实时pcr检测单核苷酸多态性的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种实时PCR检测单核苷酸多态性的方法，其中PCR中采用的聚合酶为具有瓣状核酸内切酶活性的聚合酶；采用的荧光探针的5’端修饰有第一荧光基团、3’端修饰第二荧光基团；且荧光探针具有与待测核酸单核苷酸多态性位点的碱基互补的对应碱基，该对应碱基沿5’往3’方向的下一个碱基上标记有淬灭基团；荧光探针的5’端至所述对应碱基的序列与待测核酸非互补。本发明的方法设计能够形成瓣状结构的荧光探针进行特异性的荧光标记，并结合具有瓣状核酸内切酶活性的聚合酶，据所实时PCR测得的荧光的强度，即可判断核酸样本中的目标核酸的SNP位点上的碱基的类型；可准确地区分SNP位点上的不同碱基，大大地提高了进行SNP检测的准确性。
【专利说明】实时PCR检测单核苷酸多态性的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种实时PCR检测单核苷酸多态性的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism, SNP),是由于在 DNA 序列中的单个核苷酸突变而导致的最终核酸序列多态；一般来说，一个SNP位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。SNP在人类基因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点，有些SNP位点还会影响基因的功能，导致生物性状改变甚至致病。
[0003]目前，少量SNP位点分析最常采用的方法为TaqMan探针法，也称实时PCR测定法。针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针，进行实时荧光PCR扩增。其中，探针的5’端和3’端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当PCR的聚合扩增过程结束后，探针与模板进行退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭基团分离，那么报告荧光基团的荧光信号被淬灭基团的抑制解除，从而可以检测到荧光信号增加。利用上述原理，那么在SNP检测中，使用分别与具有SNP的两个等位基因互补、且分别修饰有不同荧光基团的两个荧光探针进行PCR;根据最终测得的荧光信号的强度，便可得知核酸样品中的两个等位基因分别的含量。
[0004]但是，上述方法的准确度依赖于荧光探针与对应的等位基因之间的亲和程度的差另O，即其溶解温度(Tm)的差别。由于这种差别并不是很大，也就是说，所设计的荧光探针除了与对应的目标等位基因杂交之外，也有较大的几率与突变后的另一个等位基因杂交；因此，上述方法进行SNP检测往往导致最终的检测结果存在偏差。
【发明内容】
[0005]本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种不基于探针与目标核酸之间的亲和程度，而采用具有瓣状核酸内切酶活性的DNA聚合酶结合特异性设计的引物进行实时PCR实现单核苷酸多态性准确检测的方法。
[0006]为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下:
[0007]一种实时PCR检测单核苷酸多态性的方法，PCR过程中包括的聚合酶和荧光探针如下:
[0008]所述聚合酶为具有瓣状核酸内切酶活性的聚合酶；
[0009]所述荧光探针的5’端修饰有第一荧光基团、3’端修饰第二荧光基团；且所述荧光探针具有与待测核酸的未突变单核苷酸多态性位点的碱基互补的对应碱基，所述对应碱基沿5’往3’方向的下一个碱基上标记有淬灭基团；
[0010]所述荧光探针的5’端至所述对应碱基的序列与待测核酸非互补。
[0011]本发明的方法设计能够形成瓣状结构的荧光探针进行特异性的荧光标记，并结合具有瓣状核酸内切酶活性的聚合酶，据所实时PCR测得的荧光的强度，即可判断核酸样本中的目标核酸的SNP位点上的碱基的类型；可准确地区分SNP位点上的不同碱基，大大地提高了进行SNP检测的准确性。
[0012]本发明还提出上述实时PCR检测单核苷酸多态性的方法在CYP2C19基因多态性CYP2C19*2型位于第5外显子G681A(rs4244285)的多态性分析中的应用。
[0013]采用本发明的第5外显子G681A(rs4244285)的多态性检测结果中，分析结果采用特异性设计的引物和形成瓣状结构的荧光探针进行实时PCR，通过荧光结果逆向推导多态性的结果，更加精确。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中:
[0015]图1为本发明实施例荧光探针的示意图；
[0016]图2为本发明实施例荧光探针与待测核酸形成瓣状结构示意图；
[0017]图3为本发明单核苷酸多态性位点未突变的待测核酸与荧光探针结合后正向引物延伸的示意图；
[0018]图4为图3中的灭光探针被聚合酶到切后的残基不意图；
[0019]图5为图3所示PCR过程中荧光信号的检测结果；
[0020]图6为本发明单核苷酸多态性位点发生突变的待测核酸与荧光探针结合后正向引物延伸的不意图；
[0021]图7为图6中的突光探针被聚合酶到切后的残基不意图；
[0022]图8为图6所示PCR过程中荧光信号的检测结果；
[0023]图9为本发明实施例中待测核酸单核苷酸多态性位点50%突变后的PCR荧光检测结果。
[0024]图10为发明实施例1中CYP2C19*2型G681A (rs4244285) SNP位点的碱基均为胞嘧啶(C)时的荧光强度曲线；
[0025]图11为发明实施例1中CYP2C19*2型G681A(rs4244285) SNP位点的碱基均为腺嘌呤(A)时的荧光强度曲线；；
[0026]图12为发明实施例1中CYP2C19*2型G681A (rs4244285) SNP位点的碱基存在部分突变后包括腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)后SNP测定的荧光强度曲线。
【具体实施方式】
[0027]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0028]本发明实例提供了一种单核苷酸多态性的检测方法，相比本申请【背景技术】，本发明的基础方案步骤仍然采用实时PCR进行；与【背景技术】中的实时PCR检测方法不同的是:
[0029]聚合酶为具有瓣状核酸内切酶活性的聚合酶；
[0030]本发明采用的荧光探针，其结构模拟可以参见图1所示；荧光探针中具有与待测核酸的单核苷酸多态性位点未突变前的碱基互补的对应碱基10 (图1中X所表示)，荧光探针的5’端至该对应碱基10之间序列与待测核酸为非互补；且5’端修饰有第一荧光基团21、3’端修饰第二突光基团22,突光探针沿5’往3’方向位于对应碱基10的下一个碱基上标记有淬灭基团23。
[0031]在本发明上述实时PCR方法中实现单核苷酸多态性准确检测的核心在于上述荧光探针，现有技术中的荧光探针都是整体能与待测的核酸链互补杂交的寡聚核苷酸序列，而在本发明中荧光探针的5’端至单核苷酸多态性位点的对应碱基10之间的序列为非互补设计；那么在PCR过程中，本发明的荧光探针5’端至对应碱基10之间的序列与待测核酸链I不形成互补，而标记淬灭基团的碱基位至3’端之间的序列与待测核酸链I互补结合的瓣状结构(Flap结构)，如图2所示，或者更形象的描述是分叉DNA结构。
[0032]而进一步采用的聚合酶为针对上述瓣状结构采用的瓣状核酸内切酶活性的聚合酶；其中瓣状核酸内切酶活性是指聚合酶可以切除部分杂交的双链(即瓣状结构)上的5’端单链部分，而具体切除的位点在双链部分的第一个碱基和第二个碱基之间。
[0033]在采用本发明的上述聚合酶及荧光探针进行检测时，本发明采用具有瓣状核酸内切酶活性的聚合酶进行PCR过程，那么针对上述瓣状结构聚合酶在核酸复制过程中产生的变化如下:
[0034](I)当目标核酸的单核苷酸多态性位点，其未发生突变(那么以C碱基为例)，那么本发明的荧光探针在PCR过程中，从对应碱基(则对应C碱基为G碱基)本身与待测核酸的单核苷酸多态性位点互补结合，直至3’结束。在这一情形下，PCR扩增复制的过程中，以正向引物延伸过程为例，如图3所示:
[0035]正向引物30互补于目标核酸的3’端，进一步在聚合酶40的作用下向目标核酸的5’段延伸。由于聚合酶40具有瓣状核酸内切酶活性，当正向引物30被延伸至荧光探针与目标核酸结合的位点即对应碱基的位点时，突光探针上不与目标核酸互补的序列会首先被聚合酶40切除。
[0036]而根据上述瓣状核酸内切酶活性切除的位点在双链部分的第一个碱基和第二个碱基之间的特点，由于此时对应碱基与未发生突变的目标核酸的单核苷酸多态性位点互补结合；那么切除的位置在对应碱基与对应碱基5’往3’方向的下一个碱基(即本发明中标记淬灭基团的碱基)之间，即图3中A指示的位置；所以荧光探针的5’段至对应碱基会首先被切除，那么荧光探针5’端的第一荧光基团因为切除导致与淬灭基团分离，从而发出第一突光基团的第一突光信号。
[0037]而在上述过程之后，由于聚合酶40复制过程继续进行，那么荧光探针与目标核酸互补的区域继续依次被切除，那么紧接着在对应碱基之后被切除的下一个碱基为标记有淬灭基团的碱基；那么当这一碱基被切除后，荧光探针3’端标记的第二荧光基团也与淬灭基团分离，那么第二荧光基团的第二荧光信号产生，直至整个延伸过程结束。最终过程中第一荧光基团、淬灭基团、第二荧光基团先后被切除为相互分割的个体。具体，可以参见图4所
/Jn ο
[0038]分别设置荧光信号检测并记录其信号变化；其中为了方便检测和分析，采用发生荧光强度大致上相等但是信号类型不同的基团分别作为第一荧光基团和第二荧光基团，最终荧光信号检测结果如图5所示。第一荧光基团的荧光强度8与第二荧光基团的荧光强度9之比大致上相等，第一荧光基团的发光效率与第二荧光基团的发光效率之比相当。
[0039](2)当目标核酸的单核苷酸多态性位点，已经发生突变(以C碱基突变为T碱基为例)，那么本发明的荧光探针在PCR过程中，从对应碱基(对应C碱基为G碱基)本身不能与待测核酸的单核苷酸多态性位点(突变后为T碱基)互补结合，那么会从淬灭基团标记的碱基开始与目标核酸互补直至3’结束。在这一情形下，扩增复制的过程中，以正向引物延伸过程为例，如图6所示:
[0040]而根据上述瓣状核酸内切酶活性切除的位点在双链部分的第一个碱基和第二个碱基之间的特点，由于此时对应碱基不能与目标核酸的单核苷酸多态性位点互补结合；那么切除的位置在标记淬灭基团的碱基及标记淬灭基团的碱基的下一个碱基之间；如图6中B所指示的位置，所以荧光探针的5’段至标记淬灭基团的碱基会首先被切除。在这一切除过程中，5’端的第一荧光基团会与淬灭基团整体一段一次被切下，因此第一荧光基团仍然与淬灭基团没有分离；切除后的荧光探针的碎带可以简餐图7所示；因此第一荧光信号不会产生，仍然被抑制；而第二荧光基团则会因为淬灭基团被切除导致与淬灭基团分离，从而发出第二荧光基团的第二荧光信号，直至正向引物延伸过程结束。最终荧光信号检测结果如图8所示，测得的第一荧光的强度8与第二荧光的强度9相比，基本可忽略不计。
[0041](3)除去上述两种情形下，目标核酸样本中，有可能一些分子中的单核苷酸多态性位点未发生突变，而其中另一些分子发生了突变。
[0042]因此在这一情形下，假设突变的概率为50%，则目标核酸样本中一半的目标核酸SNP位点上的碱基为C，另一半的目标核酸的SNP位点上的碱基为T。SNP位点的碱基与荧光探针上的对应碱基互补类的目标核酸同时产生第一荧光和第二荧光，与情形(I)相同；而SNP位点的碱基不与荧光探针上的对应碱基互补的目标核酸只产生第二荧光则与情形(2)相同。由于两种目标核酸的含量均为50%，相等；因此依然选择；第一荧光基团与第二荧光基团的发光效率大致上相同的情况下，荧光检测结果参见图9，测得的所述第一荧光的强8约为所述第二突光的强度9的一半。
[0043]当然，在上述实施方式中，是以突变率为50%例进行的结果测量，其主要是为了反映出最终的荧光变化的结果情况，在实际中可能突变率并非为50%，而是其它的概率值，那么可以建立数学函数，根据测得的荧光变化结果进行函数求解，便可以得出单核苷酸多态性的情况。
[0044]并且，上述实施方式中具体描述为正向引物延伸的过程中导致荧光信号产生的差异的情形，而根据DNA复制过程中均为5’往3’方向，反向引物延伸过程中的荧光探针被聚合酶剪切的过程与正向引物类似，因此，本领域技术人员可以根据以上描述简单推导，即可得出，在此不再赘述。
[0045]因此，从上述荧光检测情况中，可以得知单核苷酸多态性的情况与最终检测的荧光变化之间存在对应的关系，所以可以根据最终检测到的第一荧光信号和第二荧光信号的结果，从而分析得出目标核酸单核苷酸多态性的情况。当然上述实施方式中，为了方便这两种荧光信号量的检测对比，将两种荧光基团选为两种荧光强度相似但类型不同的荧光基团，则可以同时针对两种信号进行检测，结果的清晰度和准确定以及避免相互干扰的情形会使结果准确。当然，如果这两种荧光信号基团选择为同一种时，荧光变化量在精确监控下也可以尝试；因为在实施过程中，对应碱基和下一个标记有淬灭基团的碱基逐个被切除时，之间的信号会有重叠，根据重叠的荧光图谱进行拆分，也可以分别获取第一荧光基团和第二荧光基团的变化，只是这一方式不如接采用两种荧光基团标记分别进行检测更加准确和简单。同时，两种荧光基团的荧光强度也可以换成其他差别较大的类型，只是在最终的结果分析时，则在判定检测结果时需考虑这种差别。
[0046]在本发明上述实施过程中，出于测量效果和准确度的考虑，其中上述第一荧光基团，可以采用荧光素(FAM)，而第二荧光基团采用VIC、HEX等对应；淬灭基团选为Black
Hole Quencher?-1 (BHQ)。当然在实施过程中，上述第一荧光基团和第二荧光基团的选择还可以从ROX、HEX、TMR、TET等等中进行选择，那么在结果分析中需要考量荧光的发光效率的影响。
[0047]从上述可以看出，本发明聚合酶切割瓣状结构时的位置在于瓣状结构的双链部分的第一个碱基和第二个碱基之间，设计能够形成瓣状结构的荧光探针，并进行特异性的荧光标记，据所实时PCR测得的荧光的强度，即可判断核酸样本中的目标核酸的SNP位点上的碱基的类型。相比现有检测方法，不是基于探针与目标核酸之间的溶解温度，因此本发明的方法可准确地区分SNP位点上的不同碱基，大大地提高了利用实时PCR进行SNP检测的准确性。
[0048]为了使本发明上述实施方式中的技术方案更加清楚和易于理解，并能凸显出本发明方法的效果，以下通过实施例对本发明的方法进行举例解释。
[0049]实施例1
[0050]在该实施例1 以CYP2C19基因多态性CYP2C19*2型位于第5外显子G681A(rs4244285)的多态性分析进行。
[0051]目标核酸:
[0052]5，-TAACATTTTACCTTCTCCATTTTGATCAGGAAGCAATCAATAAAGTCCCGAGGGTTGTTGATGTCCATCGATTCTTGGTGTTCTTTTACTTTCTCCAAAATATCACTTTCCATAAAAGCAAGGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCCGGGAAATAATCAATGATAGTGGGAAAATTATTGCATATCTAAGAGAAAACAATAATTTATTAAATTAAAAGCATTTAATAAAGGTATAGATACAATATGCCAAGCTCTGGTTGTAATTTAAAACTATAAATATAAATAAAATATATTGTA-3’
[0053]并采用以下特异性设计的引物和探针进行PCR扩增:
[0054]上游引物:5’ -CTTAGATATGCAATAATTTTCCCAC-3 ’
[0055]下游引物:5’ -CCAAAATATCACTTTCCATAAAAGC-3 ’
[0056]荧光探针:FAM-GAGAGAGG(*BHQ1)GAACCCATAACAAATTAC-VIC，该荧光探针的5’ 端标记FAM荧光基团，3’段标记VIC荧光基团；对应第5外显子G681A(rs4244285)的单核苷酸多态性位点对应碱基下一个碱基上标记BHQl淬灭基团；且荧光探针的5’端至对应碱基的位置与目标核酸非互补，而从标记淬灭基团的碱基直至3’与第5外显子G681A(rs4244285)的单核苷酸多态性位点C碱基之后的序列为互补。
[0057]采用上述物料，然后进行实时PCR ;当然在实时PCR过程中，还需要进一步添加脱氧核糖核苷三磷酸作为原料、以及实时聚合酶链式反应的其它试剂(如缓冲剂等等)，以及本发明中具有瓣状核酸内切酶活性的DNA聚合酶为Taq酶，然后采用标准扩增体系进行实时PCR，并检测PCR过程中的荧光图谱。
[0058]图10为发明实施例1中CYP2C19*2型G681A (rs4244285) SNP位点的碱基均为胞嘧啶(C)时检测的荧光强度曲线；
[0059]图11为发明实施例1中CYP2C19*2型G681A(rs4244285) SNP位点的碱基均为腺嘌呤(A)时的荧光强度曲线；；
[0060]图12为发明实施例1中CYP2C19*2型G681A (rs4244285) SNP位点的碱基存在部分突变后包括腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)后SNP测定的荧光强度曲线。
[0061]并且从上述图12的荧光图谱中可以看出，两种荧光信号强度的图形呈类似于上述第三种情形的变化，由于两种荧光强度的比值与突变率有关，根据这一结果便可以通过函数进行分析；从而得到最终单核苷酸多态性结果。
[0062] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种实时PCR检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于，PCR过程中包括的聚合酶和荧光探针如下: 所述聚合酶为具有瓣状核酸内切酶活性的聚合酶； 所述荧光探针的5’端修饰有第一荧光基团、3’端修饰第二荧光基团；且所述荧光探针具有与待测核酸中单核苷酸多态性位点的碱基互补的对应碱基，所述对应碱基沿5’往3’方向的下一个碱基上标记有淬灭基团； 所述荧光探针的5’端至所述对应碱基的序列与待测核酸非互补。
2.如权利要求1所述的实时PCR检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述第一荧光基团与第二荧光基团的荧光类型不同。
3.如权利要求1或2所述的实时PCR检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述第一荧光基团为FAM。
4.如权利要求1或2所述的实时PCR检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述第二荧光基团为VIC或HEX。
5.如权利要求1或2所述的实时PCR检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述淬灭基团为BHQ。
6.如权利要求1至5任一项所述的实时PCR检测单核苷酸多态性的方法在CYP2C19*2型位于第5外显子G681A(rs4244285)的多态性分析中的应用。
7.如权利要求6所述的实时PCR检测单核苷酸多态性的方法在CYP2C19*2型位于第5外显子G681A(rs4244285)的多态性分析中的应用，其特征在于，所述荧光探针为FAM-GAGAGAGG(*BHQ)GAACCCATAACAAATTAC-VIC。
8.如权利要求6或7所述的实时PCR检测单核苷酸多态性的方法在CYP2C19*2型位于第5外显子G681A(rs4244285)的多态性分析中的应用，其特征在于， 所述上游引物为 5’ -CTTAGATATGCAATAATTTTCCCAC-3’ ；
所述下游引物为 5’ -CCAAAATATCACTTTCCATAAAAGC-3’。
【文档编号】C12Q1/68GK104164506SQ201410397469
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】罗晓腾, 郭永超, 廖玉声 申请人:深圳联合医学科技有限公司