一种新型特异性抗原负载诱导ctl的活化b细胞模型的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种新型特异性抗原负载诱导CTL的活化B细胞模型。本发明分离人外周血，得人外周血单个核细胞，CD20磁珠分离其中的B细胞，将其在孵育箱内培养，去除B细胞的PBMC，B细胞培养后进行HBcAg18-27多肽负载，加入多肽量为50ug／ml，负载时间为12～18小时，抗原负载后洗涤B细胞，去除B细胞的PBMC细胞内，B细胞与T细胞比例为1：10，继续培养4天后取出所培养细胞，五聚体技术检测HBV?HBcAg18-27多肽特异性CTL细胞。本发明解决了占外周血单个核细胞的比例在1％以下、扩增的效率不高，且培养时间长并且培养的费用高昂等缺陷。本发明建立了一种可靠和简单的细胞实验模型，避免了树突状细胞需要长时间培养并培养扩增效率低下的缺陷。
【专利说明】一种新型特异性抗原负载诱导CTL的活化B细胞模型
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药工程【技术领域】，特别涉及一种新型特异性抗原负载诱导CTL的活化B细胞模型。
【背景技术】
[0002]在本发明之前，过去利用树突状细胞(Dendritic Cells, DCs)诱导特异性CTL的方法有明显的问题。DC细胞是功能极强的APC，能有效介导T细胞应答，诱导产生特异性CTL，但是作为细胞疫苗它有两大缺点:1、在外周血中占极少数部分，占外周血单个核细胞的比例在1%以下；2、目前DC培养常用方法为单核细胞诱导分化扩增为DC，实验过程及培养体系较为复杂，体外培养分化和扩增的效率不高，且培养时间长并且培养的费用高昂，不能为实验建立一种可靠和简单的细胞实验模型。
【发明内容】
[0003]本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制建立一种新型特异性抗原负载诱导CTL的活化B细胞模型。
[0004]本发明的技术方案是:
[0005]一种新型特异性抗原负载诱导CTL的活化B细胞模型，其主要技术步骤为:
[0006](I)无菌收集人外周血；
[0007](2)淋巴细胞分离液分离人外周血，得人外周血单个核细胞；
·[0008](3)⑶20磁珠分离外周血单个核细胞中的B细胞；
[0009](4)将人B细胞置于由含10%人AB血清、5ug / ml胰岛素，50ug / ml转铁蛋白、2ug / ml的s⑶40L、2ng / ml的IL-4组成的培养液中重悬细胞，细胞浓度IXlO6 / ml,放入5% CO2、37 °C、饱和湿度的孵育箱内培养；
[0010](5)去除 B 细胞的 PBMC，用含 10%胎牛血清，IL-2 50IU / ml,CD3Ab3.03ng / ml的1640培养液培养，细胞浓度IX IO6 / ml，在25ml培养瓶内培养；
[0011](6)8细胞培养至第4-8天进行耶(^818-27多肽负载，加入多肽量为501^ / ml，负载时间为12~18小时，抗原负载后洗涤B细胞，加入到步骤(5)的培养去除B细胞的PBMC细胞内，B细胞与T细胞比例为1:10 ；
[0012](7)继续培养4天后取出所培养细胞，五聚体技术检测HBV HBcAgl8_27多肽特异性CTL细胞。
[0013]本发明的优点和效果在于采用磁珠分选出高纯化的人外周血B细胞并以可溶性⑶40L刺激B细胞，负载HBcAgl8-27多肽，并诱导产生HBV特异性CTL，由于外周血B细胞在数量上的优势及活化方法方面的优势而避免了树突状细胞需要长时间培养并培养扩增效率低下的缺陷，能够进行可靠和简单的细胞实验，并建立起一种实验模型和方法。
[0014]本发明的其他具体优点和效果将在下面继续描述。【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1——本发明⑶20磁珠分选后B细胞纯度，流式细胞检测结果为92.32%示意图。
[0016]图2——培养至第5天细胞增殖的流式细胞分析图，其中处于S期的细胞比例为35.37%，表明细胞增殖旺盛，表明s⑶40L对B细胞有刺激增殖作用示意图。
[0017]图3——s⑶40L刺激与未经s⑶40L刺激的B细胞负载核心抗原能力的比较，其中经s⑶40L刺激的B细胞抗原负载比例为41.2% (A)，而未经s⑶40L刺激的B细胞抗原负载比例为1.8% (B)示意图。
[0018]图4——右图为B细胞负载FITC标记的HBV HBcAgl8_27多肽的荧光显微镜结果，红色表示B淋巴细胞表面的⑶C9-PE，黄色(其实为绿色，绿色和红色叠加后显示为黄色)表不被负载了的HBcAgl8-27抗原肽；左图为普通显微镜对照不意图。
[0019]图5——五聚体检测HBV特异性CTL结果，前者(C)为实验组(加B细胞)，HBV特异性CTL比例为0.519%，后者(D)为对照组(未加B细胞)HBV特异性CTL比例为0.023%示意图。
【具体实施方式】
[0020]本发明的技术思路是:
[0021]B细胞作为一种APC，早已为人们熟知。但外周血中B细胞在未经有效刺激时抗原提呈能力有限，不能有效提呈抗原并诱导产生特异性CTL。而B细胞在外周血的比例(占外周血的6.4% -22% )远高于DCs，并且通过⑶40L刺激后B细胞可大量扩增，其数量优势更为明显；其培养体系更加简单经济，采用活化B细胞替代DCs细胞负载HBcAgl8-27多肽诱导HBV特异性CTL，从而建立一种实验模型，以建立B细胞活化及负载特定抗原的方法，促进这方面的实验研究。
[0022]下面是具体实施例说明:
[0023]1.无菌收集人外周血25ml (抗凝)，用淋巴细胞分离液(ficoll)分离得人外周血单个核细胞(PBMC)，用IMDM培养液重悬，并计数，可得到PBMCl X IO8 ；
[0024]2.在室温下1500转/ min离心5分钟，去上清，以洗涤细胞；
[0025]3.用培养液重悬细胞，并计数，调整细胞浓度；
[0026]4.用⑶20磁珠分离PBMC中的B细胞，以获得高纯度B细胞，B细胞纯度可达90%以上，由于B细胞占PBMC的比例6.4-22.6%，所以我们的方法中25ml外周血即可分离得到B细胞6X IO6以上，相比DC的来源更为简便；见图1，分选后的B细胞比例达92.32% ；
[0027]5.⑶20磁珠去除B细胞的PBMC(T细胞为主)用含10%胎牛血清，IL-2 50IU /ml，CD3Ab3.03ng / ml的1640培养液培养，细胞浓度IXlO6 / ml，在25ml培养瓶内培养，每4天换液；
[0028]6.将人B细胞浓度调整为2X IO6 / ml，培养液为含10%人AB血清、转铁蛋白、胰岛素的MDM培养基，培养体系为4ml ；
[0029]7.加入IL-4 2ng / ml、sCD40L2ug / ml至培养液中，以刺激活化B细胞，同时设不加SCD40L的对照组，本方法在刺激活化B细胞时仅采用SCD40L即可刺激活化B细胞，与DC培养相比，不需要再加入其它刺激活化物质如集落细胞刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF-a)以及多种细胞因子，培养体系较为简单；
[0030]8.将B细胞悬液移至6孔培养板中，每孔加4ml (2 X IO6 / ml)；
[0031]9.放入5% C02、37°C、饱和湿度的孵育箱内培养；
[0032]10.B细胞培养4天，将各孔细胞吸入离心管中，1500转/ min离心5分钟，去上清，补充含10%人AB血清、转铁蛋白、胰岛素的培养液4ml，重悬细胞后移至细胞培养板；
[0033]11.再加入IL-4 2ng / ml、sCD40L2ug / ml至培养液，以继续刺激活化B细胞，对照组同样不加SCD40L，此步骤为对B细胞的二次刺激，本方法中此步骤也可省略，即经过一次刺激即可活化B细胞，与DC培养活化需要2周(14天)相比，本方法培养时间缩短到
4-5 天；
[0034]12.继续放入5% C02、37°C、饱和湿度的孵育箱内继续培养；
[0035]13.B细胞培养至第7天，取出部分B细胞进行细胞周期及细胞表面标记检测，检测结果表明与对照组相比，经s⑶40L活化后B细胞增殖活跃，如图2所示，B细胞培养至第5天细胞增殖的流式细胞分析示意图，其中处于S期的细胞比例为35.37%。且细胞表面高表达⑶80、⑶86、MHC-1及MHC-1I等抗原提呈相关分子；
[0036]14.B细胞培养至8天，将每培养体系中加入HBV HBcAgl8_27多肽或FITC标记的HBV HBcAgl8-27多肽200u g，继续培养18小时，使活化B细胞负载抗原，对照组同样操作；
[0037]15.荧光显微镜及流式细胞检测B细胞对FITC标记的HBV HBcAgl8_27多肽的负载比例，负载比例均在40%以上，而对照组仅为2%左右，表明s⑶40L活化后B细胞抗原负载能力显著增强；见图3，经s⑶40L刺激的B细胞抗原负载比例为41.2%，而未经s⑶40L刺激的B细胞抗原负载比例为1.8%。图4为荧光显微镜观察到的抗原所示B细胞负载FITC标记的HBV HBcAgl8-27多肽的荧光显微镜结果，红色表示B淋巴细胞表面的⑶C9-PE，黄色(其实为绿色，绿色和红色叠加后显示为黄色)表示被负载了的HBcAgl8-27抗原肽；
[0038]16.将负载HBV HBcAgl8_27多肽的B细胞加入到另行培养的去除B细胞的PBMC (T细胞为主)中，B细胞与T细胞比例为1: 10，以使B细胞所负载抗原提呈给T细胞，另设不加B细胞的对照组；
[0039]17.继续培养4天后取出所培养细胞，五聚体技术检测HBV HBcAgl8_27多肽特异性CTL细胞，与对照组相比，经负载HBV HBcAgl8-27多肽的B细胞成功诱导出抗HBV特异性CTL，其特异性CTL细胞比例显著增高，本方法系列数据表明，经SCD40L活化后B细胞诱导产生抗HBV特异性CTL的能力平均增加20倍。图5所示:前者为实验组(加B细胞)，HBV特异性CTL比例为0.519%，后者为对照组(未加B细胞)HBV特异性CTL比例为0.023%。
[0040]18.由此，可溶性⑶40L刺激人外周血负载HBcAgl8_27抗原并诱导特异性CTL的B细胞模型已经建立。
【权利要求】
1.一种新型特异性抗原负载诱导CTL的活化B细胞模型，其步骤为: (1)无菌收集人外周血； (2)淋巴细胞分离液分离人外周血，得人外周血单个核细胞； (3)CD20磁珠分离外周血单个核细胞中的B细胞； ⑷将人B细胞置于由含10%人AB血清、5ug / ml胰岛素，50ug / ml转铁蛋白、2ug /ml的s⑶40L、2ng / ml的IL-4组成的培养液中重悬细胞，细胞浓度I X IO6 / ml，放入5%CO2、37 °C、饱和湿度的孵育箱内培养； (5)去除B 细胞的 PBMC，用含 10%胎牛血清，IL-250IU / ml, CD3Ab3.03ng / ml 的1640培养液培养，细胞浓度IXlO6 / ml，在25ml培养瓶内培养； (6)B细胞培养至第4-8天进行HBcAgl8-27多肽负载，加入多肽量为50ug/ ml，负载时间为12~18小时，抗原负载后洗涤B细胞，加入到步骤(5)的培养去除B细胞的PBMC细胞内，B细胞与T细胞比例为1:10 ； (7)继续培养4天后取出所培养细胞，五聚体技术检测HBVHBcAgl8-27多肽特异性CTL细胞。
2.根据权利要求1所述的一种新型特异性抗原负载诱导CTL的活化B细胞模型，其特征在于步骤(3)和(4)中，在体外用可溶性CD40L刺激活化磁珠分选的人B细胞，培养4-8天即可得到高纯度的APC。`
【文档编号】C12N5/0781GK103789261SQ201310616260
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年11月26日 优先权日:2013年11月26日
【发明者】吴超, 刘勇, 陈广梅, 赵琪, 陈军浩, 黄睿, 黄祖瑚 申请人:南京大学医学院附属鼓楼医院