N1-NTA亲和层析柱对上一步所得的样品进行分离纯化。经过上样、漂洗和洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱液，SDS-PAGE分析(图3)，然后通过透析除去小分子即得到纯酶。测定纯酶的浓度。
[0040]所涉及缓冲液配制:
[0041]裂解缓冲液:50mM NaH2PO4.2H20, 300mM NaCl，ImM PMSF (溶解在无水乙醇中配成200mM的母液在-20°C中保存)，IOmM咪唑，用NaOH调至pH8.0。[0042]漂洗缓冲液:50mMNaH2PO4.2H20, 300mM NaCl，ImM PMSF, 20mM 咪唑，用 NaOH 调至ρΗ8.00
[0043]洗脱缓冲液:50mMNaH2PO4.2Η20，300mM NaCl，ImM PMSF, 250mM 咪唑，用 NaOH调至ρΗ8.00
[0044]透析缓冲液:0.02M、pH4.6的HAC-NaAC缓冲液。
[0045]实施例四:野生酶和突变酶的最适pH测定
[0046]将上一步得到的纯酶液稀释至浓度为2.5mg/mL，然后分别进行酶促反应。酶促反应总体积为500 μ L，取490 μ L0.2Μ的不同pH(3.0~7.0)的缓冲液，其中含有0.01mM PLP、IOOmM L-谷氨酸钠，加入10 μ L酶液，在反应之前分别把缓冲液和酶液在40°C下预热5min，然后混匀，在40°C下反应30min，最后迅速煮沸终止反应，离心，用5%三氯乙酸(TCA)稀释5倍，在4°C冰箱沉淀蛋白3h左右，然后用HPLC检测。
[0047]得到的结果如附图4:相关的突变酶与野生酶相比，有效pH作用范围拓宽；因此能够更好的运用突变体酶，在PH5.5~6.5的条件下，催化GABA的生物合成。
[0048]实施例五:野生酶和突变酶体外的催化能力比较
[0049]为了测定突变体酶在偏中性条件下的生物催化能力，将纯化的野生型酶和突变体酶分别在PH6.5下催化L-谷氨酸钠发生脱羧反应2h，结果发现在pH6.5下，突变酶GadBlE91Q将L-谷氨酸转变成GABA的转化率为野生酶GadBl的5.7倍；突变酶GadBlE312S将L-谷氨酸转变成GABA的转化率为野生酶G`adBl的3.6倍。
【权利要求】
1.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于酶活性中心附近的酸性氨基酸谷氨酸突变为中性氨基酸。
2.权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于:核苷酸序列如SEQID N0.1。
3.权利要求1或2所述的谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于:第312位谷氨酸突变为丝氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2。
4.权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶突变体其特征在于:其核苷酸序列如SEQID N0.3。
5.权利要求1或4所述的谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于--第91位谷氨酸突变为谷氨酰胺，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4。
6.获得权利要求3或5所述谷氨酸脱羧酶突变体的方法，其特征在于:在中国专利CN201110020606.8中公布的gadBl基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点分别为第312位的谷氨酸和第91位的谷氨酸。
7.权利要求1，2，4任一所述突变体基因及其所编码的酶在生物合成GABA的应用。
8.—种生产权利要求3或5所述谷氨酸脱羧酶突变体的方法，其特征是将SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列以pET28a或能表达该酶的质粒为表达载体，以大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现突变体基因gadBIe312s和gadBl酬的高`效表达。
【文档编号】C12P13/00GK103484444SQ201310438163
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】史锋, 谢一龙, 李永富, 王小元 申请人:江南大学