抑制pcsk9基因表达的组合物和方法
【专利摘要】本发明涉及用于抑制PCSK9基因(PCSK9基因)表达的双链核糖核酸(dsRNA)，所述dsRNA包含长度小于30个核苷酸且通常为19-25个核苷酸的核苷酸序列反义链，并且所述反义链与PCSK9基因的至少一部分基本互补。本发明还涉及包含所述dsRNA和药学上可接受的载体的药物组合物，使用所述药物组合物治疗由PCSK9基因的表达和PCSK9基因表达导致的疾病的方法。
【专利说明】抑制PCSK9基因表达的组合物和方法
[0001] 本申请是申请日为2007年05月10日和发明名称为“抑制PCSK9基因表达的组合物和方法”的200780024854.1号发明专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求于2006年5月11日递交的美国临时申请第60 / 799，458号，于2006年6月27日递交的美国临时申请第60 / 817，203号，于2006年8月25日递交的美国临时申请第60 / 840,089号，于2006年10月18日递交的美国临时申请第60 / 829，914号和于2007年2月13日递交的美国临时申请第60 / 901，134号的优先权。所有这些临时申请的内容均通过引用整体并入本文。
【技术领域】
[0004]本发明涉及双链核糖核酸(dsRNA)及其介导RNA干涉以抑制PCSK9基因表达的用途，以及dsRNA在治疗如高脂血症等可由PCSK9下调介导的病理过程的用途。
【背景技术】
[0005]枯草溶菌素前蛋白转化酶9 (Proprotein convertase subtilisin kexin9,PCSK9)是枯草溶菌素丝氨酸蛋白酶家族的成员。其它8个哺乳动物枯草溶菌素蛋白酶PCSK1-PCSK8(也被称为 PCl / 3、PC2、弗林蛋白酶、PC4、PC5 / 6、PACE4、PC7 和 SlP /SK1-1)是加工多种分泌通路中蛋白质并在多种生物进程中发挥作用的前蛋白转化酶(Bergeron,F.(2000)J.Mol.Endocrinol.24,1-22, Gensberg,K., (1998)Semin.Cell Dev.Biol.9，11-17，Seidah, N.G.(1999)Brain Res.848，45-62，Taylor, N.A., (2003)FASEBJ.17，1215-1227，和 Zhou，A.，(1999) J.Biol.Chem.274，20745-20748)。现已提出 PCSK9在胆固醇代谢中发挥作用。PCSK9mRNA的表达在胆固醇膳食饲养的小鼠中下调(Maxwell，K.N.，(2003) J.LipidRes.44,2109-2119)，在 H印G2 细胞系中上调(Dubuc, G.，(2004)Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.24,1454-1459)，而在固醇调节兀件结合蛋白(SREBP)的转基因小鼠中上调(Horton, J.D.，(2003) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA100，12027-12032)，这类似于胆固醇生物合成酶以及低密度脂蛋白受体(LDLR)。此外，现已发现PCSK9错义突变与常染色体显性高胆固醇血症(Hchola3)相关(Abi fade I, M.，et al.(2003) Nat.Genet.34，154-156，Timms,K.M.，(2004)Hum.Genet.114，349-353，Leren，T.P.(2004)Clin.Genet.65,419-422)。因为现已在日本人中发现单核苷酸多态性(SNP)与胆固醇水平相关，因此PCSK9可能还决定普通人群的LDL胆固醇水平(Shioji，K.，(2004) J.Hum.Genet.49,109-114)。
[0006]常染色体显性高胆固醇血症(ADH)是单基因疾病，其患者表现为升高的总胆固醇水平和LDL胆固醇水平、肌腱黄色瘤和过早的动脉粥样硬化(Rader，D.J.，(2003) J.Clin.1nvest.111，1795-1803)。ADH及退行性疾病隐性遗传性高胆固醇血症(ARH) (Cohen, J.C.，(2003) Curr.0pin.Lipidol.14，121-127)的发病机理是肝脏对LDL吸收的缺陷。阻碍LDL吸收的LDLR突变或LDL上与LDLR结合的载脂蛋白B的突变均可导致ADH。ARH是由ARH蛋白质中的突变造成的，其中ARH蛋白质是通过与网格蛋白相互作用而内吞LDLR-LDL复合物所必需的。因此，如果PCSK9突变是Hchola3家族病的病因，那么PCSK9很可能在受体介导的LDL吸收中起作用。
[0007]过表达研究指出PCSK9可以控制LDLR的水平，并以此控制肝脏对LDL的吸收(Maxwell, K.N.(2004) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA101，7100-7105，Benjannet，S.，et al.(2004) J.Biol.Chem.279, 48865-48875, Park, S.ff., (2004) J.Biol.Chem.279,50630-50638)。小鼠中由腺病毒介导的小鼠或人PCSK9过表达3或4天可导致总胆固醇水平和LDL胆固醇水平的升高，而在LDLR敲除动物中则未发现此作用(Maxwell，K.N.(2004)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 101, 7100-7105, Benjannet, S.，et al.(2004) J.Biol.Chem.279，48865-48875，Park, S.ff.，(2004) J.Biol.Chem.279，50630-50638)。此外，PCSK9过表达造成肝脏LDLR蛋白质的大量减少，但不影响LDLR mRNA水平、SREBP蛋白质水平或SREBP蛋白的细胞核/细胞质比例。这些结果说明PCSK9通过转录后机制直接或间接地降低LDLR蛋白质水平。
[0008]现已设计出PCSK9功能缺失突变的小鼠模型(Rashid et.al.，(2005)PNAS, 102，5374-5379)，并在人类个体中鉴定出PCSK9功能缺失突变(Cohen et al.，(2005)，NatureGenetics.,37,161-165)。在这两种情况下，PCSK9功能缺失均导致总胆固醇水平和LDLc胆固醇水平的降低。回顾过去15年的研究成果发现，缺失一个拷贝PCSK9可降低LDLc，并有助于提高对抗心血管疾病风险的能力(Cohen et.al., 2006N.Engl.J.Med., 354.,1264-1272.)。迄今为止的证据清楚地说明降低PCSK9水平可降低LDLc。
[0009]目前已发现双链RNA分子(dsRNA)通过被称为RNA干扰(RNAi)的高度保守的调控机制来阻断基因表达。W099 / 32619 (Fire et al.)公开了长度为至少25个核苷酸的dsRNA在抑制线虫(C.elegans)基因表达中的用途。现还发现dsRNA在其它生物体中降解靶RNA，其中所述生物体包括植物(参见，例如W099 / 53050，Waterhouse et al.和W099 / 61631,Heifetz et al.)、果蝇(参见，例如 Yang，D.，et al.,Curr.Biol.(2000) 10:1191-1200)和哺乳动物(参见 WOOO / 44895，Limmer 和 DE10100586.5，Kreutzer et al.)。这种天然机制现已成为治疗因基因异常或有害调控而引发的疾病的新型药物的研发热点。
[0010]除了在RNAi领域的显著进展以及由下调PCSK9基因表达介导的病理过程治疗的进展之外，人们还需要能够抑制PCSK9基因表达并能够治疗如高脂血症等与PCSK9基因表达相关疾病的药剂。
【发明内容】
[0011]本发明通过使用双链核糖核酸(dsRNA)沉默枯草溶菌素前蛋白转化酶9(PCSK9)表达，从而提供了关于可受PCSK9基因下调调节的疾病治疗的问题解决方案。
[0012]本发明提供了双链核糖核酸(dsRNA)以及使用此类dsRNA抑制细胞或哺乳动物中PCSK9基因表达的组合物和方法。本发明还提供了用于治疗如闻脂血症等可受PCSK9基因表达下调调节的病症的组合物和方法。本发明的dsRNA包含具有长度小于30个核苷酸且通常长度为19-24个核苷酸区域的RNA链(反义链)，并且其中所述区域基本与PCSK9基因mRNA转录本的至少一部分互补。
[0013]在一个实施方案中，本发明提供了用于抑制PCSK9基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子。所述dsRNA包含至少两条彼此互补的序列。所述dsRNA包含具有第一序列的正义链和具有第二序列的反义链。所述反义链包含与PCSK9编码mRNA的至少一部分基本互补的核苷酸序列，并且互补区的长度小于30个核苷酸，通常为19-24个核苷酸。所述dsRNA在与表达PCSK9的细胞接触时可至少抑制40%的PCSK9基因表达。
[0014]例如，本发明的dsRNA分子可由dsRNA的第一序列和第二序列组成，其中所述第一序列选自于由表1和表2中正义序列组成的组，所述第二序列选自于由表1和表2中反义序列组成的组。本发明的dsRNA分子可包含天然存在的核苷酸或包含至少一种修饰核苷酸，所述修饰核苷酸例如为2' -0-甲基修饰的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸以及与胆留醇基衍生物相连接的末端核苷酸。或者，所述修饰核苷酸可选自以下组:2'-脱氧-2'-氟代修饰核苷酸、2'-脱氧-修饰核苷酸、锁核苷酸(locked nucleotide)、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰核苷酸、2'-烷基-修饰核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和含有非天然碱基的核苷酸。通常，此类修饰序列可基于所述dsRNA的第一序列和第二序列，其中所述第一序列选自于由表1和表2中正义序列组成的组，所述第二序列选自于由表1和表2中反义序列组成的组。
[0015]在另一个实施方案中，本发明提供了包含一种本发明dsRNA的细胞。所述细胞通常为哺乳动物细胞，例如人类细胞。
[0016]在另一个实施方案中，本发明提供了抑制生物体(通常为人类受试者)体内PCSK9基因表达的药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本发明的dsRNA以及药学上可接受的载体或递送载体。
[0017]在另一个实施方案中，本发明提供了抑制细胞内PCSK9基因表达的方法，所述方法包含以下步骤: [0018](a)将双链核糖核酸(dsRNA)引入细胞中，其中所述dsRNA包含至少两条彼此互补的序列。所述dsRNA包含正义链和反义链，其中所述正义链包含第一序列，所述反义链包含第二序列。所述反义链包含与PCSK9编码mRNA的至少一部分基本互补的互补区，并且所述互补区域的长度小于30个核苷酸，通常为19-24个核苷酸，并且所述dsRNA在与表达PCSK9接触时可至少抑制40%的PCSK9基因表达；和
[0019](b)将步骤(a)中得到的细胞维持足够长的时间以降解PCSK9基因的mRNA转录本，从而抑制细胞内PCSK9基因的表达。
[0020]在另一个实施方案中，本发明提供了治疗、预防或控制如高脂血症等可由PCSK9基因表达下调介导的病理过程的方法，所述方法包含向需要此类治疗、预防或控制的患者施用治疗有效量或预防有效量的一种或多种本发明的dsRNA。
[0021]在另一个实施方案中，本发明提供了抑制细胞内PCSK9基因表达的载体，所述载体包含可操作地与编码本发明dsRNA的至少一条链的核苷酸序列连接的调控序列。
[0022]在另一个实施方案中，本发明提供了一种细胞，其包含抑制细胞内PCSK9基因表达的载体。所述载体包含可操作地与编码本发明dsRNA的至少一条链的核苷酸序列连接的调控序列。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1:显示ND-98脂质的结构。[0024]图2:显示靶向PCSK9mRNA的不同ORF区域(具有图中所指出的ORF位点的第一个核苷酸)的16种小鼠特异性PCSK9siRNA(AL-DP-9327至AL-DP-9342)在C57 / BL6小鼠(每组5只)体内的筛选结果。计算各处理组肝脏裂解物中PCSK9mRNA与GAPDH mRNA比例的平均值，并与使用PBS处理的对照组或使用不相关SiRNA(凝血因子VII)的对照组进行比较。
[0025]图3:显示靶向PCSK9mRNA的不同ORF区域(具有图中所指出的ORF位点的第一个核苷酸)的16种人/小鼠/大鼠交叉反应性PCSK9siRNA(AL-DP-9311至AL-DP-9326)在C57 / BL6小鼠(每组5只)体内的筛选结果。计算各处理组肝脏裂解物中PCSK9mRNA与GAPDH mRNA比例的平均值，并与使用PBS处理的对照组或使用不相关siRNA(凝血因子VII)的对照组进行比较。
[0026]PCSK9mRNA的沉默造成血清总胆固醇水平的下降。
[0027]能最有效地敲除PSCK9信使的SiRNA显示最显著的胆固醇降低效果(约20-30% )。
[0028]图4:显示 16 种小鼠特异性 PCSK9siRNA(AL-DP-9327 至 AL-DP-9342)在 C57 / BL6小鼠(每组5只)体内的筛选结果。计算各处理组血清总胆固醇水平的平均值，并与使用PBS处理的对照组或使用不相关siRNA(凝血因子VII)的对照组进行比较。
[0029]图5:显示在16种人/小鼠/大鼠交叉反应性PCSK9siRNA (AL-DP-9327至AL-DP-9342)在C57 / BL6小鼠(每组5只)体内的筛选结果。计算各处理组血清总胆固醇水平的平均值，并与使用PBS处理的对照组或使用不相关siRNA(凝血因子VII)的对照组进行比较。
[0030]图6:显示体外和体内PCSK9沉默结果的比较。
[0031]图7A和图7B:显示使用猴原代肝细胞在体外沉默PCSK9的结果。
[0032]图8:显示由LNP-Ol配制的靶向pcsk-9的siRNA的体内活性。
[0033]图9:显示由LNP-Ol配制的修饰亲本分子9314和10792在不同时期的体内活性。修饰型10792清楚地显示出体内沉默活性。
【具体实施方式】
[0034]本发明提供了关于可受PCSK9基因下调调节的治疗疾病的问题解决方案，通过使用双链核糖核酸(dsRNA)沉默PCSK9基因从而提供如高脂血症等疾病的治疗方法。
[0035]本发明提供了双链核糖核酸(dsRNA)以及以及使用所述dsRNA抑制细胞或哺乳动物中PCSK9基因表达的组合物和方法。本发明还提供了用于治疗由PCSK9基因表达下调调节的病理过程和疾病的组合物和方法。dsRNA通过被称为RNA干扰(RNAi)的过程指导序列特异性mRNA降解。本发明的dsRNA包含具有长度小于30个核苷酸，通常长度为19-24个核苷酸区域的RNA链(反义链)，其中所述区域与PCSK9基因mRNA转录本的至少一部分互补。使用这些dsRNA能够靶向降解参与钠运输的mRNA。使用基于细胞的试验以及动物试验，本发明人已证明极低剂量的这些dsRNA可特异且高效介导RNAi，造成PCSK9基因表达的显著抑制。因此，本发明中包含这些dsRNA的方法和组合物可用于可受PCSK9下调介导的病理过程治疗，例如高脂血症的治疗。
[0036]下文的详细说明公开了制备和使用dsRNA和包含dsRNA的组合物以抑制靶基因PCSK9表达，以及治疗如高脂血症等可受PCSK9表达下调调节的疾病的组合物和方法。本发明的药物组合物包含dsRNA和药学上可接受的载体，其中所述dsRNA具有长度小于30个核苷酸，通常长度为19-24个核苷酸互补区域的反义链，其中所述互补区域与PCSK9基因mRNA转录本的至少一部分互补。
[0037]因此，本发明的某些方面提供了包含本发明的dsRNA和药学上可接受的载体的药物组合物，使用所述组合物抑制PCSK9基因表达的方法和使用所述药物组合物治疗可受PCSK9表达下调调节的疾病的方法。
[0038]1.定义 [0039]为了方便起见，下文提供了本说明书、实施例和权利要求书中使用的特定术语和短语的含义。如果某术语在本说明书其它部分中的用法与本节中提供的其定义之间有明显差异，应以本节中的定义为准。
[0040]“ G ”、“ C ”、“ A ”和“ U ”通常分别代表包含鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应理解的是术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可指如下文详述的修饰核苷酸，或具替换部分的替代物(surrogate replacement moiety)。技术人员熟知可将鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶替换成其它部分而基本不改变包含带有此类替换部分的核苷酸的寡核苷酸碱基配对性质。例如但不限于:包含次黄嘌呤作为其碱基的核苷酸可与包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，本发明的核苷酸序列中包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可被替换成包含如次黄嘌呤等的核苷酸。包含此类替换部分的序列是本发明的实施方案。
[0041]本文所使用的“PCSK9”是指枯草溶菌素前蛋白转化酶9基因或蛋白(也被称为FH3, HCH0LA3、NARC-1、NARCI)。所提供的 PCSK9 的 mRNA 序列有人类:NM_174936 ;小鼠:NM_153565 ;和大鼠:NM_199253。
[0042]本文所使用的“靶序列”是指PCSK9基因转录过程中形成的mRNA分子核苷酸序列中的连续部分，包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。
[0043]本文所用术语“包含序列的链”是指包含核苷酸链的寡核苷酸，该寡核苷酸链通过利用标准核苷酸命名法表示的序列进行阐述。
[0044]除非另有说明，否则在用于描述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的关系时，本文所用术语“互补”是指包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含所述第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双螺旋结构的能力，本领域技术人员可理解这一点。例如，此类条件可以是严格条件，其中所述严格条件可包括400mMNaCl、40mM PIPES pH6.4、lmM EDTA，在 50°C或 70°C下持续 12-16 小时，随后进行清洗。也可应用其它条件，例如可能在生物体内遇到的生理相关条件。本领域技术人员能够根据杂交核苷酸的最终应用决定最适合于两序列互补试验的系列条件。
[0045]这包括包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含所述第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的全长范围内的碱基配对。本文中这些序列被称为彼此“完全互补”。然而，在本文中当提到所述第一序列与所述第二序列“基本互补”时，所述两个序列可完全互补或在杂交时形成一个或多个，但通常不超过4个、3个或2个错配碱基对，同时保留与其最终应用最相关的条件下的杂交能力。但是，当两个寡核苷酸经设计以杂交形成一个或多个单链悬端时，考虑到互补的定义这种悬端不应该被认做是错配。例如，在包含一条长度为21个核苷酸的寡核苷酸和另一条长度为23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA中，较长寡核苷酸包含与较短寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，在本发明的目的下，这种情况也属于“完全互补”。
[0046]只要其杂交能力能够满足上述需求，本文所用“互补”序列也可以包含或完全由非Watson-Crick碱基对形成和/或由非天然和修饰核苷酸形成的碱基对形成。
[0047]本文中对于dsRNA的正义链与反义链间碱基配对，或dsRNA的反义链与靶序列间碱基配对可使用术语“互补”、“完全互补”和“基本互补”，所述术语可根据其所处上下文进
行理解。
[0048]本文所用的与信使RNA (mRNA)的“至少一部分基本互补”的多核苷酸是指与目标mRNA(例如，编码PCSK9的mRNA)的连续片段基本互补的多核苷酸。例如，如果多核苷酸的序列与编码PCSK9的mRNA中的非中断片段基本互补，那么所述多核苷酸与PCSK9mRNA的至少一部分互补。
[0049]本文所用术语“双链RNA”或“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合物，所述复合物具有双链结构并包含两条反平行且如上所述的基本互补的核酸链。形成所述双链结构的两条链可以是同一条较大RNA分子的不同部分，或者是单独的RNA分子。如果所述两条链为单独的RNA分子，此类dsRNA在文献中常被称为siRNA ( “小干扰RNA”)。如果所述两条链为一个较大分子的部分并且通过形成双链结构的一条链3,-末端及另一条链5'-末端之间的非中断核苷酸链相连接，那么所述相连的RNA链被称为“发夹环”、“短发夹RNA”或“shRNA”。如果所述两条链通过形成双链结构的一条链3'-末端及另一条链5'-末端之间的非中断链之外的方式共价连接，那么所述连接结构被称为“接头(linker)”。所述RNA链可具有相同或不同数量的核苷酸。碱基对的最大值是dsRNA中的最短链减去双链中存在的任何悬端后的核苷酸数目。除双链结构之外，dsRNA可包含一个或多个核苷酸悬端。此外，在本说明书中使用的“dsRNA”可包括对核糖核苷酸的化学修饰，包括对多个核苷酸的修饰，并包括本文公开或本领域已知的所有修饰类型。基于本说明书和权利要求书的目的，“dsRNA”涵盖用于siRNA类型分子的所有此类修饰。
[0050]本文所用“核苷酸悬端”是指当dsRNA的一条链的3’末端超过另一条链的5’末
端或反之时从dsRNA的结构突出的一个或多个未配对核苷酸。“平端”或“平末端”是
指在dsRNA的末端没有未配对的核苷酸，即没有核苷酸悬端。“平末端化的” dsRNA是指在其全长范围均为双链的dsRNA，即在此分子任一个末端均没有核苷酸悬端。为清楚起见，在确定siRNA是否具有悬端或平端时，不考虑结合到siRNA的3'-末端或5'-末端的化学帽或非核苷酸的化学部分。
[0051]术语“反义链”是指dsRNA中的一条链，其包含与靶序列基本互补的区域。本文所用术语“互补区”是指 反义链上与本文所定义的序列(例如靶序列)基本互补的区域。如果互补区与靶序列不完全互补，则最能容许的错配发生在末端区域，并且如果存在错配，则通常位于末端区域，或者例如5'和/或3'末端的6、5、4、3或2个核苷酸之内。
[0052]本文所用术语“正义链”是指dsRNA中的一条链，其包含与所述反义链区域基本互补的区域。
[0053]如本领域技术人员的理解，所述“引入到细胞中(或向细胞引入)”在用于dsRNA时，是指便于摄取或吸收进入细胞。dsRNA的吸收或摄取可通过非辅助性扩散或主动的细胞过程发生，或者通过辅助试剂或设备发生。此术语的内涵不限定于体外细胞；也可以将dsRNA “引入到细胞中(或向细胞引入dsRNA)”，其中所述细胞是活生物体一部分。在此情况下，引入到细胞中将包括向生物体的递送。例如，在体内递送中，可将dsRNA注射到组织位点或进行全身施用。向体外细胞的引入包括本领域已知的方法，例如电穿孔法和脂质体转染法(Iipofection)0
[0054]当术语“沉默”和“抑制表达”是针对PCSK9基因的表达时，它们在本文指至少部分抑制PCSK9基因的表达，通过与第二细胞或细胞群相比可以从第一细胞或细胞群中分离的转录自PCSK9基因的mRNA数量的减少来表示，其中所述第一细胞或细胞群中PCSK9基因被转录且其已经被处理以至PCSK9基因的表达被抑制，所述第二细胞或细胞群与所述第一细胞或细胞群基本相当但其没有作此处理(对照细胞)。抑制度通常用以下方式表示:
[0055]
【权利要求】
1.用于抑制细胞内人PCSK9基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少两条互补的序列，并且其中的正义链包含第一序列，反义链包含第二序列，所述第二序列包含与编码PCSK9的mRNA的至少一部分基本互补的互补区，其中所述互补区的长度小于30个核苷酸，且其中所述dsRNA在接触表达所述PCSK9的细胞时抑制所述PCSK9基因的表达。
2.如权利要求1所述的dsRNA，其中所述第一序列选自于由表1和表2组成的组，所述第二序列选自于由表1和表2组成的组。
3.如权利要求1所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一个修饰核苷酸。
4.如权利要求2所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一个修饰核苷酸。
5.如权利要求3所述的dsRNA，其中所述修饰核苷酸选自-.2'-O-甲基修饰核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸和与胆固醇衍生物或月桂酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。
6.如权利要求3所述的dsRNA，其中所述修饰核苷酸选自于:2'-脱氧-2'-氟代修饰核苷酸、2'-脱氧-修饰核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰核苷酸、2/ -烷基-修饰核酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然碱基的核苷酸。
7.如权利要求3所述的dsRNA，其中所述第一序列选自于由表1和表2组成的组，所述第二序列选自于由表1和表2组成的组。
8.如权利要求6所述的dsRNA,其中所述第一序列选自于由表1和表2组成的组,所述第二序列选自于由表1和表2组成的组。
9.细胞，其包含权利要求1所述的dsRNA。
10.用于抑制生物体内PCSK9基因表达的药物组合物，所述药物组合物包含dsRNA和药学上可接受的载体，其中所述dsRNA包含至少两条彼此互补的序列，并且其中的正义链包含第一序列，反义链包含第二序列，且所述第二序列包含与编码PCSK9的mRNA的至少一部分基本互补的互补区，并且其中所述互补区的长度小于30个核苷酸，且其中所述dsRNA在接触表达所述PCSK9的细胞时抑制所述PCSK9基因的表达。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述dsRNA的第一序列选自于由表1和表2组成的组，所述dsRNA的第二序列选自于由表1和表2组成的组。
12.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述dsRNA的第一序列选自于由表1和表2组成的组，所述dsRNA的所述第二序列选自于由表1和表2组成的组。
13.抑制细胞内PCSK9基因表达的方法，所述方法包括: (a)向所述细胞引入双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少两条彼此互补的序列，并且其中的正义链包含第一序列，反义链包含第二序列，且所述第二序列包含与编码PCSK9的mRNA的至少一部分基本互补的互补区，并且其中所述互补区的长度小于30个核苷酸，且其中所述dsRNA在接触表达所述PCSK9的细胞时抑制所述PCSK9基因的表达，和 (b)将步骤(a)中得到的细胞维持足够长的时间以降解PCSK9基因的mRNA转录本，从而抑制细胞中PCSK9基因的表达。
14.治疗、预防或控制可由PCSK9基因表达下调介导的病理过程的方法，所述方法包含给所需患者施用治疗有效量或预防有效量的dsRNA,其中所述dsRNA包含至少两条彼此互补的序列，并且其中的正义链包含第一序列，反义链包含第二序列，且所述第二序列包含与编码PCSK9的mRNA的至少一部分基本互补的互补区，并且其中所述互补区的长度小于30个核苷酸，且其中所述dsRNA在接触表达所述PCSK9的细胞时抑制所述PCSK9基因的表达。
15.抑制细胞内PCSK9基因表达的载体，其中所述载体包含可操作地连接于编码dsRNA中至少一条链的核苷酸序列的调节序列，其中所述dsRNA的一条链与编码PCSK9的mRNA的至少一部分基本互补，并且其中所述dsRNA的长度小于30个核苷酸，且其中所述dsRNA在接触表达所述PCSK9的细胞时抑制所述PCSK9基因的表达。
16.细胞,其包含权利要求15所述的载体。
17.用于降低细胞内人PCSK9基因表达水平的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少两条彼此互补的序列，并且其中的正义链包含第一序列，反义链包含第二序列，且所述第二序列包含与编码PCSK9的mRNA的至少一部分基本互补的互补区，且其中所述dsRNA在接触表达所述PCSK9的细胞时降低所述PCSK9基因的表达水平。
18.如权利要求17所述的dsRNA，其中所述接触降低所述PCSK9基因的表达水平。
19.如权利要求17所述的dsRNA，其中所述接触在体外以30nM或更低浓度进行。
20.用于降低生物体内PCSK9基因表达水平的药物组合物，其包含权利要求17所述的dsRNA和药学上可接受的载体。
21.用于治疗PCSK9相关病变的方法，其包含向所需患者施用治疗有效量的权利要求17所述的dsRNA。
22.用于治疗PCSK9相关病变的方法，其包含向所需患者施用治疗有效量的权利要求17所述的ds RNA。
【文档编号】C12Q1/68GK103614375SQ201310491236
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2007年5月10日 优先权日:2006年5月11日
【发明者】帕梅拉·谭, 比吉特·布拉姆利奇, 玛丽亚·弗兰克-卡米尼斯基, 凯文·菲茨杰拉德, 埃金·阿肯克, 威克特·E·考特廉斯基 申请人:阿尔尼拉姆医药品有限公司