一种壮观链霉菌发酵生产大观霉素的培养基及发酵方法
【专利摘要】本发明涉及一种壮观链霉菌发酵生产大观霉素的培养基及发酵方法，其一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有玉米油、麦芽糖、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。本发明通过采用麦芽糖替代葡萄糖；啤酒酵母干渣和蚯蚓粉代替鱼粉、蛋白胨、黄豆饼粉和玉米浆，优化其培养基配方，从而解决了原辅料的成本问题，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现大观霉素稳定、高效的生产。同时利用该培养基可提高发酵单位、缩短发酵周期。
【专利说明】一种壮观链霉菌发酵生产大观霉素的培养基及发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物发酵【技术领域】，特别是涉及一种壮观链霉菌发酵生产大观霉素的培养基及发酵方法。
【背景技术】
[0002]大观霉素是由壮观链霉菌经有氧发酵后生成的次级代谢产物，具有杀菌谱广，无过敏现象，副作用小，安全性好等特点。它不仅是治疗淋病的首选药物，也可用于动物治疗，并能促进动物生长，是良好的动物饲料添加剂。
[0003]目前，国内大观霉素的生产方法主要是发酵法，即采用壮观链霉菌作为菌种，培养基中的碳源主要是淀粉、葡萄糖；有机氮源主要是玉米浆、酵母粉、黄豆饼粉和蛋白胨。以上述常规原辅料发酵生产大观霉素存在的主要问题：
[0004]I大观霉素种子、发酵培养基中有机氮源的组成成分至少在3种以上，增加了企业的采购成本。
[0005]2 一级种子接种量较多。常规的一级种子培养的接种量为5~10L/M3，增加了菌种研究人员的工作强度。
[0006]3常规配方的大观霉素的种子培养周期较长，两次种子培养的周期超过了 50h。
[0007]4生产大观霉素的培养基中含有鱼粉，其质量影响发酵液质量和发酵效果。目前，国内生产的鱼粉都是混合鱼粉，鱼粉中含有动物骨粉、羽毛粉等，影响了发酵液的质量和发酵效果。采用配方鱼粉，发酵液颜色较深，其发酵单位一般为4000~5000u/ml，发酵单位较低。另外，购买纯鱼粉的价格较高 ，而且容易受到休渔期的影响，增加采购成本和生产成本。
[0008]5常规培养基在灭菌过程中，部分葡萄糖在高温状态容易碳化，使种子液和发酵液的颜色变深，降低培养基中的总糖含量，影响种子培养和发酵培养的效果。
[0009]6采用常规的种子和发酵培养基，其发酵单位一般在5000~7000u/ml，发酵单位不闻。
【发明内容】
[0010]本发明目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效提高发酵单位，缩短发酵周期，同时最大限度的降低原辅料用量，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现大观霉素稳定、高效地生产的壮观链霉菌发酵生产大观霉素的培养基。
[0011]本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产大观霉素的发酵方法。
[0012]为实现上述目的所采取的技术方案为：
[0013]一种壮观链霉菌发酵生产大观霉素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有玉米油、麦芽糖、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。
[0014]所述一级种子培养基组成为：玉米油18~20ml/L、麦芽糖3~5g/L、啤酒酵母干渣12~14g/L、蚯蚓粉17~19g/L、硫酸铵0.03~0.05g/L、麦芽糖酶0.04~0.06g/L、聚醚消泡剂0.01~0.03g/L。
[0015]所述二级种子培养基组成为：玉米油20~22ml/L、麦芽糖5~7g/L、啤酒酵母干渣17~19g/L、蚯蚓粉18~20g/L、硫酸铵0.04~0.06g/L、麦芽糖酶0.05~0.07g/L、聚醚消泡剂0.01~0.03g/L。
[0016] 所述发酵培养基组成为：玉米油23~25ml/L、麦芽糖21~23g/L、啤酒酵母干渣22~24g/L、蚯蚓粉21~23g/L、硫酸铵0.07~0.08g/L、磷酸二氢钾0.02~0.04g/L、氯化钾0.02~0.04g/L、轻质碳酸钙O. 3~O. 5g/L、巴比妥O. 6~O. 8g/L、麦芽糖酶0.07~
O.09g/L、聚醚消泡剂 0.01 ~0.03g/L。
[0017]所述啤酒酵母干渣的质量要求为：
[0018]蛋白质含量≥45% ;磷含量≥60ug/ml ;水分≥5% ;灰分≥5% ;碳水化合物≥12% ；干渣颗粒通过60目筛的数量>80%。
[0019]所述蚯蚓粉质量要求为：
[0020]蛋白质含量≥60% ;水分≥10% ;粒度以能通过80目筛为准。
[0021]壮观链霉菌利用上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基发酵生产壮观霉素的发酵方法，其特征在于其工艺步骤为：首先将壮观链霉菌母瓶发酵液按照I~2L/m3的接种量接入到一级种子培养基中进行一级种子培养，至菌体浓度40~45%、?!1值> 7、培养周期为18~21h时转入到二级种子培养基进行二级种子培养，至菌体浓度40~45%、?!1值> 7、培养周期为18~20h时再转入发酵培养基中进行发酵培养，至菌体浓度30~35%,发酵单位超过8000u/ml且每6~8h检测的发酵单位相差在300u/ml以内，发酵周期为90~100h, pH值5. 8~7,氨基氮5~10mg/100ml,总糖为O~10g/100ml时终止发酵。
[0022]所述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基在使用前进行灭菌，其中
[0023] 灭菌后的一级种子培养基的质量要求为：氨基氮：40~50mg/100ml、溶磷：>80ug/ml、总糖：30 ~40g/100ml、pH :7 ~8 ;
[0024]灭菌后的二级种子培养基的质量要求为：氨基氮：50~60mg/100ml、溶磷：>80ug/ml、总糖：30 ~40g/100ml、pH :7 ~8 ;
[0025]灭菌后的发酵培养基的质量要求：氨基氮：50~60mg/100ml、溶磷：> 80ug/ml、总糖：40 ~50g/100ml、pH :6 ~7。
[0026]所述一级种子培养条件为：
[0027]I)罐压：控制在 0. 04 ~0. 06MPa ；
[0028]2)罐温：发酵前5h，罐温控制在30~31°C ；6h至一级种子培养结束，罐温控制在32 ~33。。；
[0029]3)空气流量：0~5h，10~20m3/h ；6h至一级种子培养结束：20~30m3/h ；
[0030]4) pH:控制在7 ~8;
[0031]5)搅拌转速：0~5h,采用气流搅拌；56h至一级种子培养结束：采用机械搅拌，转速控制在60r/min。
[0032]所述二级种子培养条件为：
[0033]I)罐压：控制在 0. 04 ~0. 06MPa ；
[0034]2)罐温：发酵前5h，罐温控制在30~31°C ；6h至二级种子培养结束，罐温控制在32 ~33。。；
[0035]3)空气流量：0~5h，40~50m3/h ；5h至二级种子培养结束：60~70mVh ；
[0036]4) pH:控制在7 ~8;
[0037]5)搅拌转速：0~5h,采用气流搅拌；6h至一级种子培养结束：采用机械搅拌，转速控制在80r/min。
[0038]所述发酵培养条件为：
[0039]I) pH控制：控制在5. 8~7 ;
[0040]2)无菌检查：发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；
[0041]3)空气流量：0 ~15h ： 1000mVh ；16h ~发酵结束:800m3/h ；
[0042]4)溶氧控制：0~15h :溶氧浓度不得低于30% ；16h~发酵结束：溶氧浓度控制在30 ~90% ；
[0043]5)揽祥转速：0 ~5h ：60r/min ；6 ~15h ：90r/min ； 16 ~80h ：75r/min ；81h ~发酵结束：50r/min ；
[0044]6)培养温度：31 ~32°C ;
[0045]7)罐压：控制在 0.03 ~0.04MPa。
[0046]在所述发酵过 程中进行补料，包括补糖、补水和补酸或碱，其中
[0047]I)补糖控制：
[0048]发酵前IOh不用进行补糖，
[0049]发酵时间11~85h，当发酵液总糖含量< 15g/100ml时，采用流加法进行补麦芽糖，控制发酵液总糖含量在20~25g/100ml ；
[0050]2)补水：按照工艺要求必须定时补入一定量的已灭菌的饮用水，其目的是控制菌体浓度，有利于代谢产物的生成。采用流加法进行补水，
[0051]发酵前15h，不用补水，
[0052]发酵时间16~80h，当菌体浓度超过45%，补入饮用水，控制其菌体浓度在38~45%,
[0053]81h至发酵结束：当菌体浓度超过35%，补入饮用水，控制其菌体浓度在30~35% ；
[0054]3)补酸或碱：
[0055]发酵前15h, pH不进行控制，
[0056]发酵时间15h~发酵结束,每隔4~6h检测发酵液pH,当pH < 5. 8,补入20%的氢氧化钠溶液；当PH > 7，补入20~30%的硫酸铵溶液，发酵液pH控制在5. 8~7。
[0057]本发明的技术优势为：
[0058]I使用啤酒酵母干渣、蚯蚓粉代替了种子培养基、发酵培养基中的蛋白胨、鱼粉、黄豆饼粉和玉米浆，减少有机氮源的用量和种类。降低了采购和生产成本，减少因原料质量影响种子液和发酵液的不利因素。
[0059]2种子培养基中使用了啤酒酵母干渣和蚯蚓粉，其磷、氨基氮的含量明显高于常规种子培养基配方，有利于改善壮观链霉菌菌丝形态；提高种子培养的质量。
[0060]3常规种子培养周期为26~30h。使用本发明种子培养基，其种子培养周期为18~20h，用时减少了 32%以上，提高种子培养的工作效率。
[0061]4使用本发明一级种子培养基，其接种量为I~2L/m3，一级种子培养的接种量减少了 40%，减轻了菌种研究人员的工作强度。
[0062]5培养基中使用麦芽糖代替葡萄糖，避免高温灭菌过程中出现的碳化现象。
[0063]6采用本发明培养基，大观霉素的发酵单位达到8000u/ml以上。
[0064]7本发明培养基中的总生物素、甘氨酸、亮氨酸、谷氨酸和天门冬氨酸的含量高于常规培养基配方，为提高发酵单位提供了有利保证，具体内容见下表：
[0065]本发明培养基与常规培养基中总生物素含量对比表
[0066]
【权利要求】
1.一种壮观链霉菌发酵生产大观霉素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有玉米油、麦芽糖、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。
2.按照权利要求1所述的壮观链霉菌发酵生产大观霉素的培养基，其特征在于所述一级种子培养基组成为:玉米油18~20ml/L、麦芽糖3~5g/L、啤酒酵母干渣12~14g/L、蚯蚓粉17~19g/L、硫酸铵0.03~0.05g/L、麦芽糖酶0.04~0.06g/L、聚醚消泡剂0.01~0.03g/L。
3.按照权利要求1所述的壮观链霉菌发酵生产大观霉素的培养基，其特征在于所述二级种子培养基组成为:玉米油20~22ml/L、麦芽糖5~7g/L、啤酒酵母干渣17~19g/L、蚯蚓粉18~20g/L、硫酸铵0.04~0.06g/L、麦芽糖酶0.05~0.07g/L、聚醚消泡剂0.01~0.03g/L。
4.按照权利要求1所述的壮观链霉菌发酵生产大观霉素的培养基，其特征在于所述发酵培养基组成为:玉米油23~25ml/L、麦芽糖21~23g/L、啤酒酵母干渣22~24g/L、虫丘蚓粉21~23g/L、硫酸铵0.07~0.08g/L、磷酸二氢钾0.02~0.04g/L、氯化钾0.02~0.04g/L、轻质碳酸钙0.3~0.5g/L、巴比妥0.6~0.8g/L、麦芽糖酶0.07~0.09g/L、聚醚消泡剂0.01~0.03g/L。
5.按照权利要求1、2、3或4所述的壮观链霉菌发酵生产大观霉素的培养基，其特征在于所述啤酒酵母干渣的质量要求为: 蛋白质含量≥45% ;磷含量≥60ug/ml ;水分≤5% ;灰分≤5% ;碳水化合物≥12% ;干渣颗粒通过60目筛的数量≥ 80%ο
6.按照权利要求1、2、3或4所述的壮观链霉菌发酵生产大观霉素的培养基，其特征在于所述蚯蚓粉质量要求为: 蛋白质含量≥60% ;水分≤10% ;粒度以能通过80目筛为准。
7.—种壮观链霉菌利用权利要求2、3和4所述的培养基发酵生产大观霉素的发酵方法，其特征在于其工艺步骤为:首先将壮观链霉菌母瓶发酵液按照I~2L/m3的接种量接入到一级种子培养基中进行一级种子培养，至菌体浓度40~45%、?!1值> 7、培养周期为18~21h时转入到二级种子培养基进行二级种子培养，至菌体浓度40~45%、？!1值> 7、培养周期为18~20h时再转入发酵培养基中进行发酵培养，至菌体浓度30~35%，发酵单位超过8000u/ml且每6~8h检测的发酵单位相差在300u/ml以内，发酵周期为90~100h, pH值5.8~7时终止发酵。
8.按照权利要求7所述的发酵方法，其特征在于所述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基在使用前进行灭菌，其中 灭菌后的一级种子培养基的质量要求为:氨基氮:40~50mg/100ml、溶磷:> 80ug/ml、总糖:30 ~40g/100ml、pH:7 ~8 ; 灭菌后的二级种子培养基的质量要求为:氨基氮:50~60mg/100ml、溶磷:> 80ug/ml、总糖:30 ~40g/100ml、pH:7 ~8 ; 灭菌后的发酵培养基的质量要求:氨基氮:50~60mg/100ml、溶磷:> 80ug/ml、总糖:40 ~50g/100ml、pH:6 ~7。
9.按照权利要求7所述的发酵方法，其特征在于所述一级种子培养条件为:.1)罐压:控制在0.04~0.06MPa ； .2)罐温:发酵前5h，罐温控制在30~31°C；6h至一级种子培养结束，罐温控制在32~.33 0C ； .3)空气流量:0~5h，10~20m3/h；6h至一级种子培养结束:20~30m3/h ； .4)pH:控制在7~8 ; .5)搅拌转速:0~5h,采用气流搅拌；6h至一级种子培养结束:采用机械搅拌，转速控制在 60r/min。
10.按照权利要求7所述的发酵方法，其特征在于所述二级种子培养条件为: .1)罐压:控制在0.04~0.06MPa ； .2)罐温:发酵前5h，罐温控制在30~31°C；6h至二级种子培养结束，罐温控制在32~33 0C ； .3)空气流量:0~5h，40~50m3/h；6h至二级种子培养结束:60~70m3/h ； .4)pH:控制在7~8 ; .5)搅拌转速:0~5h,采用气流搅拌；6h至一级种子培养结束:采用机械搅拌，转速控制在 80r/min。
11.按照权利要求7所述的发酵方法，其特征在于所述发酵培养条件为: .1)pH控制:控制在5.8~7; .2)无菌检查:发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌； .3)空气流量:0~15h: 1000mVh ；16h~发酵结束:800m3/h ； . 4)溶氧控制:0~15h:溶氧浓度不得低于30% ；16h~发酵结束:溶氧浓度控制在.30 ~90% ； .5)揽祥转速:0~5h:60r/min ；6 ~15h:90r/min ； 16 ~80h:75r/min ；81h ~发酵结束:50r/min ； .6)培养温度:31~32°C; .7)罐压:控制在0.03~0.04MPa。
12.按照权利要求7所述的发酵方法，其特征在于在所述发酵过程中进行补料，包括补糖、补水和补酸或碱，其中 .1)补糖控制: 发酵前IOh不用进行补糖， 发酵时间11~85h，当发酵液总糖含量< 15g/100ml时，采用流加法进行补麦芽糖，控制发酵液总糖含量在20~25g/100ml ； .2)补水: 发酵前15h，不用补水，发酵时间16~80h，当菌体浓度超过45%，补入饮用水，控制其菌体浓度在38~45%， .81h至发酵结束:当菌体浓度超过35%，补入饮用水，控制其菌体浓度在30~35% ； .3)补酸或碱:发酵前15h，pH不进行控制，发酵时间15h~发酵结束，每隔4~6h检测发酵液PH，当pH < 5.8，补入20%的氢氧化钠溶液；当pH > 7，补入20~30%的硫酸铵溶液，发酵液PH控制在5.8~7。
【文档编号】C12R1/465GK103484509SQ201310441533
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】任勇, 王 义, 奇乃 申请人:宁夏泰瑞制药股份有限公司