一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法，通过向贴壁培养的鼠胚胎干细胞团状克隆中加入含有dorsomorphin与noggin、SB431542和CHIR99021的诱导培养基，诱导鼠胚胎干细胞细胞形成玫瑰花状神经球；随后加入含有bFGF的第二阶段诱导培养基悬浮培养形成悬浮的神经球；最后将神经球消化成单细胞，然后用第三阶段诱导培养基贴壁培养形成具有较长期的自我增殖与更新的神经上皮细胞。本发明摒弃了传统的形成EB方法，缩短了分化时间，而且分化的效率达到了95％以上。本发明可快速诱导NE细胞替代NSC细胞功能治疗中枢系统损伤，具有很高的临床应用性。
【专利说明】一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞 的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，具体涉及一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为 神经上皮细胞的组合物，尤其是利用该组合物快速直接定向的诱导鼠胚胎干细胞分化为神 经上皮细胞的方法，以及进一步将神经上皮细胞定向诱导分化成神经元细胞或神经胶质细 胞的方法。
【背景技术】
[0002] 神经干细胞（neural stem cell,NSCs)是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母 细胞，存在于成体脑组织中的一种干细胞。主要分布在脑室管膜，室下区，纹状体，海马齿状 回等区域，是成年神经系统中可以自我更新和分化为多种神经类细胞的一种多能细胞，其 可分化为多种神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞等。神经干细胞的发现，给中枢神经系 统损伤和其他大脑退行性疾病的治疗带来了希望。NSCs作为一种全新的生物学治疗方法， 随着分离培养、体外扩增等技术的日臻完善，NSCs在中枢神经损伤修复中具有潜在的应用 价值，其应用主要集中以下几方面：一是直接细胞移植进行替代治疗，神经干细胞作为细胞 移植的来源，可以通过神经干细胞的体外移植或体内神经干细胞的激活，分化为神经元和 胶质细胞，与已经存在的细胞结构整合到一起；二是以NSCs作为基因载体，携带治疗作用 的报告基因进行移植，从而达到细胞替代和基因治疗的双重作用；三是通过对生长因子和 细胞因子的研究，诱导自身的NSCs分化进行神经自我修复。由于神经干细胞是从大脑组织 中提取出来的成体干细胞，来源非常有限，目前在临床应用的可能几乎为零。因此，急需一 个替代物来取代其治疗价值。
[0003] 小鼠胚胎干细胞于1981年首次由Evans和Kaufman成功分离建系，它们来源于胚 泡的内细胞团（inner cell mass, ICM)，这些细胞具有稳定的二倍体核型，在体外可以分化 为三个胚层的多种细胞。将小鼠胚胎干细胞重新植入胚泡可以参与形成胚胎。体外ES细 胞维持未分化状态依赖于一些细胞因子的存在，如白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF)。撤去这种自我更新的刺激信号后，ES细胞很快分化为多种细胞。这些属性 使ES细胞成为非常有用的发育生物学和功能基因组学研究的生物系统。
[0004] 神经上皮细胞是一种干细胞，可细胞分裂产生两个完全相同的细胞。而后， 子细胞会经由不对称的细胞分裂，产生一个与亲代相同的细胞及另一个非干细胞的先 驱细胞或神经元。文献（Billon N，Jolicoeur C，Ying QL，et al.，Journal of Cell Science，2002, 115)公开了一种诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法，然而这 种利用EB自然分化产生的神经上皮细胞，分化比例非常低，而且是瞬时产生的不具有较长 期的自我增殖与更新的能力，无法做为细胞产物长期体外培养，冻存与利用。
[0005]文献（Falk A, Koch P, Kesavan J, et al. PL0S One, 2012, 7)公开了一种诱导人胚 胎干细胞分化为可以较长时间进行自我增殖与自我更新的神经上皮细胞的方法，但是其是 通过自然分化的方法同时加入生长因子EGF和bFGF，诱导时长达30天以上，其利用价值大 大降低。也有研究者通过加入SMAD信号通路的两种抑制剂Noggin与SB431542,诱导人胚 胎干细胞分化为神经干细胞，但其诱导效率较低，且耗时较久（Chambers，S. M.，et al.，Nat Biotechnol, 2009. 27, 3)〇
[0006] 小鼠和人的ES细胞有较大差异： 1. 二者的形态不同：小鼠ES细胞形成多层鸟巢状的集落，难以分清单个细胞，人 ES细胞形成相对扁平的单层细胞集落，单个细胞密集排列，可见清晰的核仁（Buecker C, Geijsen N, Cell Stem Cell, 2010, 7)； 2. 二者维持未分化的机制不同（Hanna J,Markoulaki S,Mitalipova M,et al, Cell Stem Cell, 2009, 4)； 3. 二者表达的分子标志有所不同（Takahashi and Yamanaka, Cell, 2006, 126 ; Takahashi K,Yamanaka S, Cell, 2007, 131)。因此在实际中，小鼠和人的ES细胞研究工作 是各自相对独立的研究体系。
[0007]目前尚无一种方法可以快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为具有自我更新与 增殖能力的神经上皮细胞。
【发明内容】
[0008]目前还没有关于从小鼠胚胎干细胞越过EB阶段直接分化生成为具有较长期自我 复制与更新能力的神经上皮细胞（Neuroepithelial cells, NE)的报导。本发明首次报导 了利用几种小分子直接诱导分化小鼠胚胎干细胞生成神经上皮细胞的快速有效方法，利用 本发明的方法生成的神经上皮细胞（NE)具有较长期的自我更新能力与自我复制的能力， 并类似神经干细胞，表达神经干细胞的标记物Nestin和Soxl，可进一步诱导NE定向分化为 多种神经细胞如神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞等，为临床应用提供了可能。
[0009] 本发明具体技术方案如下： 一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法，包括如下步骤： (1) 第一阶段：向贴壁培养的鼠胚胎干细胞团状克隆中加入含有dorsomorphin、 noggin、SB431542和CHIR99021的诱导培养基，连续培养若干天，一般为3-5天，细胞每天 换液，诱导鼠胚胎干细胞形成玫瑰花状神经球； (2) 第二阶段：消化并挑出第一阶段的神经球，加入含有bFGF的第二阶段诱导培养基 悬浮培养形成悬浮的神经球； (3) 第三阶段：将神经球消化成单细胞，然后用第三阶段诱导培养基贴壁培养形成具 有较长期的自我增殖与更新的神经上皮细胞。
[0010] 上述方法中的鼠胚胎干细胞团状克隆可以用常规方法制备得到，例如：首先，用基 质胶（BD)包被24孔板（Corning)。细胞计数后，将小鼠胚胎干细胞（mESCs，购买于上海 斯丹赛生物技术有限公司，品系Ml)以1x103/孔的数量种在细胞培养板上。每个孔加入 400 yl的培养基，并隔天换液。3-5天后细胞即长成团状克隆。
[0011] 上述方法中的第一阶段诱导培养基包含有DMEM/F12神经基础培养基、N2培 养基、B27 培养基、NEAA 和 0 -Mercaptoethanol，优选配方为：DMEM F12(Invitrogen)， lxN2(Invitrogen),lxB27(Invitrogen) , lx NEAA(Invitrogen),0. ImM^-Mercaptoet hanol(Invitrogen),lOOng/ml noggin(R&D Systems),20u M SB431542(Sigma),2u M dorsomophin (Sigma)，3 ii M CHIR99021 (Stemgent)。
[0012] 上述方法中的第二阶段诱导培养基包含有DMEM/F12神经基础培养基、N2培养 基、bFGF 和葡萄糖，优选配方为：DMEM F12，lx N2,20ng/ml bFGF(P印rotech)，1.6g/L glucose(Sigma)〇
[0013] 上述方法中的第三阶段诱导培养基包含有DMEM/F12神经基础培养基、N2培养基、 B27培养基、胰岛素、葡萄糖、bFGF和EGF，优选配方为DMEM F12，lxN2，liil/ml B27,20ug/ ml insulin(Wako Pure Chemical Industries), 1. 6g/L glucose(Sigma),20ng/ml bFGF, 20ng/ml EGF(R&D Systems)〇
[0014] 上述方法中，第一阶段向鼠胚胎干细胞团状克隆中加入各个因子的含量优选 0? 1 ?5iiM 的 dorsomorphin、100 ?500ng/ml(4. 35 ?21. 75nM)的 noggin、5 ?30iiM 的 SB431542 和 1 ?5iiM 的 CHIR99021，更优选的组合为：2iiM 的 dorsomorphin、100ng/ ml (4. 35nM)的 noggin、20 ii M 的 SB431542 和 3 ii M 的 CHIR99021。
[0015] 本发明还提供了一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞 的组合物，包括 dorsomorphin、noggin、SB431542 和 CHIR99021，优选 dorsomorphin、 noggin、SB431542 和 CHIR99021 的摩尔比为（100 ?5000) : (4. 35 ?21. 75) : (5000 ? 30000): (1000 ?5000)，（100ng/ml noggin (R&D Systems)，换成摩尔浓度是 4. 35nM)，更优 选摩尔比为 460:1:4598:690 (对应的浓度比为 2 ii M: 4. 35nM: 20 ii M: 3 ii M)。
[0016] 胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES cells)是从囊胚期内细胞团（inner cell mass，ICM)分离得到的，在体外具有无限或较长期的自我更新能力，并能在特定的 诱导条件下分化成外中内三胚层，并进一步分化为各种组织特异性细胞。大量研究表 明，0CT4、S0X2和NAN0G这三个转录因子对ES细胞基因转录具有关键性的调控作用，它 们通过结合靶基因调控区，选择性地抑制分化基因表达或促进多能性基因表达。它们通常 只在多能干细胞中表达，在分化细胞中不表达。在不同的发育阶段，它们的表达量受到特 异调控，并且分别与S 〇x-2、F〇xD3等其他转录因子以及1正、81^、《拉、1§卜0等胞外信号 通路互相作用，形成一个复杂的转录调节crosstalk网络，对保持ES细胞多潜能性和自 我更新发挥作用。目前，通过对LIF、BMP、wnt、Tgf-0等胞外信号通路的调控来诱导胚胎 干细胞分化的研究很多，有研究报导指出同时使用noggin, SB431542和dorsomorphin三种 小分子可以将小鼠外胚层胚胎干细胞（mouse embryonic epiblast stem cell)直接分化 为增殖2-3代的NE细胞（MJ Nejm，Nature Method, 2011)。由于外胚层胚胎干细胞与胚胎 干细胞的诱导分化存在差异，在本发明的研究中，实验结果表明使用noggin，SB431542和 dorsomorphin并不能直接将鼠ES细胞分化为神经上皮细胞，实验是失败的（图3)。
[0017] 本发明首次发现在ES形成神经球的阶段通过同时加入dorsomorphin、noggin、 SB431542和CHIR99021，可快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞，实验结 果表明，上述因子不仅抑制ES细胞的多条保持ES细胞的多能性信号通路，并且抑制ES细 胞向中胚层和内胚层的分化，从而高效率的将ES向外胚层进行定向分化从而生成神经上 皮细胞，使ES细胞向神经上皮细胞的分化效率几乎达到100%。
[0018] SB431542(4_[4_(3, 4-Methylenedioxyphenyl)_5_(2-pyridyl)-lH-imidazol-2-yl]-Benzamidehydrate)是TGF-0 1I型受体阻断剂，主要是通过抑制TGF-0 1激活素受体 样激酶 activin receptor-like kinases (ALKs)中的 ALK4、ALK5、ALK7 来抑制 TGF-beta/ Activin信号通路。
[0019]
【权利要求】
1. 一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法，其特征在于包括 如下步骤： (1) 第一阶段：向贴壁培养的鼠胚胎干细胞团状克隆中加入含有dorsomorphin与 noggin、SB431542和CHIR99021的诱导培养基，连续培养若干天，细胞每天换液，诱导鼠胚 胎干细胞形成玫瑰花状神经球； (2) 第二阶段：消化并挑出第一阶段的神经球，加入含有bFGF的第二阶段诱导培养基 悬浮培养形成悬浮的神经球； (3) 第三阶段：将神经球消化成单细胞，然后用第三阶段诱导培养基贴壁培养形成具 有较长期的自我增殖与更新的神经上皮细胞。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述第一阶段诱导培养基包含有DMEM/F12神 经基础培养基、N2培养基、B27培养基、NEAA和P-Mercaptoethanol ;第二阶段诱导培养基 包含有DMEM/F12神经基础培养基、N2培养基、bFGF和葡萄糖；第三阶段诱导培养基包含有 DMEM/F12神经基础培养基、N2培养基、B27培养基、胰岛素、葡萄糖、bFGF和EGF。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于第一阶段向鼠胚胎干细胞团状克隆中加入 0? 1 ?5 u M 的 dorsomorphin、100ng/ml ?500ng/ml (4. 35 ?21. 75nM)的 noggin、5 ?30 u M 的 SB431542 和 1 ?5 ii M 的 CHIR99021。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于第一阶段向鼠胚胎干细胞团状克隆中加 入 2uM 的 dorsomorphin、100ng/ml(4.35nM)的 noggin、20iiM 的 SB431542 和 3uM 的 CHIR99021。
5. -种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的组合物，包括 dorsomorphin、noggin、SB431542 和 CHIR"〇2l。 6?如权利要求5所述的组合物，其特征在于所述dorsomorphin、noggin、SB431542和 CHIR99021 的摩尔比为（100 ?5000) : (4. 35 ?21. 75) : (5000 ?30000) : (1000 ?5000)。
7. -种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化成神经元的方法，其特征在于采用如权利 要求1-4之一项所述方法制备得到神经上皮细胞，进行贴壁培养，加入向神经元分化的普 通诱导培养基或向中脑神经元分化的培养基，连续培养若干天，即得到普通神经元细胞或 者中脑神经元。
8. -种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化少突胶质前体细胞的方法，其特征在于采 用如权利要求1-4之一项所述方法制备得到神经上皮细胞，进行贴壁培养，加入0PC诱导培 养基，连续培养若干天，即得到少突胶质前体细胞，所述0PC诱导培养基包含有：DMEM/F12 神经基础培养基,N2培养基，不含维生素 A的B27培养基、Glutamax、bFGF、roGF-AA和SHH。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于0PC诱导培养基包含有DMEM F12，1XN2， lXB27,20iig/ml 胰岛素，1.6g/L 葡萄糖、20ng/ml bFGF 和 20ng/ml EGF。
10. -种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化少突胶质细胞或星形胶质细胞的方法， 其特征在于采用如权利要求7所述方法制备得到少突胶质前体细胞，进行贴壁培养，加入 少突胶质细胞诱导培养基或者星形胶质细胞诱导培养基，连续培养若干天，即得到少突胶 质细胞或星形胶质细胞。
【文档编号】C12N5/079GK104450618SQ201410199624
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年5月12日 优先权日:2014年5月12日
【发明者】卞菁, 郑娇 申请人:南通大学