一种高密度、高油脂含量小球藻细胞的培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种高密度、高油脂含量小球藻细胞的培养方法：在于培养装置中加入培养基，经灭菌、冷却后，按工作体积的1～10％接入异养适应性小球藻细胞种子液，藻细胞进入对数生长期后，将浓缩红薯淀粉水解物及异养适应性小球藻细胞种子液补充入发酵罐中，控制发酵罐中糖浓度5～15g/L，补充次数为2～7次，时间间隔12～48小时，获得高密度、高油脂含量小球藻细胞。本发明具有如下的技术效果，1)本发明红薯淀粉水解物碳源高效、廉价、易得；2)较常规异养，此改进异养方法可同步提高小球藻生物量及胞内油脂含量，即最高生物量和油脂产率分别达到22g／L，1.19g/L／d，总油脂产量增幅较大，为12.43g／L；3)为降低生物柴油发酵成本提供一种新思路，同时为转酯化获得应用价值更高的生物柴油奠定基础。
【专利说明】一种高密度、高油脂含量小球藻细胞的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微藻生物质能源领域，涉及一种提高异养小球藻油脂产量的方法。
【背景技术】
[0002]微藻因其生长速率快、营养利用效率高、极端环境适应能力强等优势特性，成为极具潜力的生物柴油原料[Chisti Y.Biotechnology Advances, 2007, 25:294-306]。矛盾的是，诸多微藻，如绿藻、硅藻、盐藻，其生长速率和油脂积累呈负相关性(即生长快，油脂含量低；油脂含量高，生长相对缓慢)，导致高效、快速产油无法实现，微藻生物柴油因此成为“贵族”能源。如何提高藻细胞生物量并有效富集胞内油脂一直是微藻能源领域的一大难题，也是微藻生物柴油实现产业化的关键[Ryan Georgianna D and Mayfield SP.Nature,2012,488:329-335]。
[0003]目前，微藻培养技术主要集中在自养、异养、联合培养等几种模式[LiangYN etal.Biotechnology Letters, 2009, 31:1043-1049]。传统自养培养模式存在细胞生物量低、易被它种微生物污染、培养复杂、季节影响因素大、光依赖性强等弊端，难以实现微藻能源的规模化[李元广等.中国科学基础，2009，5:64-70]。同时地，清华大学胡洪营课题组、中国科学院王广策课题组、华南理工大学陈峰课题组等多个研究团队对极端环境条件(如贫营养、低温、高光、高盐、重金属离子)胁迫下藻细胞积累油脂进行了研究，均获得了高油脂含量的藻细胞，有些藻种属油脂含量甚至高达80%以上。尽管氮限制贫营养模式诱导胞内油脂积累的具体机制尚不明确，但其易控性好，因而对其研究较多。法国西英格兰大学11 Iman等、日本大阪大学Takagi等、加拿大渥太华大学Li等通过限制培养基中硝酸盐浓度，使得藻细胞内油脂含量分别提高63 %、50.9 %和40 %;台湾成功大学Hsieh等采用尿素限制模式，也成功获得高油脂含量小球藻细胞。极端环境胁迫培养利于细胞油脂含量极大地提高，但同时也限制了细胞生长，导致生物量较低，影响整体油脂产量。由此可见，单方面藻细胞生物量或者油脂含量的提`高，均不能获得高油脂产量，无法满足微藻作为生物柴油理想原料的要求。
[0004]围绕藻细胞生长和油脂积累特性，一些研究学者又相继提出了联合培养技术，如“自养-异养，，、“异养-自养 ” [Xiong et al.Bioresource Technology, 2010,101:2287-2293 ;Fan et al.Bioresource Technology,2012,112:206-211 ；Mujtaba etal.Bioresource Technology, 2012,123:279-283]，此类培养技术可使微藻生物量与油脂积累在异种环境中(分别是利于增大生物量或提高油脂含量的两种环境)分步完成，能有效提高微藻油脂产量。但需考虑藻细胞在异养与自养模式间频繁转换的环境适应性、光能消耗成本、藻细胞生长空间狭小等问题[Mata TM et al.Renewable and SustainableEnergy Reviews, 2010，14:217-232]。
[0005]较上述微藻培养模式，单纯异养技术在生物量富集、胞内油脂高效积累方面更为有利，可避免光依赖性、复杂培养过程、成本高、生物量低等弊端。尽管如此，微藻生物柴油商业化由于高成本的发酵底物碳源而受到限制。在传统异养培养基中，葡萄糖碳源成本占据了整个培养基成本的 80% [Li XF et al.Biotechnology and Bioengineering, 2007,98:764-771]。此后，清华大学吴庆余课题组利用木薯淀粉水解液、玉米淀粉水解液、甜高粱汁作为碳源替代葡萄糖异养小球藻方面取得了重要突破，细胞油脂含量高达55.2%，是自养条件下油脂含量的 4 倍[Xu et al.Journal of Biotechnology, 2006,126:499-507 ;Gao et al.Applied Energy, 2010，87:756-761]。然而，由于低浓度碳源的应用致使生物量较低，最终油脂产量并不理想，但提高碳源浓度，又会导致油脂含量较低[Wei et al.J IndMicrobiol Biotechnol, 2009, 36:1383-1389]，远远不能满足小球藻作为理想生物柴油原料的要求。因而，寻求更为廉价、优质替代碳源及提高异养微藻油脂产量尤为重要。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种提高异养小球藻油脂产量的方法。
[0007]本发明的技术方案是，一种高密度、高油脂含量小球藻细胞的培养方法:在于培养装置中加入培养基，经灭菌、冷却后，按工作体积的I~10%接入异养适应性小球藻细胞种子液，藻细胞进入对数生长期后，将浓缩红薯淀粉水解物及异养适应性小球藻细胞种子液补充入发酵罐中，控制发酵罐中糖浓度5~15g / L，补充次数为2~7次，时间间隔12~48小时，获得高密度、高油脂含量小球藻细胞。
[0008]浓缩红薯淀粉水解物的其制备方法是:常温下，取红薯淀粉、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，以质量体积比为1:4混匀，经糊化、液化、糖化，微波煮沸灭酶，离心、过滤收集得到红薯淀粉水解液，后经真空冷冻干燥获得浓缩红薯淀粉水解物。
[0009]所述小球藻为生物柴油优势小球藻属中的原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)或蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)。
[0010]异养适应性小球藻细胞种子液的制备方法是:挑取活化小球藻细胞，接入培养基中，黑暗光照交替培养120h，获得一级小球藻细胞种子液，将一级小球藻细胞种子液按10%接种量接入同种培养基中化能异养120h，获得异养适应性小球藻细胞种子液。
[0011]所述的浓缩红薯淀粉水解物的组成成份包括:葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、蛋白质、氨基酸、脂肪、磷、钙、铁、维生素；水解物中各成分重量百分比依次为:葡萄糖75~85%、麦芽糖10~20%、麦芽三糖1.5~5%、蛋白质2~3%、氨基酸0.001~0.005%、脂肪0.1~
0.5%、磷0.01 ~0.05%、钙 0.02 ~0.03%、铁 0.2 ~0.5%、维生素 0.0005 ~0.0002%。
[0012]本发明具有如下的技术效果，I)本发明红薯淀粉水解物碳源高效、廉价、易得；2)较常规异养，此改进异养方法可同步提高小球藻生物量及胞内油脂含量，即最高生物量和油脂产率分别达到22g/L，1.19g/L / d，总油脂产量增幅较大，为12.43g/L ；3)为降低生物柴油发酵成本提供一种新思路，同时为转酯化获得应用价值更高的生物柴油奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为红薯淀粉水解产物的HPLC液相色谱成分分析。
[0014]图2为本发明方法培养的小球藻细胞透射电镜图。
[0015]图3为小球藻分批异养生物量、油脂产率及还原糖浓度变化分析。【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0017]实施例1:
[0018]平板活化原壳小球藻(Chlorella protothecoides)藻种,挑取活化藻细胞,加入装有30mL如下所述培养基的IOOmL培养瓶中，黑暗光照交替培养120h，获得一级种子液，将一级种子液按10%接种量接入装有IOOmL如下所述培养基的250mL培养瓶中化能异养120h，获得异养适应性种子液。
[0019]每升培养基组成(g / L):
[0020]红薯淀粉水解液24mL (含有20g糖，其中葡萄糖16g、麦芽糖3g、麦芽三糖 lg)、KH2PO4L 25g、尿素 3g、MgSO4.7H201g、Na2EDTA0.5g、H3BO30.12g、CaCl20.84g、ZnS0.7H200.88g、MnCl2.4H200.14g、MoO30.07g、CuSO4.5H200.16g、Co (NO3) 2.6H200.05g,FeSO4.7H200.05g,培养基 pH6.1。
[0021]在2L发酵罐中加入初始pH为6.1的上述培养基，经灭菌、冷却后，按工作体积的5%将异养适应性种子液接入发酵罐中，待糖耗尽后，将浓缩的红薯淀粉水解物、异养适应性种子液同时补入发酵罐中，维持糖浓度在5~15g / L，共补充7次，整个过程黑暗培养，温度为28°C，待糖耗尽后，收获得到高密度、高油脂含量藻细胞。
[0022]如图1所示，本发明红薯淀粉水解物碳源，其HPLC分析糖成分结果显示:葡萄糖(80% )、麦芽糖(15.0089% )、麦芽三糖(2.05% )，是理想的廉价、易得、优质碳源。
[0023]如图2所示，从图1(A)看出，传统异养条件原壳小球藻细胞内淀粉积累为主，少数油脂滴存在；本发明异养培养方法(图1B)油脂滴数量增加，提示藻细胞内油脂含量显著提闻。
`[0024]如图3所示，以本发明异养培养法异养原壳小球藻，其最大生物量和油脂产率分别为22.0g / L和1.19g/L / d，总油脂产量最大产量为12.43g / L。
[0025]比较例I
[0026]培养基基本组成同实施例1，以20g葡萄糖替代红薯淀粉水解产物，培养条件和过程与实施例1相一致。结果分析测得细胞生物量为9.8g/L，油脂产率为412mg / L / d，总油脂最大产量为4.29g/L。
[0027]比较例2
[0028]培养基基本组成同实施例1，以16g葡萄糖、3g麦芽糖、Ig麦芽三糖替代红薯淀粉水解产物，培养条件和过程与实施例1相一致。结果分析测得细胞生物量为12.7g / L，油脂产率为525mg / L / d，总油脂最大产量为5.46g/L。
[0029]根据上述培养结果可以看出，在同样基础培养基条件下，红薯淀粉水解物中的葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、蛋白质、氨基酸、矿物质、维生素，较纯葡萄糖或葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖组合作为碳源，更能有效促进微藻生生物量和藻细胞内油脂的积累，其生物量和油脂产量增幅比较明显，培养效果较好。
【权利要求】
1.一种高密度、高油脂含量小球藻细胞的培养方法:其特征在于:在于培养装置中加入培养基，经灭菌、冷却后，按工作体积的I~10%接入异养适应性小球藻细胞种子液,藻细胞进入对数生长期后，将浓缩红薯淀粉水解物及异养适应性小球藻细胞种子液补充入发酵罐中，控制发酵罐中糖浓度5~15g/L，补充次数为2~7次，时间间隔12~48小时，获得高密度、高油脂含量小球藻细胞。
2.根据权利要求1所述的一种高密度、高油脂含量小球藻细胞的培养方法，其特征在于:浓缩红薯淀粉水解物的其制备方法是:常温下，取红薯淀粉、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，以质量体积比为1:4混匀，经糊化、液化、糖化，微波煮沸灭酶，离心、过滤收集得到红薯淀粉水解液，后经真空冷冻干燥获得浓缩红薯淀粉水解物。
3.根据权利要求1所述的一种高密度、高油脂含量小球藻细胞的培养方法，其特征在于:所述小球藻为生物柴油优势小球藻属中的原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)或蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。
4.根据权利要求1所述的一种高密度、高油脂含量小球藻细胞的培养方法，其特征在于:异养适应性小球藻细胞种子液的制备方法是:挑取活化小球藻细胞，接入培养基中，黑暗光照交替培养120h，获得一级小球藻细胞种子液，将一级小球藻细胞种子液按10%接种量接入同种培养基中化能异养120h，获得异养适应性小球藻细胞种子液。
5.根据权利要求1、2所述的一种高密度、高油脂含量小球藻细胞的培养方法，其特征在于:所述的浓缩红薯淀粉水解物的组成成份包括:葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、蛋白质、氨基酸、脂肪、磷、钙、铁、维生素；水解物中各成分重量百分比依次为:葡萄糖75~85%、麦芽糖10~20%、麦芽三糖1.5~5%、蛋白质2~3%、氨基酸0.001~0.005%、脂肪0.1~.0.5%、磷0.01 ~0.05%、钙 0.02 ~0.03%、铁 0.2 ~0.5%、维生素 0.0005 ~0.0002%。
【文档编号】C12N1/12GK103555588SQ201310562767
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月10日 优先权日:2013年11月10日
【发明者】李玉芹, 陈迪, 穆锦秀, 韩方欣, 徐华, 曾虹燕 申请人:湘潭大学