一种高产l-丙氨酸且耐受自来水的菌株及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产L-丙氨酸且耐受自来水的菌株及其构建方法。本发明提供了一种构建重组菌的方法，为突变出发菌中的lon基因和clpA基因，得到重组菌；所述突变出发菌中的lon基因为将所述出发菌中的lon基因核苷酸序列自5’末端第1310位的C突变为A；所述突变出发菌中的clpA基因为将所述出发菌中的clpA基因核苷酸序列自5’末端第1895位的T突变为G。本发明的实验证明，本发明通过将大肠杆菌工程菌XZ-A26中的lon基因和clpA基因进行突变，得到的重组菌XZ-A47，不仅能够提高L-丙氨酸产量，而且还可以在自来水配置的发酵培养基中高产L-丙氨酸，采用自来水配置可以节约成本。
【专利说明】一种高产L-丙氨酸且耐受自来水的菌株及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种高产L-丙氨酸且耐受自来水的菌株及其构建方法。
【背景技术】
[0002]L-丙氨酸作为人体非必需氨基酸，在生物体内由甘氨酸的氨基转移至丙酮酸而成。L-丙氨酸是一种白色结晶或结晶性粉末，带有甜味，易溶于水，在食品及医药工业领域具有广泛的用途。在食品工业领域，L-丙氨酸可提高食品的营养价值，加入L-丙氨酸后能够明显提高食品及饮料中蛋白质利用率。L-丙氨酸能够改善人工合成甜味剂的味感，使其如同天然甜味剂。另外，L-丙氨酸还能够改善有机酸的酸味，使其更接近自然味道。在医药领域，L-丙氨酸常被用作氨基酸类营养药，同时L-丙氨酸也是制造维生素B6、合成泛酸钙和其他有机化合物的重要原料。
[0003]目前，L-丙氨酸的生产方法主要有化学合成法和生物合成法。其中化学合成法主要有丙酸氯化氨化法、α -溴丙酸氯化法和氰醇法。这些方法都需要石油基原材料，如丙酸、α-溴丙酸、乙醛和氢氰酸等，因此成本受困于原油价格。随着石油价格的提升，成本会越来越高。另外，这些方法都是经过复杂的化学催化完成的，污染重，分离提取成本高，不适合可持续发展的需要。
[0004]生物法生产L-丙氨酸目前主要是以L-天冬氨酸为原料，在天冬氨酸-β -脱羧酶的催化下进行脱羧反应生产L-丙氨酸。该方法是目前国内L-丙氨酸生产厂家主要使用的生产技术。但是由于该方法中的原材料天冬氨酸的生产是以顺酐为原料的，因此L-丙氨酸的生产成本依旧依赖于石油价格。随着石油资源的匮乏和价格的提升，顺酐资源的紧张和价格上涨将导致天冬氨酸的供给存在巨大的隐患，从而会影响到L-丙氨酸的生产及成本。
[0005]随着合成生物学和代谢工程的发展，近年来使用微生物发酵法生产L-丙氨酸的研究越来越受到重视。微生物发酵法能够实现以葡萄糖等糖类为原料生产L-丙氨酸。葡萄糖属于可再生的生物质资源，可以通过广泛存在于自然界中的木质纤维素降解获得。因此，使用其作为原材料，能够使L-丙氨酸的生产成本保持在稳定的水平，具有长远的经济优势。目前，已经有多株能够生产L-丙氨酸的菌株的报道。Smith等构建了一株Ε.coliALS929 (PTrc99A-alaD)菌株，其中在质粒中表达的丙氨酸脱氢酶AlaD能够将胞内生成的丙酮酸转化为L-丙氨酸，该菌株经过48小时发酵后，能够生产88g/L的L-丙氨酸。Lee等构建了一株E.coli ALA887 (pTrc99A-alaD)菌株，发酵生产时能够在27小时内生产32g/L的L-丙氨酸。在这些菌株中，丙氨酸脱氢酶是生产L-丙氨酸的关键步骤，在报道的菌株中，编码该蛋白的基因一般是通过高拷贝质粒进行表达的。在进行菌株培养基发酵过程中，需要添加抗生素来维持质粒的稳定遗传。这些因素将导致发酵过程工艺复杂并提高L-丙氨酸生产的成本。因此，随着合成生物学和代谢工程的发展，构建遗传稳定的L-丙氨酸生产菌株并经过微生物发酵法生产L-丙氨酸将是未来的发展趋势。[0006]目前菌株发酵生产L-丙氨酸使用的都是由蒸馏水配置的培养基，蒸馏水在工业生产中提高了生产的成本。开发能够直接使用自来水配置的培养基进行发酵生产L-丙氨酸的菌株并用于生产，将极大的降低L-丙氨酸的生产成本。但是相对于蒸馏水，自来水中存在大量的离子并且浓度较高。为了获得能够直接使用自来水配置的培养基进行发酵的菌株，需要提高菌株对高离子浓度的耐受力。
【发明内容】
[0007]本发 明的一个目的是提供构建重组菌A的方法。
[0008]本发明提供的构建重组菌A (XZ-A43)的方法，包括如下步骤:将出发菌染色体上的1n蛋白编码基因替换为1n*蛋白的编码基因，得到的重组菌A ;
[0009]所述1n*蛋白的氨基酸序列为将所述1n蛋白氨基酸序列的第437位丙氨酸A突变为天冬氨酸D。
[0010]上述方法中，所述1n*蛋白为由序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸编码的蛋白。
[0011]上述方法中，所述1n*蛋白编码基因为将所述1n蛋白编码基因核苷酸序列第1310位的碱基为C突变为A得到的基因。
[0012]上述方法中，所述1n*蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸；
[0013]所述将出发菌染色体上的1n蛋白编码基因替换为1n*蛋白编码基因具体为将含有所述1n*蛋白编码基因的DNA片段II同源重组到所述出发菌中；
[0014]所述DNA片段II的核苷酸序列尤其具体为序列表中序列2。
[0015]上述方法中，所述出发菌为通过将嗜热脂肪地芽孢杆菌染色体上的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处，再依次敲除所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在发酵罐中连续传代培养而得的基因工程菌；
[0016]所述出发菌具体为大肠杆菌XZ-A26CGMCC N0.4036?
[0017]上述同源重组具体通过两步进行:
[0018]1)将DNA片段I导入带有pKD46的大肠杆菌工程菌株XZ-A26中，进行第一次同源重组，得到中间菌XZ-A42 ；
[0019]2)将DNA片段II导入所述中间菌XZ-A42中，进行第二次同源重组，得到重组菌XZ-A43 (重组菌 A)。
[0020]由上述的方法制备的重组菌A也是本发明保护的范围。
[0021]本发明的另一个目的是提供一种构建重组菌B (XZ-A47)的方法。
[0022]本发明提供的构建重组菌B的方法，包括如下步骤:将上述的出发菌染色体上的1n编码蛋白基因替换为1n*蛋白的编码基因，且将所述出发菌染色体上的clpA蛋白编码基因突变为clpA*蛋白的编码基因，得到的重组菌B ;
[0023]所述1n*蛋白的氨基酸序列为将所述1n蛋白氨基酸序列的第437位丙氨酸A突变为天冬氨酸D ；
[0024]所述clpA*蛋白的氨基酸序列为将所述clpA蛋白氨基酸序列的第632位异亮氨酸I突变为丝氨酸S。[0025]上述方法中，所述clpA*蛋白为由序列表中序列4自5’末端第1-2272位核苷酸编码的蛋白。
[0026]上述方法包括如下步骤:先所述出发菌染色体上的1n编码蛋白基因替换为1n*蛋白的编码基因，得到重组菌A，再将所述重组菌A染色体上的clpA蛋白编码基因替换为clpA*蛋白的编码基因，得到的重组菌B;上述方法中，所述1n*蛋白编码基因为将所述1n蛋白编码基因核苷酸序列第1310位的碱基为C突变为A得到的基因；
[0027]所述clpA*蛋白编码基因为将所述clpA蛋白编码基因核苷酸序列第1895位的碱基为T突变为G得到的基因；
[0028]所述1n*蛋白编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸；
[0029]所述clpA*蛋白编码基因的核昔酸序列具体为序列表中序列2自5’末端第1-2272位核苷酸；
[0030]上述方法包括如下步骤:
[0031]所述将出发菌染色体上的1n编码蛋白基因替换为1n*蛋白的编码基因为将含有所述1n*蛋白编码基因的DNA片段III同源重组到所述出发菌中；
[0032]所述将所述中间菌染色体上的ClpA蛋白编码基因替换为clpA*蛋白的编码基因为将含有所述clpA*蛋白编码基因的DNA片段IV同源重组到所述重组菌A中；
[0033]所述DNA片段III的核苷酸序列具体为序列表中序列3 ；
[0034]所述DNA片段IV的核苷酸序列具体为序列表中序列4。
[0035]上述方法具体通过两步同源重组进行:
[0036]I)将DNA片段III导入带有PKD46的大肠杆菌工程菌株XZ-A43中，进行第一次同源重组，得到中间菌XZ-A46 ；
[0037]2)将DNA片段IV导入所述中间菌XZ-A46中，进行第二次同源重组，得到重组菌XZ-A47 (重组菌 B)。
[0038]由上述的方法制备的重组菌B也是本发明保护的范围。
[0039]上述的重组菌A或上述的重组菌B在产生和/或提高L-丙氨酸中的应用也是本发明保护的范围；
[0040]所述产生和/或提高L-丙氨酸具体为将所述重组菌A或所述重组菌B在自来水作为溶剂配制的发酵培养基中发酵生成。
[0041]或一种产生L-丙氨酸的方法，包括如下步骤:在自来水作为溶剂配制的发酵培养基中发酵重组菌A或所述重组菌B，收集发酵产物，即得到L-丙氨酸。
[0042]本发明的实验证明，本发明构建了两种重组菌，一种为将大肠杆菌工程菌XZ-A26中的1n基因进行突变，得到的重组菌XZ-A43，另一种为将大肠杆菌工程菌XZ-A26中的1n基因和clpA基因进行突变，得到的重组菌XZ-A47 ;这两种重组菌不仅能够提高L-丙氨酸产量，而且还可以在自来水配置的发酵培养基中高产L-丙氨酸，采用自来水配置可以节约成本。
【具体实施方式】
[0043]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0044]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045]大肠杆菌工程菌XZ-A26CGMCC N0.4036，于2010年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为CGMCC N0.4036，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。该菌株能够在无机盐培养基中发酵生产L-丙氨酸。
[0046]下述实施例中的自来水取自首创自来水公司山海关分公司(硬度:2-3mmol/L、ρΗ=6.5-7.5、电导率:400-600 μ s/cm、氯化物 100_250mg/L、硫酸盐 100_250mg/L)。
[0047]下述实施例中的蒸馏水(硬度O、ρΗ=7.0-8.0、电导率:5μ s/cm)
[0048]实施例1、用自来水配置的培养基筛选产L-丙氨酸且耐自来水菌株
[0049]1、对比蒸馏水和自来水配置的培养基对大肠杆菌工程菌XZ-A26发酵生产L-丙氨酸的影响
[0050]大肠杆菌工程菌XZ-A26CGMCC N0.4036 (具体特征见表1)，能够在蒸馏水配置的无机盐培养基中发酵葡萄糖生产L-丙氨酸。然而，由于工业发酵中使用蒸馏水成本太高，因此希望能直接使用自来水配置培养基。
[0051]因此，对比了蒸馏水和自来水配置的培养基对大肠杆菌工程菌XZ-A26发酵生产L-丙氨酸的影响。
[0052]表1生产L-丙氨酸的重组大肠杆菌
【权利要求】
1.一种构建重组菌A的方法，包括如下步骤:将出发菌染色体上的1n蛋白编码基因替换为1n*蛋白的编码基因，得到的重组菌A ; 所述1n*蛋白的氨基酸序列为将所述1n蛋白氨基酸序列的第437位丙氨酸A突变为天冬氨酸D。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: 所述1n*蛋白编码基因为将所述1n蛋白编码基因核苷酸序列第1310位的碱基为C突变为A得到的基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于: 所述1n*蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸； 所述将出发菌染色体上的1n蛋白编码基因替换为1n*蛋白编码基因具体为将含有所述1n*蛋白编码基因的DNA片段II同源重组到所述出发菌中； 所述DNA片段II的核苷酸序列尤其具体为序列表中序列2。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述出发菌为通过将嗜热脂肪地芽孢杆菌染色体上的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处，再依次敲除所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在发酵罐中连续传代培养而得的基因工程菌； 所述出发菌具体为大肠杆菌XZ-A26CGMCC N0.4036。
5.由权利要求1-4中任一所述的方法制备的重组菌A。
6.—种构建重组菌B的方法，包括如下步骤:将权利要求1-4中任一所述的方法中所述的出发菌染色体上的1n编码蛋白基因替换为1n*蛋白的编码基因，且将所述出发菌染色体上的clpA蛋白编码基因替换为clpA*蛋白的编码基因，得到的重组菌B ； 所述1n*蛋白的氨基酸序列为将所述1n蛋白氨基酸序列的第437位丙氨酸A突变为天冬氨酸D ; 所述clpA*蛋白的氨基酸序列为将所述clpA蛋白氨基酸序列的第632位异亮氨酸I突变为丝氨酸S。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述方法包括如下步骤:先所述出发菌染色体上的1n编码蛋白基因替换为1n*蛋白的编码基因，得到重组菌A，再将所述重组菌A染色体上的clpA蛋白编码基因替换为clpA*蛋白的编码基因，得到的重组菌B ； 所述1n*蛋白编码基因为将所述1n蛋白编码基因核苷酸序列第1310位的碱基为C突变为A得到的基因； 所述clpA*蛋白编码基因为将所述clpA蛋白编码基因核苷酸序列第1895位的碱基为T突变为G得到的基因； 所述1n*蛋白编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸； 所述clpA*蛋白编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列2自5’末端第1-2272位核苷酸。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述方法包括如下步骤:所述将出发菌染色体上的1n编码蛋白基因替换为1n*蛋白的编码基因为将含有所述1n*蛋白编码基因的DNA片段III同源重组到所述出发菌中； 所述将所述中间菌染色体上的clpA蛋白编码基因替换为clpA*蛋白的编码基因为将含有所述clpA*蛋白编码基因的DNA片段IV同源重组到所述重组菌A中； 所述DNA片段III的核苷酸序列具体为序列表中序列3 ； 所述DNA片段IV的核苷酸序列具体为序列表中序列4。
9.由权利要求6-8中任一所述的方法制备的重组菌B。
10.权利要求5所述的重组菌A或权利要求6所述的重组菌B在产生和/或提高L-丙氨酸中的应用； 所述产生和/或提高L-丙氨酸具体为将所述重组菌A或所述重组菌B在自来水作为溶剂配制的发酵培养基中发酵生成。 或一种产生L-丙氨酸的方法，包括如下步骤:在自来水作为溶剂配制的发酵培养基中发酵重组菌A或所 述重组菌B，收集发酵产物，即得到L-丙氨酸。
【文档编号】C12N15/09GK103898089SQ201410140630
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】张学礼, 郭恒华, 张冬竹 申请人:安徽华恒生物科技股份有限公司