一种耐酸性高温β-淀粉酶的突变体TBA-H2及其应用的制作方法
【专利摘要】一种耐酸性高温β-淀粉酶的突变体TBA-H2及其应用，其氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，该突变体相对于突变前的酶具有酸性的最适pH值和更高的生成麦芽糖的功能。本发明所述的高温β-淀粉酶的突变体TBA-H2能够在降解淀粉质材料中应用，尤其适合于在酸性条件下降解淀粉生成麦芽糖中的应用。
【专利说明】—种耐酸性高温β -淀粉酶的突变体ΤΒΑ-Η2及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体是一种耐酸性高温β -淀粉酶的突变体ΤΒΑ-Η2，以及该突变体酶在淀粉降解和含淀粉材料处理中的应用，尤其是用于生产高纯麦芽糖浆的应用。
【背景技术】
[0002]β -淀粉酶又被称为1，4- a -D-葡聚糖麦芽水解酶(EC3.2.1.2)，是一种外切酶，通过催化降解淀粉、糊精等聚糖的非还原性末端的α-1，4-糖苷键来连续产生麦芽糖。β -淀粉酶不含有α -淀粉酶的活性，被用于从液化淀粉浆来生产高麦芽糖浆，同时也被广泛应用于麦芽糖醇、麦芽糊精、酿造酒精等发酵工业中(吴林德，郑大鹏.介绍一种新型酶制剂-β_淀粉酶[J].微生物学杂志，1986，(3))。目前已经获得的细菌β_淀粉酶的最适pH值大约为6.5-7.0,植物β -淀粉酶的最适pH约为5.0-6.0 (Akira Hirata, MotoyasuAdachi, Shigeru Utsumi, Bunzo Mikam1.Engineering of the pH optimum of Bacilluscereus Beta-Amylase: Conversion of the pH Optimum from a Bacterial Type to aHigher-Plant Type.Biochemistry2004, 43，12523-12531.)。商品化的 β -淀粉酶主要是大麦β -淀粉酶，如杜邦-杰能科公司的0PTIMALT BBA,其最适作用温度为57°C，最适的pH值在5.5左右。在温度高于60°C或者pH低于4.5时迅速失活。然而，淀粉工业中普遍存在高温、低PH操作环境。例如，淀粉糖工业、发酵饮料、发酵废液处理及酒精行业中通常存在酸性条件下加工淀粉质原料的步骤，具有明显的耐酸性将使β_淀粉酶具有更大的应用潜力和开发前景。因此，为了满足一些在酸性条件下进行淀粉原料加工工艺的要求，实现与其他酸性酶类的联用，进一步简化工艺、降低成本、节约水和能源，迫切需要开发新型耐酸高温β -淀粉酶。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种耐酸性高温β -淀粉酶的突变体ΤΒΑ-Η2及其应用，解决了现有淀粉酶不能同时兼顾耐酸性和耐温性的问题。该淀粉酶突变体最适PH值为4.0，最适温度为60°C，在pH2.5-4.5和45_75°C范围内保持稳定。该β -淀粉酶突变体可用于高效降解淀粉质原料，尤其适用于酸性高温条件下的应用。
[0004]本发明所述的耐酸性高温β -淀粉酶的突变体ΤΒΑ-Η2，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，具体是将亲本酶(GenBank序列号ΑΑΑ23204.1)的第176位酪氨酸(Tyr，Y)和307位酪氨酸(Tyr，Y)突变为组氨酸(His，H)得到的突变体。
[0005]本发明通过以下技术方案达到上述目的:以热硫梭菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes) β -淀粉酶基因ctba(GenBank序列号Μ22471.1)为模板，通过引物介导的聚合酶链式反应技术(PCR)引入突变，将第176位酪氨酸(Tyr，Y)和307位酪氨酸(Tyr，Y)突变为组氨酸(His，H)，改造得到新的耐温耐酸β-淀粉酶突变体。这个新的β-淀粉酶突变体与原始酶相比，最适PH值由中性的6.0降低为酸性的4.0, pH稳定性范围向酸性方向偏移，在pH2.5-4.5和45-75°C范围内保持稳定。
[0006]所获得的耐酸性高温β -淀粉酶的突变体ΤΒΑ-Η2在淀粉降解和含淀粉材料处理中的应用，主要包括淀粉质麦芽糖、麦芽糖醇、麦芽糊精、饴糖以及酿造啤酒、酒精和醋等发酵工业中，尤其适用于与淀粉工业中其他酸性酶类如α-淀粉酶、普鲁兰酶、糖化酶等的联用开发新的同步工艺。将该耐酸性β_淀粉酶突变体应用于食品、医药、化工都能领域，可以在强耐酸性环境下高效降解淀粉生成麦芽糖，具有广阔的应用前景。
[0007]本发明与已有技术相比，具有以下实质性特点和显著的进步:
[0008]1.本发明公开的淀粉酶变体酶，其序列为SEQ ID: 1，由519个氨基酸组成，与亲本酶(GenBank序列号ΑΑΑ23204.1)相比，除只保留了成熟肽区域外，有两个位点不同，即将第176位酪氨酸(Tyr，Y)和307位酪氨酸(Tyr，Y)突变为组氨酸(His，H)。
[0009]2.本发明公开的β -淀粉酶变体酶，最适pH值为4.0，在pH2.5-4.5的酸性范围内可以保留75%以上的活性，最适温度为60°C，在45-75°C温度范围内保持稳定，最大比活力为1308U/mg，水解木薯淀粉和可溶性淀粉的产物只有麦芽糖生成。与之相比，亲本酶的最适pH为6.0，在pH4.0条件下相对活力约为60%。商品化的β -淀粉酶，如杜邦-杰能科公司的大麦β -淀粉酶OPTIMALT BBA的最适pH为5.5，最适温度为57°C，70°C即被灭活。
[0010]因而本发明公开的变体β -淀粉酶ΤΒΑ-Η2明显不同于已有的亲本β -淀粉酶及商品化β -淀粉酶、显著地取得了预料不到的技术效果，其提高的催化活性和酸稳定性更加适应于淀粉工业中水解淀粉过程对酶耐受高反应温度和酸性低pH值的要求。
[0011]应当理解的是，本发明具有重要的经济效益，突变体酶的高催化效率和高麦芽糖转化率有利于降低生产成本，耐温性和耐酸特性满足一些在酸性条件下进行淀粉原料加工工艺的要求，有利于实现与其他酸性酶类的联用，进一步简化工艺、降低成本、节约水和能源。对本领域技术人员而言，可以根据本发明对热硫梭菌或者其他来源的β-淀粉酶加以改进或者替换。例如对热硫梭菌TBA的相同位点引入其他的氨基酸突变达到相同的改善PH稳定性、热稳定性、催化效率和转化率的效果，或者在本发明公开的TBA位点的附近位点引入突变间接地达到相类似的效果，或者在其他来源β -淀粉酶对等位点或者附近位点引入同样或者类似的突变达到同样的改造效果。这些β_淀粉酶的来源包括巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、多粘芽抱杆菌(Bacillus polymyxa)、腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus)、环状芽抱杆菌(Bacillus circulans)、热硫梭菌(Clostridiumthermosulfurogenes)、假单胞菌(Pseudomonas)、土佐链霉菌(Streptomycestosaensisnov)、高温放线菌(Thermeoactinomyces sp.)和诺卡氏菌(Nocarida sp.)等。应当理解的是，所有这些改造和改进都应属于本发明所要求保护的权利要求范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是β -淀粉酶突变体ΤΒΑ-Η2纯化酶的SDS-PAG电泳图。M-蛋白质标准样品；
1-纯化的淀粉酶突变体ΤΒΑ-Η2。
[0013]图2是β -淀粉酶野生型和突变体ΤΒΑ-Η2酶活随pH变化图。其中代表ΤΒΑ-Η2，代表野生型。
[0014]图3是β -淀粉酶突变体ΤΒΑ-Η2水解1%可溶性淀粉产物的高效液相色谱(HPLC)图。其中1-流动相乙腈，2-麦芽三糖，3-麦芽糖，4-葡萄糖。【具体实施方式】
[0015]以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述，但是这些实施例不应当被理解为对本发明的限制。
[0016]实施例1
[0017]本实施例说明β -淀粉酶突变体ΤΒΑ-Η2的获取方法。
[0018]1) β -淀粉酶基因ctba的克隆
[0019]以热硫梭菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfuri genes,美国典型培养物保藏中心编号为ATCC33743)染色体DNA作为模板，以SEQ ID NO: 2为上游引物(含有一个NcoI酶切位点)和以SEQ ID NO:3 (含有一个Bam HI酶切位点，并引入一个6x组氨酸标签编码序列)为下游引物，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增β -淀粉酶的成熟肽编码区域，对应于ctba基因中660-2219片段，所得目的产物长度为1605bp ;将目的产物和pSE380载体质粒分别用Nco I和Bam HI酶双酶切，胶回收后，用T4DNA连接酶进行连接，并转化入大肠杆菌(E.coli) XLl-Blue感受态细胞；挑选转化子进行酶切验证和DNA测序分析，验证连接正确的转化子即为β -淀粉酶基因重组表达载体，命名为PSBA。
[0020]2) β-淀粉酶突变体ΤΒΑ-Η2基因的获取
[0021]以pSBA质粒DNA为模板，分别以SEQ ID N0:4和SEQ ID NO: 5为上、下游引物，构建PCR反应体系。25yL PCR反应体系的构建如下:1 μ L pSA7D质粒DNA，0.5 μ L上游引物 Amy7_S (浓度为 IOm mol/L), 0.5 μ L 下游引物 Amy7_A (浓度为 IOm mol/L), 2 μ L dNTPs(每样 dNTP2.5mmol/L),5y L5x PrimerSTAR8 buffer, 0.25 μ L (2.5U/ μ L) PrimerSTARi DNA聚合酶，加入16.75 μ L ddH20补足至25 μ L。体系混匀后置于PCR以上执行扩增反应。PCR扩增条件均为:第一步:95°C 3min ;第二步:98°C 10s, 68°C 6min，如此循环30次；第三步:720C IOmin0 PCR产物经Dpn 1(购自加拿大Fermentas公司)37°C消化2h，消化产物于80°C失活20min后，直接转化E.coli XLl-Blue感受态细胞，转化产物在含有100μ g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上培养过夜，挑取单菌落接种于含100 μ g/mL氨苄青霉素抗性的液体LB培养液中培养，提取质粒委托上海生工测序验证。验证正确的质粒即为将淀粉酶176位Tyr突变为His的重组表达质粒，标记为pSBA_Hl。以重组质粒pSBA_Hl为模板，以SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7为上、下游引物，采用与上述pSBA_Hl构建相同的策略构建含有β -淀粉酶突变体ΤΒΑ-Η2基因的重组质粒，经测序验证正确后，标记为pSBA-H2。
[0022]3) β -淀粉酶突变体ΤΒΑ-Η2的纯化和表征
[0023]挑取含有重组表达质粒pSBA-H2的大肠杆菌工程菌单菌落，接种于5ml含有100 μ g/ml氨节青霉素的LB培养液(酵母膏10g/L,蛋白胨5g/L,氯化钠10g/L,天然pH),于37°C、220r/min条件下培养过夜。将过夜培养之菌液，按照1%的接种量转接于500ml含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养液中。待菌液培养至0D_为0.6左右，加入终浓度为lmmol/L的IPTG诱导剂，同样条件下继续诱导培养16h ;于9000r/min、4°C离心收集诱导表达的工程菌，沉淀用0.05mol/L醋酸酸缓冲液(pH6.0)洗涤一次后，重悬于100mL同样的缓冲液中，菌悬液通过高压细胞破碎机JN-10HC (广州聚能生物科技有限责任公司)破胞，流速10L/H，4°C，压力为150MPa，破胞液于12000r/min4°C下离心30min，上清液为粗酶液；采用金属螯合层析的方法纯化重组酶TBA-H2，首先，粗酶液上清液加入终浓度为300mmol/L的NaCl和5mmol/L的咪唑，用0.22 μ m滤膜过滤所得透过液直接用TALON":金属亲和树脂纯化重组酶。纯化所得酶液，通过分子截留量为IOKDa的Millipore超滤管,反复换洗缓冲液两次，以除去盐分及咪唑成份。纯化蛋白的纯度和均一性通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测，蛋白的含量通过Bradford法，以BSA为标准蛋白进行检测。检测结果如图1所示，可见得到了电泳纯的条带；
[0024]取10 μ I适当稀释的ΤΒΑ-Η2纯化酶液加入390 μ I溶解于0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲溶液中的1%可溶性淀粉(质量百分比)，于60°C水浴中反应30!1^11，然后加入40(^1DNS 试剂(蒸馏水:372.63ml, DNS:2.79g, Na0H:5.21g,酒石酸钾钠:80.53g,苯酚:2.00ml，亚硫酸氢钠:2.18g),于沸水浴煮沸5min,冷却至室温,采用分光光度法测定OD54c!值,通过麦芽糖标准曲线确定酶活。最适温度的测定通过将上述400 μ I反应体系分别置于45-85°C区间范围内测定酶活，用相对酶活的最大值对应的温度表示。最适pH值通过测定pH2.5-7.5范围内的相对酶活,用最大相对酶活对应的pH值表示。采用双倒数法,在最适PH和最适温度条件下对酶进行酶学参数测定。表征结果表明，TBA-H2的最适pH为4.0，最适温度为60°C。每单位(U)酶活定义为:pH4.0，60°C条件下每分钟转化生成I μ mo I麦芽糖的酶量。将突变体β -淀粉酶突变体ΤΒΑ-Η2和突变前的亲本酶的酶活随pH变化图谱进行比较发现，TBA-H2将最适pH降低了 2个单位。
[0025]实施例2
[0026]本实施例说明突变体酶TBA-H2在水解淀粉质原料生产高纯麦芽糖浆中的应用
[0027]取Ig马铃薯可溶性淀粉加入0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲溶液中调制为1% (质量百分比)的淀粉浆，按照1.2mg酶/g干物质淀粉的量加入纯化的酶液，然后置于60°C水浴中温浴24h，于100°C水浴热处理IOmin后，12000r/min离心5min，上清液通过0.22 μ m滤膜过滤，取20 μ L过滤液通 过氨基柱对酶解产物进行高效液相色谱(HPLC)检测。氨基柱的检测条件为RI温度为50°C，流速为lmL/min，流动相为乙腈:水(70:30)。氨基柱检测结果如图3所示。从中可以看出，在酸性条件下，TBA-H2水解可溶性淀粉产物只有麦芽糖的生成，酶解24h的转化率为66%。
【权利要求】
1.一种耐酸性高温β-淀粉酶的突变体TBA-H2，其特征在于:其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1 所示。
2.一种宿主细胞，其特征在于:它是含有权利要求1所述β -淀粉酶突变体的原核细胞或真核细胞。
3.权利要求1所述的耐酸性高温β-淀粉酶的突变体ΤΒΑ-Η2在淀粉降解和含淀粉材料的处理中的应用， 尤其是用于生产高纯麦芽糖浆的应用。
【文档编号】C12P19/22GK103881993SQ201410094145
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】梁莲华, 王成华, 蒙健宗, 李晓明, 韦航 申请人:南宁邦尔克生物技术有限责任公司