一种腈水解酶基因及其原核表达和固定化技术的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种腈水解酶基因及其原核表达和固定化技术，属于化工酶的原核表达及固定化【技术领域】。本发明利用PCR技术，以热纤梭菌的基因组为模板克隆到腈水解酶基因，通过大肠杆菌表达系统对该酶进行原核表达，得到含有该腈水解酶基因的重组质粒pET-28a-nit，转化到大肠杆菌BL21获得重组菌BL21(pET-28a-nit)，诱导重组菌表达获得重组腈水解酶；该腈水解酶基因与连接有孢子外衣壳蛋白基因cotG的高拷贝穿梭质粒连接，构建成用于表面展示的重组质粒pHS-cotG-nit，该质粒转入枯草芽孢杆菌菌株DB403获得重组菌DB403(pHS-cotG-nit)，诱导重组菌产生的重组芽孢表面展示有该腈水解酶。本发明首次通过孢子表面展示技术对腈水解酶进行固定化，该方法不仅可以使酶的结构更稳定，而且利于酶在催化后的回收再利用，只需要离心就可以把展示有腈水解酶的孢子回收再利用。
【专利说明】一种腈水解酶基因及其原核表达和固定化技术
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种腈水解酶基因及其原核表达和固定化技术，属于化工酶的原核表达及固定化【技术领域】。
【背景技术】
[0002]腈水解酶是一类可以把腈物质水解为相应的羧酸和氨的酶。腈物质(R-CN)是指含有有机基团-CN的有机物。
[0003]腈物质是一类重要的化合物，在化工生产中常常作为中间体被广泛应用。自然界中的许多高等植物和微生物体内含有腈物质，现在已经报道的腈物质超过2000种，其中大部分是人工合成的(徐建妙，郑裕国，沈寅初。腈水解酶的来源、结构、作用机制及其应用。微生物学通报，2005，32 (5):141-146)。常用的腈合成方法为，在水或者与水化学性质类似的溶液中，通过氰化钾和卤代烷发生亲和取代反应合成。在有机合成中，常常需要引入羧基或其衍生基团，由于腈基相对于这些基团更易引入分子中，常常先引入腈基，在进一步的转化成羧基或其衍生基团，因此腈物质是有机合成中一类重要的中间体。腈基转化为羧基的传统方法为化学法，但反应条件苛刻，常常需要高温、高压、强酸、强碱等条件，而且反应伴随着大量的盐类副产物，给后续的提纯带来了困难，且该种方法会造成环境污染，因此，该种方法在工业上 的应用受到了大大的限制(Mylerovd V, Martinkova L.Syntheticapplications of nitriIe-converting enzymes[J].Current Organic Chemistry,2003，7(13): 1279-1295)。而用腈水解酶催化腈物质转化为羧酸的生物方法，相对于传统的化学法不仅具有高效性、专一性、反应条件温和，环境代价小，最重要的是具有立体选择性、区域选择性、化学选择性这些化学方法无法比拟的优点(王宁，许铟，陆大军.生物酶在腈纶及涤纶改性中的应用[J].合成纤维工业，2003，26(4): 35-37.;张金文，熊春蓉，李静雯，等.臭鼻杆菌腈水解酶基因(bxn)的克隆及其在原核生物中的表达[J].草业学报，2006，15(6): 87-92.)。
[0004]腈水解酶在降解腈类农药方面也具有广泛的应用。有一类普遍应用的除草剂的主要成分为溴苯腈、碘苯腈或氯苯经，它们被喷洒到植物的叶片后被迅速吸收，然后通过抑制植物的光合作用使植物枯萎坏死。但是这些腈类物质是有毒的，而且在自然界被降解的周期比较长，所以能不能找到一个有效的降解残留的除草剂的方法，成为其能不能被推广应用的关键。把腈水解酶基因导入经济植物内，培育具有降解腈类物质的抗除草剂作物成了一个理性的解决方法。Striker等从土壤里筛选到一株可以把溴苯腈降解成3，5_ 二溴-4-羟基苯甲腈的细菌K.0zaenae,从该细菌基因组里获得了腈水解酶基因，该基因被导入棉花获得了抗溴苯腈的转基因棉花。
[0005]腈水解酶在腈纶类织物性状改良方面有广泛的应用。腈纶主要是由丙烯腈单体聚合而成的高分子化合物，由于其末端为疏水基团，造成手感不好且不易染色，通过腈水解酶处理腈纶，在其的外部引入亲水基团，同时不破坏其内部分子键从而不影响其机械强度。东华大学王平等，通过培养红球菌产生腈水解酶和腈水合酶，以酶液处理腈纶织物，能够部分的转化腈纶纤维中的-CN为-COOH和-C0NH2，酶改性后，织物的回潮率、阳离子染料和酸性染料的可染性都得到了提高，静电半衰期减小。
[0006]最早发现腈水解酶的为哈佛大学的Thimann和Mahadevan,他们1964年从大麦叶片中分离出一种能把吲哚乙腈水解为吲哚乙酸的酶，并命名为吲哚乙腈水解酶。深入的研究发现该酶可以把另外26种腈物质转化成相应的羧酸，而且在水解各种腈物质时表现出不同的活性，因此，Thimann和Mahadevan命名该种酶为腈水解酶。
[0007]现在已经有很多腈水解酶被发现，但是总体来说酶活都不是太高，稳定性不是太高，而且很难回收再利用，这就大大的限制了其工业化的应用。所以从自然界筛选高活性的腈水解酶成为当务之急。经检索，国内外还没有关于热纤梭菌基因组上腈水解酶原核表达的报道。
[0008]枯草芽孢杆菌孢子表面展示技术为解决游离酶和营养细胞催化中存在的问题提供了一种新的解决思路。[0009]枯草芽孢杆菌的孢子展示外源蛋白是最近十几年新兴起的一门技术，孢子为内生，不需要要穿过细胞膜，而且胞内有一套完整的分子伴侣体系，在芽孢形成的时候可以帮助连接在衣壳蛋白上的外源蛋白正确的折叠。而且孢子具有独特的抗逆性，它可以抵抗高温、强酸、强碱、辐射等不良环境的影响而长时间存活。已经报道的常用来作为孢子表面展示的载体蛋白有CotB，CotC和CotG。
[0010]枯草芽孢杆菌孢子表面展示技术已经在很多方面被广泛应用。
[0011]该技术最先被应用来制作口服疫苗，Rachele isticato等最先以CotB为载体蛋白把破伤风毒素碳末端(TTFC)的459个氨基酸片段展示在枯草芽孢杆菌孢子表面。以CotB-TTFC重组芽孢喂食小鼠或鼻腔注射后，可在小鼠血清内检验到抗TTFC IgG。
[0012]最近几年把酶展示在孢子表面，从而对酶进行固定化成为研究的热点。对于一些化工酶，如何在催化反应后进行回收再利用成为一个难题，而把酶固定在孢子表面后，不仅可以增加酶的稳定性，还可以通过离心回收孢子而对酶进行回收再利用，国内迄今为止还没有关于从孢子表面展示技术固定化工酶的报道，倒是有几例通过该技术队酶进行固定化的报道。Kwon S J等以CotG为蛋白载体把具有活性的大肠杆菌β-半乳糖苷酶展示在孢子表面，大肠杆菌半乳糖苷酶为大分子量的酶，每个亚基的分子量为116kDa，而且只有在四聚体的时候才具有活性。从而证明该孢子表面展示系统也适用于多亚基的大分子量酶。王楠等证明CotC也可以用来展示具有活性的酶，家蚕乙醇脱氢酶连接在CotC碳端，获得展示在孢子上的融合蛋白CotC-BmADH，且具有很高的活性。(Due L
H,Hong H A, Fairweather N, et al.Bacterial spores as vaccine vehicles[J].1nfection and immunity, 2003, 71(5): 2810-2818.；Kwon S J, Jung H C, Pan JG.；TransgalactosyIation in a water-solvent biphasic reaction system withβ-galactosidase displayed on the surfaces of Bacillus subtiIis spores[J].Applied and environmental microbiology, 2007, 73(7): 2251-2256.；ffang N,Chang C, Yao Q, et al.Display of Bombyx mori alcohol dehydrogenases on theBacillus subtiIis spore surface to enhance enzymatic activity under adverseconditions [J].PloS one, 2011, 6(6): e21454.)
为了克服热纤梭菌腈水解酶在游离状态下催化底物时活性不稳定、不易回收再利用等问题。把其展示在孢子的表面，对其进行固定化，再以孢子催化底物，反应结束后可以通过离心把孢子和反应物分离开，回收的孢子还可以再次利用。
【发明内容】
[0013]本发明的主要内容是提供一种克隆自热纤梭菌的腈水解酶基因、含有该基因的重组质粒、含有该重组质粒的可以表达腈水解酶的重组大肠杆菌、原核表达获得的重组酶在催化腈类物质中的应用、还提供一种通过把腈水解酶展示在枯草芽孢杆菌孢子表面从而对其进行固定化的方法。
[0014]本发明的具体的技术方案为:
(1)一种腈水解酶基因，具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0015]该腈水解酶基因由如下方法得到:利用PCR技术，在以下引物对的作用下，引物Pnit-upl:(CGCGGATCCATGAGAGCTGCATTATACCA)下划线部分为限制性酶切位点 Bam HI，下游引物Pnit-down2: (CCGCTCGAGTTAAAATAAAGTTTTATAAAGC)下划线部分为限制性酶切位点Xho I，以NCBI检索到的热纤梭菌基因组DNA为模板克隆到长约770 bp的腈水解酶基因片段。具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。其翻译生成的氨基酸序列跟十种已经被证明具有酶活的腈水解酶的氨基酸序列进行比对，发现具有很大的相似性，与来自Rhodococcusrhodochrous的腈水解酶的氨基酸相似度达到56%,与来自Nicotiana tabacum的腈水解酶的氨基酸相似度达到62%。在遗传学上进一步确定其为腈水解酶基因，而且具有活性的可能性很大。该腈水解酶基因核苷酸序列为:
【权利要求】
1.一种腈水解酶基因，具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的腈水解酶基因，其特征在于，所述腈水解酶基因编码SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的腈水解酶基因，其特征在于，所述腈水解酶基因源自热纤梭菌{Clostridium thermoceUum)。
4.一种含有权利要求1所述腈水解酶基因的重组质粒pET-28a-/?ii。
5.一种含有权利要求4所述重组质粒pET-28a-/?ii转化得到的重组菌BL21(pET_28a-/?ii )。
6.根据权利要求1所述的腈水解酶在制备重组腈水解酶中的应用。
7.根据权利要求6所述的腈水解酶基因在制备重组腈水解酶中的应用，其特征在于，所述的应用为:构建含有所述腈水解酶基因的重组质粒，将所述重组质粒转化至大肠杆菌中，获得重组菌进行诱导培养，超声破碎诱导表达后的重组菌，离心分离沉淀和上清，通过SDS-PAGE检验上清和沉淀，发现过表达的重组腈水解酶全部在上清里，通过N1-NTA对上清内的腈水解酶进行纯化。
8.根据权利要求7所述的腈水解酶基因在制备重组腈水解酶中的应用，其特征在于，纯化后的腈水解酶用于催化3-氰基吡啶生成烟酸，该腈水解酶在pH 7.4,45 1:时催化活性最闻O
9.一种通过把腈水解酶展示在枯草芽孢杆菌孢子表面从而对其进行固定化的方法，其特征在于，按照以下步骤进行: A.用于孢子表面展示的重组质粒的构建: 以pLJ为模板进行PCR扩增获得一条不含有乳糖诱导调控序列Pglv-1nframe的质粒骨架片段，且在扩增时在片段的两端同时引入&0 RI酶切位点，对片段进行酶切后会在两端产生两个相同的粘性末端，在T4 DNA连接酶的作用下进行自环化，该质粒即为pHS ;再在PHS的多克隆位点Zffl3 I和分e I之间插入芽孢外衣壳蛋白Co招基因，在分e 1和油<3 I之间插入腈水解酶基因，得到孢子表面展示载体pHS-coz^-flit ； B.重组质粒转入DB403构建重组菌DB403^WS-cotG-nit): 把重组质粒pHSWdii转化进入菌株DB403，经过筛选获得重组枯草芽孢杆菌DB403 (.v^-cotG-nit)； C.重组芽孢的形成:把重组菌在DSM培养基里耗竭法培养48小时，诱导芽孢形成。
10.根据权利要求9所述的一种通过把腈水解酶展示在枯草芽孢杆菌孢子表面从而对其进行固定化的方法，其特征在于，所得表面展示有腈水解酶的孢子悬液作为孢子催化剂催化3-氰基吡啶，该重组孢子悬液在pH 7.4、45 1:时其活性最高。
【文档编号】C12N15/70GK103937821SQ201410162214
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】陈华友, 孙腾云, 田瑞, 倪忠, 陈洪章, 陈志 , 张天喜, 郭齐 申请人:江苏大学